脂肪间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于干细胞与生物【技术领域】，涉及脂肪间充质干细胞的新应用。首先本发明提供了一种构建携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞的方法。另外，本发明了还公开了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞用途。携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂的应用。利用本发明所述的携带miR-122的AMSC制备化疗增敏剂，并与临床常规化疗药物联合应用于肝癌荷瘤小鼠模型的化疗，可显著提高异位或原位肿瘤组织对化疗药物的敏感性，而增强化疗效果，阻滞肝癌进展。并可降低化疗药物的使用剂量，减轻化疗副反应。本发明为制备新型的肝癌化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。
【专利说明】脂肪间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞与生物【技术领域】，涉及间充质干细胞的新应用，具体涉及携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法及其在制备肝癌化疗增敏制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在全球恶性肿瘤死亡率中排第三位。而在我国，肝癌死亡率仅次于胃癌，居我国恶性肿瘤死亡率第二位。据统计，我国每年肝癌死亡人数约11万，是全球肝癌发病率、死亡率最高的国家。化疗是目前肿瘤治疗的主要手段之一，已在乳腺癌、前列腺癌等的治疗中显示出积极意义。但肝癌化疗敏感性差，自上世纪50年代以来，肝癌的系统化疗进展不大，单药治疗有效率通常不高于20%，且毒副作用大，可重复性差。过去10年中仅发现有I种激酶抑制剂型化疗药物索拉非尼(sorafenib)对肝癌治疗有所帮助。因此探索新型的化疗增敏手段，提高肝癌的化疗敏感性，对于肝癌的治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是通过构建携带miR-122的AMSC，并联合应用于肝癌荷瘤小鼠模型的化疗方案，达到增强化疗效果的作用，从而为制备新型的肝癌化疗靶向增敏剂提供技术平台，为肝癌的系统化疗提供新方法。
[0004]首先本发明提供了一种构建携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的方法。
[0005]一种构建携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的方法，包括如下步骤:`
[0006]I)脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备:脂肪组织经DPBS清洗后，用I型胶原酶37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
[0007]2)所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)是按以下方法制备的:miR-122 表达质粒(pGCMV/EGFP/miR-122/Blasticidine)通过电转法导入 AMSC，以EGFP指示转染效率(转染效率约70%)，以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4_6周后可获得稳定表达miR-122的 AMSC-miR-122ο
[0008]进一步的，所述脂肪组织为成人脂肪组织，所述miR-122为has-miR-122(has-miR-122 序列为:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)。
[0009]所述方法得到的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞，具有间充质干细胞的基本特性。[0010]所述方法得到的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞，可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。其中，所述肝癌细胞为HepG2细胞。
[0011]另外，本发明了还公开了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞用途。
[0012]携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂的应用。(优选为携带miR-122的人脂肪来源的间充质干细胞)
[0013]所述肝癌化疗增敏制剂可提高异位肝癌和原位肝癌对肝癌化疗药物的敏感性。
[0014]所述肝癌化疗药物为Sorafenib、5_FU 或 Doxorubicin。
[0015]所属制剂的剂型为注射剂。
[0016]下面对本发明做进一步的描述。
