稳定表达人mate1转运体的细胞模型的构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供构建pcDNA3.1(+)-hMATEl重组质粒的方法，获得的pcDNA3.1(+)-hMATEl重组质粒用于构建MDCK-hMATEl、MDCK-hOCTl/hMATEl和MDCK-h0CT2/hMATEl三种细胞模型。建立的MDCK-hMATEl细胞模型在MDCK细胞上稳定高表达hMATEl，可作为快速、高通量筛选hMATEl的底物和抑制剂的研究模型；可预测由hMATEl介导的药物-药物相互作用；可运用本发明建立的MDCK-hOCTl/hMATEl和MDCK-h0CT2/hMATEl双转染细胞模型研究细胞对h0CTl/h0CT2和MATE1共同底物药物的转运研究。
【专利说明】稳定表达人MATE1转运体的细胞模型的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物【技术领域】，涉及稳定表达人multidrug and toxin excretion protein I(hMATEl)转运体的马丁 达比狗肾上皮（Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)细胞模型的构建，共转染人有机阳离子转运体l(human organic cation transporter 1，hOCTl)和hMATEl的MDCK细胞模型的构建，共转染人有机阳离子转运体 2 (human organic cation transporter 2，h0CT2)和 hMATEl 的 MDCK 细胞模型的构建以及 三种细胞模型的应用。 技术背景
[0002] 随着对药物代谢研究的深入，由药物转运体介导的零相代谢和三相代谢在 药物体内处置中的作用越来越受到关注。目前已发现solute carrier(SLC)超家族 和ATP-binding carrier (ABC)超家族的多种转运体，如有机阳离子转运体（organic cation transporters, OCTs)、有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs)、有机阴离子转运体（organic anion transporters，OATs)、MATEs、 p-糖蛋白（p-glycoprotein，p-gp)及乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP)等在药物的体内处置过程中发挥着重要作用。其中MATEs家族的重要成 员hMATEl由人SLC47A1(NM_018242. 2)基因编码，主要分布在肝脏肝血窦侧肝细胞的胆 毛细管一侧和肾小管上皮细胞刷状缘侧，可将多种代谢物和外源性物质外排至胆汁和尿 液中[Atsushi Y. , Ken-ichi I. Importance of the multi drug and toxin extrusion MATE/SLC47A family to pharmacokinetics, pharmacodynamics/toxicodynamics and pharmacogenomics. British Jounal of Pharmacology. 2011 ;164:1817-1825. ]〇 hMATEl 的底物范围非常广泛，涵盖生理条件下呈阳离子的化合物、两性化合物及阴离子化合物，夕卜 源性药物毒物及内源性代谢物。hMATEl的底物包括MPP +(l-methyl-4-phenylpyridinium) 、TEA+(tetraethylammonium)、二甲双狐、西咪替丁、4'6-二脉基-2-苯基卩引哚（4'6-diami dino-2-phenylindole，DAPI)、阿昔洛韦、普鲁卡因胺、奥沙利钼、非索非那定、百草枯、肌酐 及两性化合物头孢氨苄，其底物谱与hOCTl、h0CT2的底物谱有很大的重叠性。由于hOCTl 主要分布在人肝脏肝血窦一侧的肝细胞的基底侧膜上，h0CT2分布在人近端肾小管上皮细 胞的基底侧膜上，并且已有研究通过免疫荧光法证明h0CT2和hMATEl共同存在于同一肾小 管上皮细胞中[Hideyuki M. , Ken-ichi I. Precise comparison of protein localization among OCT, OAT and MATE in human kidney. Journal of pharmaceutical sciences.2013 ； 102:3302-3308.]