本发明涉及医学研究开发技术领域，尤其涉及一种离体氧糖剥夺模型的建立方法。
背景技术：
自噬是细胞受到刺激后，通过溶酶体途径降解细胞内物质的基本稳态过程。自噬允许细胞成分的有序退化和回收利用。自噬过程是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜或高尔基体膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器更新的过程。自噬通常有三种不同形式：巨自噬，微自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬可以通过能量缺乏，如葡萄糖耗尽，和其他多样刺激如缺氧，活性氧，和变性或聚集蛋白来诱导。脑约占全身重量的约2％，但消耗在体内产生的能量的15％。脑没有备用能量源如磷酸肌酸，并且除了在星形胶质细胞的少量糖原外没有能量存储。因此脑细胞对能量消耗更为敏感。自噬失调可能会导致错误的动态平衡和神经退行性病变。因此，建立一个离体神经细胞氧糖剥夺模型对于研究开发治疗神经退行性疾病如老年性痴呆有重要意义。现有离体神经细胞氧糖剥夺模型的建立方法无法精确、快速、有效地模拟细胞应激、细胞自噬及脑缺血缺氧休克等病理状态，且离体神经细胞氧糖剥夺模型的建立方法中的离体细胞达到氧耗竭目标的难度大。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了离体氧糖剥夺模型的建立方法。
本发明提出的离体氧糖剥夺模型的建立方法，包括以下步骤：
S1：首先设置雌雄小鼠进行配对，在雌雄小鼠交配成功后，再将雌雄小鼠进行分离；
S2：在雌性小鼠怀孕13-15天时，雌性小鼠在用多聚赖氨酸涂层培养板上进行过夜；
S3：在用多聚赖氨酸涂层培养板上11-13h后，移除多聚赖氨酸，然后雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板上；
S4：雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板2-4h后，移除层粘连蛋白后，用消毒蒸馏水对培养板进行冲洗；
S5：雌性小鼠在怀孕15-17天时,从雌性小鼠中剖析出胚胎子宫，并将剖析出胚胎子宫置入盛有冰冻的L-15液体的培养板中；
S6：通过超镜台可以从胚胎子宫中取出胚胎，再通过超镜台从胚胎中移出脑，此时可以收集大脑皮层，并将收集的大脑皮层置入盛有冰冻的L-15液体的培养板中；
S7：使用刀片对冰冻的L-15液体中的大脑皮层进行切段，将切段后的大脑皮层置入15ml的离心管中；
S8：离心管中的切段大脑皮层在1400RPM-1600RPM的条件下进行第一次离心，且离心2-4m；
S9：在第一次离心后的离心管中滴入用2-4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，再将离心管的溶液置入37度孵箱混匀4-5m，经蛋白酶消化后加入2-4ml的抑制剂溶液终止反应；
S10：离心管中的溶液在1400RPM-1600RPM的条件下进行第二次离心，且离心2-4m；
S11：在第二次离心后的离心管中滴入用2-4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，混匀细胞悬液，然后使用细胞过滤器对细胞悬液中的细胞进行过滤，并对细胞溶液中的细胞进行计数；
S12：细胞计数后，将细胞移植到培养板上，细胞移植到培养板71-73h后，加入4-6uM的Ara-C；
S13：细胞在培养板上培养五-七天时，对培养板中的40％-60％的培养液进行更换；
S14：小鼠原代大脑皮层神经元细胞在培养板上培养8-10天时，可以对小鼠原代大脑皮层神经元细胞进行氧糖剥夺；
S15：将进行实验的小鼠原代大脑皮层神经元细胞分为氧糖剥夺组和正常组；
S16：对于氧糖剥夺组，使用真空抽干机吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体1-2h，对于正常组，不需抽吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体，并向无葡萄糖Early’s盐溶液中加入葡萄糖；
S17：用含葡萄糖的Early’s盐溶液替换正常组中的培养液，氧糖剥夺组在正常组使用含葡萄糖的Early’s盐溶液作为培养液的50-70m后，氧糖剥夺组中的小鼠原代大脑皮层神经元细胞置入厌氧模块化培养室4-6m，然后继续放入培养箱中孵育4-12h。