[0017]本发明公开了一种构建携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)的方法，包括如下步骤:
[0018]I)脂肪来源的间 充质干细胞(AMSC)的制备:人脂肪组织(为吸脂手术采集的成人脂肪组织或通过保存液保存的手术废弃的脂肪组织)经DPBS清洗后，用I型胶原酶37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
[0019]2)所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)是按以下方法制备的:has_miR-122 表达质粒(pGCMV/EGFP/has-miR-122/Blasticidine)通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，转染效率约70%。以转染无关has-miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选。筛选4_6周后可获得稳定表达 miR-122 的 AMSC-miR-122。
[0020]3)所诉的 hsa-miR-122 序列为:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。
[0021]所述的携带has-miR-122的AMSC采用荧光定量PCR鉴定miR-122的表达:消化收集细胞后，采用Life technology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA，并采用广州锐博生物的miRQ0000421-l-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。PCR体系为:SYBR_10ul ；miR-122 上游引物-2ul ;miR_122 下游引物 _2ul ；R0X2-0.4ul ;水_1.6111 ;模板 _4ul ;PCR条件为:95°C预变性30s，然后95°C 5s,60°C 30s,40个循环。
[0022]本发明了还公开了携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏剂中的应用，从而为肝癌的系统化疗提供新方法。
[0023]本发明公开了一种AMSC-miR-122在体外提高肝癌细胞化疗敏感性的应用。
[0024]所述的肝癌细胞为H印G2细胞。
[0025]所述的应用为，AMSC-miR-122以 transwell 板(FALCON 公司，353090)与 H印G2细胞共培养3天，胰酶消化收集肝癌细胞后接种于细胞培养板，给予梯度浓度的肝癌常规化疗药物48小时后，进行肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估，以未与AMSC-miR-122共培养(单独培养)的HepG2作为对照。本发明所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)在体外与HepG2肝癌细胞共培养后，能显著提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性，具体表现为肝癌化疗药物对与AMSC-miR-122共培养后的肝癌细胞增殖抑制和促凋亡作用都明显增强。[0026]所述的肝癌细胞增殖和细胞凋亡的评估分别采用细胞芯片法和流式Annexin V/PI凋亡检测。
[0027]所述的细胞芯片法，步骤如下:
[0028]1.胰酶消化收集共培养3天的H印G2肝癌细胞，及单独培养的H印G2细胞，按5000/孔，接种于96孔细胞芯片板(型号DC96-A-NT)；
[0029]2.培养24小时后，再分别给予梯度浓度的Sorafenib, Doxorubicin和5-FU ；
[0030]3.继续培养48小时，采用细胞芯片仪(ACEA Biosciences, Inc)进行肝癌细胞增殖的实时评估。
[0031]所述的流式Annexin V/PI凋亡检测,步骤如下:
[0032]1.胰酶消化收集共培养3天的H印G2肝癌细胞，及单独培养的H印G2细胞，按5 X IO5/孔，接种于6孔细胞培养板；
[0033]2.培养24小时后，再分别给予IC5tl浓度的Sorafenib, Doxorubicin和5-FU ；
[0034]3.继续培养48小时后，胰酶消化收集细胞，调整细胞数为2-5X IO5/样本。采用BD公司的Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(货号:556547),按试剂盒说明书进行流式标记；
[0035]4.突光标记后采用BD流式细胞仪(Accuri C6)进行凋亡检测分析；
[0036]所述的Annexin V/PI凋亡结果分析为:在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为FITC-/P1-;左上象限是坏死细胞，为FITC-/PI+ ;而右下和右上象限分别为早期凋亡和晚期细胞，为FITC`+/P1-和FITC+/PI+。