，且分别位于细胞的基底侧膜和刷状缘侧膜上，可见hOCTs和hMATEl在某 些药物的处置中发挥共同作用。目前，药物在转运体层面的相互作用已被认为是引起代谢 性药物相互作用的重要原因之一，在药物研发阶段有必要考察与转运体的关系。而常用的 许多人源细胞系，低表达或不表达转运体；原代细胞来源困难，且原代细胞上转运体的表达 量也会随体外培养时间的延长而减少。因此构建稳定表达人源性转运体的细胞模型是体 外研究药物与转运体相互作用的重要工具。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一是提供构建pcDNA3. l(+)-hMATEl重组质粒的方法，通过以下 步骤实现：先从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR获得cDNA文库，通过设计含有 Hind III和Kpn I两个酶切位点的特异性引物（其核苷酸序列如SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示），以该cDNA为模板特异性扩增获得人SLC47A1基因的编码区域片段，得到的目 的基因片段通过Hind III和Kpn I两个酶切位点连接到表达载体质粒pcDNA3. I (+) -Hygro 上，构建pcDNA3. I (+) -hMATEl重组质粒。
[0004] 获得的pcDNA3. 1⑴-hMATEl重组质粒用于构建本发明中的MDCK-hMATEl、 MDCK-hOCTl/hMATEl 和 MDCK-h0CT2/hMATEl 三种细胞模型。
[0005] 本发明的目的之二是提供利用获得的pcDNA3. I (+)-hMATEl重组质粒构建稳定表 达hMATEl的MDCK-hMATEl细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用本发明中获得的 pcDNA3. I (+) -hMATEl重组质粒转染MDCK细胞48小时后，在培养基中加入400 μ g/ml的潮 霉素 B进行抗性筛选，持续筛选两周后，通过有限稀释法挑选培养单克隆细胞，经过荧光底 物DAPI初步筛选过量表达hMATEl的单克隆，采用Real-Time PCR法进行mRNA水平验证并 以甘油醒 _3_ 憐酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)(引物序 列见 SEQ ID No :3、SEQ ID No :4)为内参进行 hMATEl mRNA (引物序列见 SEQ ID No :5、SEQ ID No :6)的相对含量测定。MDCK-hMATEl细胞模型通过对经典底物MPP+和二甲双胍在有 或无阳性抑制剂西咪替丁存在下的摄取能力进行功能确证。
[0006] 完成构建的MDCK-hMATEl细胞可用于高通量快速筛选MATEl底物和抑制剂。底物 筛选可通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH 4Cl的人工摄取缓冲 液（artificial uptake buffer, AUB)孵育20min，换成AUB继续孵育5min。完成前两步预孵 育后方进行待研究药物的孵育。在MDCK-pcDNA3. 1和MDCK-hMATEl细胞同时进行待研究药 物孵育相同时间的实验，若待研究药物在MDCK-hMATEl细胞上的积聚量超过mock细胞上积 聚量的2倍，则可认为待研究药物是MATEl的底物。抑制剂筛选可通过以下步骤实现：在待 研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH 4Cl的AUB孵育20min，换成AUB继续孵育5min。完 成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育。MPP+、二甲双胍作为MATEl的经典底物，分别 与不同浓度的待研究药物共孵育，通过检测药物对细胞内MPP +或二甲双胍积聚量的影响， 计算待检测药物对MPP+或二甲双胍的抑制率及IC5tl值。MPP +和二甲双胍都采用液质联用 法进行测定。
