1.一种心肌细胞分离方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,将新鲜离体的心脏放入4℃预冷的保护液中,剪取心室肌组织,并用冲洗液洗净,再将心室肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块,然后于冲洗液中浸泡3-5min,过滤,得到心肌组织样品,备用;
每升所述保护液含有以下组分:8g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的Na2HPO4·H2O、0.06g的KH2PO4、0.35g的NaHCO3,溶剂为双蒸水;
每升冲洗液中含有以下组分:9g的NaCl、0.3g的KCl,溶剂为双蒸水;
步骤2,将心肌组织样品置于1g/L的胰蛋白酶溶液中,37℃消化5-8min,弃去上清液,得到第一次沉淀物;
步骤3,将第一次沉淀物置于高浓度缓冲液中浸泡3-5min,过滤,收集第二次上清液和第二次沉淀物;每升高浓度缓冲液中含有以下组分:8.5g的NaCl、0.25g的KCl,溶剂为双蒸水;
步骤4,将第二次沉淀物置于消化液中,然后用NaOH调节pH至7-7.5,37℃消化5-8min,过滤,收集第三次上清液和第三次沉淀物;
步骤5,将第三次沉淀物置于低浓度缓冲液中浸泡3-5min,得到细胞混合物;每升低浓度缓冲液中含有以下组分:6g的NaCl、0.2g的KCl,2-4mg的L-谷氨酸、2-4mg的甘氨酸、1-2g的葡萄糖,溶剂为双蒸水;
步骤6,将第二次上清液、第三次上清液和细胞混合物混合均匀,并用吸管吹打,然后过滤掉心肌组织沉淀物,收集滤液并离心,得到分离后的心肌细胞沉淀。
2.根据权利要求1所述的心肌细胞分离方法,其特征在于,步骤6还包括:用吸管吹打后,加入胎牛血清。
3.根据权利要求2所述的心肌细胞分离方法,其特征在于,步骤6中,胎牛血清的添加量为:胎牛血清与所述细胞混合物的质量比例为5~10:100。
4.根据权利要求1所述的心肌细胞分离方法,其特征在于,步骤5中,每升低浓度缓冲液中含有以下组分:6g的NaCl、0.2g的KCl,2mg的L-谷氨酸、2mg的甘氨酸、2g的葡萄糖,溶剂为双蒸水。
5.根据权利要求1所述的心肌细胞分离方法,其特征在于,步骤5还包括调节pH步骤,具体为:先用0.01mol/L的HCl调节低浓度缓冲液的pH至6.0-6.5,然后加入第三次沉淀物浸泡。
6.根据权利要求1所述的心肌细胞分离方法,其特征在于,步骤6中,滤液离心的条件为:10000r/min,4℃,离心10min。