[0037]本发明还公开了一种AMSC-miR-122在提高肝癌荷瘤裸鼠模型化疗药物敏感性中的应用。
[0038]所述的肝癌荷瘤裸鼠模型是通过以下方法建立的:裸鼠腋窝皮下或肝脏原位接种IX IO6标记了 Iuciferase的肝癌细胞，以分别建立肝癌异位荷瘤模型和肝癌原位荷瘤模型。每周通过测量肿瘤体积或小动物活体成像技术实时检测Iuciferase的生物发光信号，连续5-6周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
[0039]所述的AMSC-miR-122由DPBS稀释，针对肝癌异位荷瘤模型，AMSC-miR-122采用瘤内注射和尾静脉输注两种方式；针对肝癌原位荷瘤模型，AMSC-miR-122于采用尾静脉输注方式。
[0040]所述的AMSC-miR-122 瘤内注射方式为，AMSC-miR-122 由 DPBS 稀释为 I X 108/mL的浓度，瘤内注射有效剂量为I-2X IO6/次，输注时间为肝癌细胞接种后I周，3周。
[0041]所述的AMSC-miR-122尾静脉输注方式为，AMSC-miR-122由DPBS稀释为IX IO7/HiL的浓度，尾静脉输注的有效剂量为2X IO6/只，输注时间为肝癌细胞腋下接种后I周、3周或肝脏原位接种后3天、17天。
[0042]所述的化疗药物为肝癌常规化疗药物，如Sorafenib、5_FU、Doxorubicin,Sorafenib的给药剂量为30mg/kg,5_FU的给药剂量为30mg/kg, Doxorubicin的给药剂量为2mg/kg，均采用腹腔注射。
[0043]所述的肿瘤体积计算公式为，V (mm3) =aX (b2/2) ;a=肿瘤长径，b=肿瘤短径。
[0044]所述的小动物活体成像检测方法为:裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-1uciferin(Iuciferase的底物)，10-15分钟时采用小动物活体成像仪(LBLS-579)进行Iuciferase生物发光信号的实时检测。[0045]将本发明所述的AMSC-miR-122用于提高肝癌化疗敏感性的效果评价:
[0046]( I)肿瘤体积和重量测量；
[0047](2)肝癌细胞Iuciferase的生物发光信号检测；
[0048](3 )血清中AFP水平检测；
[0049](4)肝癌组织HE病理及TUNEL分析；
[0050](5 )裸鼠体重及状态监测。
[0051]由于肝癌化疗敏感性差，因此探索可提高其化疗敏感性的增敏手段对于其治疗具有积极意义。最近，miRNA与肝癌的关系日益受到关注。已有多项研究发现，在肿瘤组织中存在多种miRNAs的表达失调，这些miRNA通过对细胞恶性表型相关基因的表达调控而参与肿瘤的发生发展。miR-122作为正常肝脏中表达丰度最高的miRNA，其在肝炎-肝硬化-肝癌进展中呈进行性表达下调，在肝癌组织中，miR-122表达最低。近年来，miR-122与肝癌化疗敏感性的关系备受关注。体外细胞学水平的研究显示，在肝癌细胞中导入miR-122可显著提高其对化疗药物的敏感性。miR-122/Cyclin Gl通过对p53基因(p53是目前已知的与化疗敏感性关联最高 的基因之一)的调控而增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性。
[0052]但如何选择合适的载体输送miR-122至肝脏肿瘤部位仍是影响其功效的关键环节。间充质干细胞(MSCs)作为一类新型的基因治疗运载系统具有高效、安全、肿瘤靶向性等诸多优点。成体脂肪组织来源的MSC(AMSC)作为一类可重复获取、供者不适度低的干细胞在临床上具有更高的应用价值。
[0053]利用本发明所述的携带miR-122的AMSC制备化疗增敏剂，并与临床常规化疗药物联合应用于肝癌荷瘤小鼠模型的化疗，可显著提高异位或原位肿瘤组织对化疗药物的敏感性，而增强化疗效果，阻滞肝癌进展。并可降低化疗药物的使用剂量，减轻化疗副反应。本发明为制备新型的肝癌化疗靶向增敏剂提供了技术支持，并为肝癌的系统化疗提供了新方法。
[0054]本发明所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积(w/ν)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]图1 为 AMSC-miR-122 中的 miR-122 表达 PCR 分析图。
[0056]图2为AMSC-miR-122在体外增强!fepG2细胞对Sorafenib敏感性的Annexin V/PI凋亡分析结果图。
[0057]图3为肝癌异位荷瘤模型的肿瘤体积检测图，其中横坐标O代表给药起始时间。
[0058]图4为肝癌异位荷瘤模型实验终点的小动物活体成像检测图；其中组I的Iuciferase生物发光信号最强，其次为组2和组5，组3和组4的生物发光信号最弱。
[0059]图5为肝癌异位荷瘤模型的裸鼠体重变化图，其中横坐标O代表给药起始时间。
[0060]图6为肝癌原位荷瘤模型的小动物活体成像数据图，其中横坐标O代表给药起始时间。
[0061]图7为肝癌原位荷瘤模型的裸鼠体重变化图，其中横坐标O代表给药起始时间。【具体实施方式】