[0007] 本发明的目的之三是提供利用获得的pcDNA3. I (+) -hMATE 1重组质粒构建稳 定表达hMATEl的MDCK-hOCTl/hMATEl细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用 pcDNA3. l(+)-hMATEl重组质粒转染MDCK-hOCTl细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物 DAPI的筛选方法与获得MDCK-hMATEl细胞模型的方法相同，进行mRNA相对含量测定时，以 GAPDH(引物序列见SEQ ID No :3、SEQ ID No :4)为内参进行hMATEl (mRNA引物序列见SEQ ID No :5、SEQ ID No :6)的相对含量测定时，同时测定细胞中hOCTl mRNA(引物序列如SEQ ID No :7、SEQ ID No :8所示）的相对含量，MDCK-hOCTl/hMATEl细胞进行MPP+的摄取实 验验证功能。并测定MDCK-hOCTl/hMATEl单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数（Apparet permeability parameters, Papp)并计算净外排率（Net efflux ratio)，在 costar 转运板 的给药池加入20 μ mol/L西咪替丁，每20min在接收池取100 μ L缓冲液进行含量测定，力口 入新的缓冲液补足体积，转运实验进行2hrs。西咪替丁采用液质联用法进行测定。通过公 式Papp = dQパdt.A.C(l)计算得到MDCK-hOCTl/hMATEl单层细胞对西咪替丁的表观渗 透系数并进一步计算净外排率。
[0008] 本发明的目的之四是提供利用获得的pcDNA3. I (+) -hMATE 1重组质粒构建稳 定表达hMATEl的MDCK-h0CT2/hMATEl细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：用 pcDNA3. I (+)-hMATEl重组质粒转染MDCK-h0CT2细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物 DAPI的筛选方法以及运用MPP+进行功能确证的方法与获得MDCK-hOCTl/hMATEl细胞模型 的方法相同，以GAPDH(引物序列见SEQ ID No :3、SEQ ID No :4)为内参测定mRNA相对含 量时，同时测定 hMATEl mRNA(引物序列见 SEQ ID No :5、SEQ ID No :6)、hOCTlmRNA(引物 序列见 SEQ ID No :7、SEQ ID No :8)和 h0CT2 mRNA(引物序列 SEQ ID No :9、SEQ ID No : 10)三种mRNA的相对含量。
[0009] 本发明获得的MDCK-h0CT2/hMATEl细胞可用于h0CT2和hMATEl共同底物的肾小 管排泄研究，例如测定MDCK-h0CT2/hMATEl单层细胞对西咪替丁的表观渗透系数及净外 排率。测定方法也是通过在costar细胞培养板上进行西咪替丁的转运实验，每20min取 100 μ L接收池缓冲液测定西咪替丁的含量，加入新的缓冲液补足体积，转运进行2hrs。通 过公式Papp = dQパdt.A.C(l)计算得到MDCK-h0CT2/hMATEl单层细胞对西咪替丁的表 观渗透系数并进一步计算净外排率。
[0010] 本发明的积极效果是：（1)建立的MDCK-hMATEl细胞模型在MDCK细胞上稳定高 表达hMATEl，可作为快速、高通量筛选hMATEl的底物和抑制剂的研究模型，实施例4和 实施例5中分别研究了氯化两面针碱和倒千里光碱是否为hMATEl的底物；（2)可应用 MDCK-hMATEl细胞模型预测由hMATEl介导的药物-药物相互作用；（3)可运用本发明建立 的 MDCK-hOCTl/hMATEl 和 MDCK-h0CT2/hMATEl 双转染细胞模型研究细胞对 h0CTl/h0CT2 和MATEl共同底物药物的转运，如实施例6中通过西咪替丁的转运实验评测MDCK-hOCTl/ hMATEl和MDCK-h0CT2/hMATEl单层细胞对西咪替丁的转运能力，结果说明MDCK-hOCTl/ hMATEl和MDCK-h0CT2/hMATEl两个双转细胞模型均可分别用于hOCTl与hMATEl和h0CT2 与hMATEl共同底物的转运研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1.人CDNA文库特异性扩增产物电泳鉴定图，泳道1为人SLC47A1的特异性引 物PCR产物电泳条带，泳道M为Maker D2000的电泳条带。
[0012] 图2. PCR纯化产物连接T载体转化大肠杆菌扩增后的质粒经Hind III、Kpn I双酶 切和Sal I单酶切的鉴定图。图中19个泳道从左到右依次为：Maker D2000, hMATEl PCR 纯化产物，1 - 8号单克隆菌株质粒的双酶切处理产物，Maker D15000,1 - 8号单克隆菌 株质粒的单酶切处理产物。