优选地，所述厌氧模块化培养室内部通入加湿的95％的氮气体和2/5％一氧化碳气体。
优选地，所述步骤S1到步骤S13共同完成了小鼠原代大脑皮层神经元的培养。
优选地，所述步骤S14到步骤S17共同完成了氧糖剥夺的建立。
本发明的有益效果：
1、通过步骤S1到步骤S13，离体氧糖剥夺模型的建立方法可以精确、快速、有效地模拟细胞应激病理状态；
2、通过步骤S14到步骤S17，离体氧糖剥夺模型的建立方法可以精确、快速、有效地模拟细胞自噬及脑缺血缺氧休克病理状态；
3、通过将氧糖剥夺组中的小鼠原代大脑皮层神经元细胞置入厌氧模块化培养室，使得氧糖剥夺组中的小鼠原代大脑皮层神经元细胞十分容易达到氧耗竭的目标；
本发明能够精确，快速，有效地模拟细胞应激，细胞自噬及脑缺血缺氧休克等病理状态，且小鼠原代大脑皮层神经元细胞十分容易达到氧耗竭的目标。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
本实施例中提出了离体氧糖剥夺模型的建立方法，包括以下步骤：
S1：首先设置雌雄小鼠进行配对，在雌雄小鼠交配成功后，再将雌雄小鼠进行分离；
S2：在雌性小鼠怀孕13-15天时，雌性小鼠在用多聚赖氨酸涂层培养板上进行过夜；
S3：在用多聚赖氨酸涂层培养板上11-13h后，移除多聚赖氨酸，然后雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板上；
S4：雌性小鼠在应用层粘连蛋白涂层培养板2-4h后，移除层粘连蛋白后，用消毒蒸馏水对培养板进行冲洗；
S5：雌性小鼠在怀孕15-17天时,从雌性小鼠中剖析出胚胎子宫，并将剖析出胚胎子宫置入盛有冰冻的L-15液体的培养板中；
S6：通过超镜台可以从胚胎子宫中取出胚胎，再通过超镜台从胚胎中移出脑，此时可以收集大脑皮层，并将收集的大脑皮层置入盛有冰冻的L-15液体的培养板中；
S7：使用刀片对冰冻的L-15液体中的大脑皮层进行切段，将切段后的大脑皮层置入15ml的离心管中；
S8：离心管中的切段大脑皮层在1400RPM-1600RPM的条件下进行第一次离心，且离心2-4m；
S9：在第一次离心后的离心管中滴入用2-4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，再将离心管的溶液置入37度孵箱混匀4-5m，经蛋白酶消化后加入2-4ml的抑制剂溶液终止反应；
S10：离心管中的溶液在1400RPM-1600RPM的条件下进行第二次离心，且离心2-4m；
S11：在第二次离心后的离心管中滴入用2-4ml的分离溶液，使得离心管中的溶液进行悬浮沉淀，混匀细胞悬液，然后使用细胞过滤器对细胞悬液中的细胞进行过滤，并对细胞溶液中的细胞进行计数；
S12：细胞计数后，将细胞移植到培养板上，细胞移植到培养板71-73h后，加入4-6uM的Ara-C；
S13：细胞在培养板上培养五-七天时，对培养板中的40％-60％的培养液进行更换；
S14：小鼠原代大脑皮层神经元细胞在培养板上培养8-10天时，可以对小鼠原代大脑皮层神经元细胞进行氧糖剥夺；
S15：将进行实验的小鼠原代大脑皮层神经元细胞分为氧糖剥夺组和正常组；
S16：对于氧糖剥夺组，使用真空抽干机吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体1-2h，对于正常组，不需抽吸取无葡萄糖Early’s盐溶液中的气体，并向无葡萄糖Early’s盐溶液中加入葡萄糖；
S17：用含葡萄糖的Early’s盐溶液替换正常组中的培养液，氧糖剥夺组在正常组使用含葡萄糖的Early’s盐溶液作为培养液的50-70m后，氧糖剥夺组中的小鼠原代大脑皮层神经元细胞置入厌氧模块化培养室4-6m，然后继续放入培养箱中孵育4-12h。
本实施例中，厌氧模块化培养室内部通入加湿的95％的氮气体和2/5％一氧化碳气体，步骤S1到步骤S13共同完成了小鼠原代大脑皮层神经元的培养，步骤S14到步骤S17共同完成了氧糖剥夺的建立，本发明能够精确，快速，有效地模拟细胞应激，细胞自噬及脑缺血缺氧休克等病理状态，且小鼠原代大脑皮层神经元细胞十分容易达到氧耗竭的目标。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。