[0062]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0063]下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为市场购得。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。
[0064]所述百分比浓度若无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
[0065]实施例一:携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞(AMSC-miR-122)在肝癌异位荷瘤模型化疗增敏中的应用。
[0066]1、脂肪间充质干细胞(AMSC)的制备:
[0067]吸脂手术采集的成人脂肪组织经DPBS清洗后，用0.075%的I型胶原酶(Sigma)37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)的塑料培养瓶内，24小时后全量换液，除去血细胞,贴壁细胞视生长情况2-3天半量换液，增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代数次，达到纯化和扩增AMSC的目的，收集细胞冻存、复苏备用。
[0068]2、AMSC-miR-122 的构建:
[0069]hsa-miR-122 表达质粒(pGCMV/EGFP/hsa_miR-l22/Blasticidine)(上海吉玛生物)通过Lipofectamine?2000介导转染AMSC，以60_mm小培养皿为例:AMSC接种至60_mm小培养皿，采用无青链霉素的A`MSC培养液培养过夜，待细胞密度至80%左右，换为5ml的Opt1-MEM ;同时用0.5ml的Opt1-MEM稀释8 μ g的hsa-miR-122表达质粒；并在另0.5ml的Opt1-MEM中加入20 μ I Lipofectamine?2000 ;室温静置5分钟后，把稀释后的质粒和Lipofectamine?2000进行混合，再室温静置20分钟后加入细胞培养皿中；培养4_6小时后换为无青链霉素的AMSC完全培养液(L-DMEM+5%FBS)。
[0070]根据hsa-miR-122表达质粒所带的EGFP基因指示转染效率，荧光显微镜下观察，转染效率可达70%左右。以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选培养，筛选4_6周后可获得稳定表达miR-122的AMSC-miR-122 细胞。
[0071]采用荧光定量PCR法鉴定AMSC中miR-122的表达:
[0072]消化收集细胞后，采用Life technology公司的AM1561试剂盒抽提miRNA,并采用广州锐博生物的miRQ0000421-l-2试剂盒进行逆转录，及荧光定量PCR的分析。
[0073]PCR 体系为:SYBR-10ul ;miR_122 上游引物 _2 μ I ；miR-122 下游引物 _2 μ I ;R0X2-0.4 μ I ;水-1.6 μ I ;模板-4 μ I。PCR 条件为:95 V 预变性 30s，然后 95 °C 5s，60°C 30s, 40 个循环。
[0074]PCR结果分析:转染miR-122的AMSC，其miR-122的表达水平明显高于对照组(图O
[0075]采用流式细胞术鉴定AMSC-miR-122的间充质干细胞特性，其细胞表型为⑶29 (+)，CD31 (-)，CD44 (+)，CD45 (-)，CD73 (+)，CD90 (+)，CD105 (+)，HLA-DR (-);细胞周期以G0/G1期为主(> 95%)，符合AMSC的干细胞特性标志，与未转染miR-122的普通AMSC和AMSC-miR-NC (转染无关miRNA的AMSC)的细胞表型和周期均类似。
[0076]采用体外诱导分化鉴定AMSC-miR-122的多系分化潜能:分别采用成脂、成骨、成软骨诱导培养基进行诱导培养，每3天半量更换诱导培养基，诱导培养3周后，分别进行油红O (成脂)，茜素红(成骨)，阿辛蓝(成软骨)的染色，证实携带miR-122的AMSC仍具有多系分化潜能。
[0077]3、肝癌异位荷瘤模型的建立:
[0078]HepG2肝癌细胞通过转染带Iuciferase基因的慢病毒质粒(和元生物技术有限公司)，并经抗性筛选，而得到稳定表达Iuciferase的HepG2肝癌细胞(HepG2_luci )。5周龄裸鼠腋窝皮下接种IXlO6的!fepG2-luci肝癌细胞，每周通过测量肿瘤体积及小动物活体成像技术实时检测Iuciferase的生物发光信号，连续6周，确认肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
[0079]4、AMSC-miR-122输注:AMSC_miR-122由DPBS稀释，采用瘤内注射和尾静脉输注两种方式；
[0080]所述的AMSC-miR-122 瘤内注射方式为，AMSC-miR-122 由 DPBS 稀释为 I X 108/mL的浓度，瘤内注射有效剂量为I~2X IO6/次，输注时间为肝癌细胞接种后I周，3周。