[0013] 图3. pcDNA3. 1⑴-hMATEl重组质粒转化大肠杆菌扩增后经Hind III、Kpn I双酶 切和Sal I单酶切的鉴定图。图中9个泳道从左到右依次为：Maker D2000, hMATEl PCR纯 化产物，1 - 3号单克隆菌株的双酶切处理产物，Maker D15000,1 - 3号单克隆菌株的单酶 切处理产物。
[0014] 图4. MDCK-3. 1细胞和MDCK-hMATEl多克隆细胞对荧光底物DAPI的积 聚。MDCK-3. 1和MDCK-hMATEl多克隆细胞经①人工摄取缓冲液（artificial uptake buffer, AUB)预孵育25min ;②添加30 mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后，换成AUB继续 孵育5min ;③AUB预孵育20min三种不同的预孵育方法后，加入lymol/L DAPI的AUB孵育 20min。以MDCK-3. 1细胞经方法②孵育后细胞内相对荧光强度为单位1。数据以mean±SD ，η - 3。
[0015] 图5. MDCK-3. 1细胞、MDCK-hMATEl多克隆细胞及Α、Β两批单克隆细胞对荧光底物 DAPI的积聚。细胞以添加30mmol/L NH4Cl的AUB孵育20min后，用AUB继续预孵育5min， 然后用含1 μ mol/L DAPI的AUB孵育20min，并采用BCA法测定蛋白含量，计算细胞内相对 荧光强度。以MDCK-3. 1细胞中的相对荧光强度值为单位1，数据以mean±SD表示，η = 3。
[0016] 图6. MDCK-hMATEl Α28、Β12和Β22三株单克隆细胞对MPP+的积聚。细胞的预孵 育方法同DAPI积聚实验。30mmol/L NH4Cl预孵育完成后，用含10 μ mol/L MPP+的AUB孵 育3min，并采用BCA法进行蛋白校正。以MDCK-3. 1细胞中MPP+相对积聚量为单位1，数据 以 mean土SD 表不，η = 3。
[0017] 图7.测定MDCK-hMATEl细胞中hMATEl mRNA的相对表达量。以GAPDH为内参，数 据以mean土SD表示，η = 3。
[0018] 图8. MDCK-hMATEl细胞在有或无抑制剂西咪替丁共存情况下对经典底物MPP+(A) 和二甲双胍（B)的积聚。孵育方法为细胞经添加30mmol/L NH4Cl的AUB预孵育20min后， 用AUB继续孵育5min，然后用含10 μ mol/L MPP+(二甲双胍）或10 μ mol/L MPP+(二甲双 胍）+100 μ mol/L西咪替丁的AUB孵育3min，并采用BCA法进行蛋白校正。以MDCK-3. 1细 胞中MPP+(二甲双胍）的相对积聚量为单位1，数据以mean土SD表示，η = 3。
[0019] 图 9. MDCK-h0CTl/pcDNA3. 1 细胞、MDCK-hOCTl/hMATEl 多克隆细胞及各株单克隆 细胞对荧光底物DAPI的积聚。细胞孵育与MDCK-hMATEl细胞一样经过30mmol/L NH4Cl预 孵育后，DAPI孵育20min。以MDCK-1/3. 1细胞中的相对荧光强度为单位1，数据以mean±SD ，η - 3。
[0020] 图10. MDCK-hOCTl/hMATEl单克隆细胞在有或无西咪替丁共存情况下对MPP+的积 聚。实验方法与MDCK-hMATEl细胞相同。以MDCK-h0CTl/3. 1细胞中MPP+的相对积聚量为 单位1，数据以mean 土 SD表示，η = 3。
[0021] 图11.测定MDCK-hOCTl/hMATEl细胞中hMATEl和hOCTl mRNA的相对表达量。以 GAPDH为内参，数据以mean土SD表示，η = 3。
[0022] 图 12.MDCK-h0CT2/pcDNA3. 1(2/3. 1)细胞、MDCK-h0CT2/hMATEl 多克隆（2/Μ)细 胞及各株单克隆细胞对荧光底物DAPI的积聚。细胞孵育与MDCK-hMATEl细胞一样经过 30mmol/L NH4Cl预孵育。以MDCK-2/3. 1细胞中的相对荧光强度为单位1，数据以mean±SD ，η - 3。
[0023] 图13. MDCK-h0CT2/hMATEl单克隆细胞在有或无西咪替丁共存情况下对MPP+的积 聚。实验方法与MDCK-hMATEl细胞相同。以MDCK-h0CT2/3. 1细胞中MPP+的相对积聚量为 单位1，数据以mean 土 SD表示，η = 3。
[0024] 图 14.测定 MDCK-h0CT2/hMATEl 细胞中 hMATEUhOCTl 和 h0CT2 mRNA 的相对表达 量。以GAPDH为内参,数据以mean土SD表示，η = 3。