[0081]所述的AMSC-miR-122尾静脉输注方式为，AMSC-miR-122由DPBS稀释为IXlOVmL的浓度，尾静脉输注的有效剂量为2X106/只，输注时间为肝癌细胞腋下接种后I周，3周。
[0082]5、肝癌异位荷瘤模型的化疗:
[0083]所述的化疗药物为肝癌常规化疗药物Sorafenib (LC Laboratories)；
[0084]Sorafenib 的配制为，米用 1:1 体积的纯乙醇与 cremophor EL (Sigma-Aldrich)助溶后，再用DPBS稀释到5mg/ml ;其给药剂量为30mg/kg或90mg/kg ;于肝癌细胞腋下接种后2周开始给药，给药周期为，用药5天，停药2天，持续4周；给药方式采用腹腔注射。
[0085]6、肝癌异位荷瘤模型的治疗分组:
[0086]组1:模型对照组(输注同等体积的Sorafenib溶剂)；
[0087]组2:Sorafenib 低剂量治疗组(30mg/kg/ 天)；
[0088]组3:Sorafenib 高剂量治疗组(90mg/kg/ 天)；
[0089]组4:低剂量 Sorafenib+AMSC-miR-122 瘤内注射组；
[0090]组5:低剂量 Sorafenib+AMSC-miR-122 尾静脉输注组。
[0091]7、效果评价:
[0092](I)肿瘤体积和重量测量:每周2次，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，并按公式计算肿瘤体积:V(mm3)=aX (b2/2);如图3所示，组4的肿瘤增殖明显低于组I和组2，与组3的肿瘤进展情况类似；组5的肿瘤增殖也要低于组I和组2，但比组3和组4要高。化疗终点，吸入性麻醉法处死裸鼠后，剥离其肿瘤组织称重，并计数其肿瘤抑制率(表I)。显示AMSC-miR-122输注可显著提高肝癌组织对Sorafenib的敏感性,使得低剂量的Sorafenib也可达到高剂量Sorafenib的肝癌抑制效果。
[0093]
【权利要求】
1.携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞的构建方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)脂肪来源的间充质干细胞的制备:脂肪组织经DPBS清洗后，用I型胶原酶37°C消化I小时，然后室温离心后弃去上层油脂和液体，细胞沉淀以DPBS重悬洗涤2遍后离心收集细胞，接种在含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基的培养瓶内，细胞贴壁增殖接近80%融合时，进行消化、传代，依此法传代2-4次，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集细胞冻存、复办备用； 2)携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞的制备:miR_122表达质粒通过电转法导入AMSC，以EGFP指示转染效率，以转染无关miRNA的表达质粒作为对照，以表达质粒所带的Blasticidine抗性基因进行筛选，筛选4_6周后可获得稳定表达miR-122的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于:所述脂肪组织为成人脂肪组织，所述miR-122 为 has-miR-122。
3.根据权利要求1或2所述方法得到的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于:具有间充质干细胞的基本特性。
4.根据权利要求1或2所述方法得到的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于:可提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性。
5.根据权利要求4所述的携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于:所述肝癌细胞为H印G2细胞。
6.携带miR-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝癌化疗增敏制剂的应用。
7.根据权利要求6所述的 应用，其特征在于:所述肝癌化疗增敏制剂可提高异位肝癌和原位肝癌对肝癌化疗药物的敏感性。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于:所述肝癌化疗药物为Sorafenib、5-FU或Doxorubicin。
9.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所属制剂的剂型为注射剂。
【文档编号】C12N5/0775GK103451152SQ201310390755
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】刘艳宁, 楼国华, 陈智 申请人:浙江大学