[0025] 图15. MDCK-hMATEl细胞上氯化两面针碱的动力学曲线。0. 1-4μ mol/L氯化两面 针碱在MDCK-hMATEl和MDCK-3. 1细胞上的孵育2min的积聚情况，数据以mean±SD表示， η = 3〇
[0026] 图16.倒千里光碱在MDCK-hMATEl细胞上的积聚。细胞对2 μ mol/L倒千里光碱 在有或无抑制剂西咪替丁（100 μ mol/L)存在条件下孵育2min的积聚情况，以MDCK-3. 1细 胞中倒千里光碱单独给药的相对积聚量为100%，数据以mean土SD表示，η = 3。
[0027] 图17. MDCK-hOCTl/3. 1和MDCK-hOCTl/hMATEl细胞对西咪替丁表观渗透系数的测 定。以3 X IO5个/孔的密度种板培养，在给药池加入20 μ mol/L西米替丁，每20min在接收 池取100 μ L缓冲液进行西米替丁含量测定，转运实验进行2小时。数据以mean±SD表示， η = 3〇
[0028] 图18. MDCK-h0CT2/3. 1和MDCK-h0CT2/hMATEl细胞对西咪替丁表观渗透系数的测 定。以3 X IO5个/孔的密度种板培养，在给药池加入20 μ mol/L西米替丁，每20min在接收 池取100 μ L缓冲液进行西米替丁含量测定，转运实验进行2小时。数据以mean±SD表示， η = 3。
【具体实施方式】
[0029] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0030] 实施例I pcDNA3-hMATEl重组质粒的构建
[0031] I. SLC47A1基因编码序列的获得
[0032] (1)根据人SLC47A1基因 mRNA的编码序列设计两条PCR引物，并根据扩增载体 PMD19-T和表达载体pcDNA3. I (+)-hgromycin在引物的两端分别设计添加一个酶切位点 Hind III和Kpn I (酶切位点用下划线标出），序列见表1中序号为1、2的引物序列，引物 均配成10 μ mol/L使用。
[0033] 表1本发明中所使用的引物序列
[0034]
【权利要求】
1. 一种构建PCDNA3. I ( + )-hMATEl重组质粒的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： 先从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR获得cDNA文库，通过设计含有历'/7(1 III 和幻7/? I两个酶切位点的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所 示，以该cDNA为模板特异性扩增获得人基因的编码区域片段，得到的目的基因片 段通过III和幻I两个酶切位点连接到表达载体质粒pcDNA3. I (+) -Hygro上，构建 pcDNA3. l(+)-hMATEl 重组质粒。
2. 根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3. I (+) -hMTEl重组质粒构建稳定 表达hMTEl的MDCK-hMATEl细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用 pcDNA3. I (+) -hMATEl重组质粒转染MDCK细胞48小时后，在培养基中加入400 μ g/ml的潮 霉素 B进行抗性筛选，持续筛选两周后，通过有限稀释法挑选培养单克隆细胞，经过荧光底 物DAPI初步筛选过量表达hMATEl的单克隆，采用Real-Time PCR法进行mRNA水平验证 并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参进行hMTEl mRNA的相对含量测定，GAPDH和hMTEl各 自的上、下游引物序列如 SEQ ID No :3、SEQ ID No :4 和 SEQ ID No :5、SEQ ID No :6 所示， MDCK-hMATEl细胞模型通过对经典底物MPP+和二甲双胍在有或无阳性抑制剂西咪替丁存在 下的摄取能力进行功能确证。
3. 根据权利要求2所述方法构建的稳定表达hMTEl的MDCK-hMATEl细胞模型在高通 量快速筛选MTEl底物和抑制剂中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，底物筛选通过以下步骤实现：在待研究药 物孵育前，先用添加30mmol/LNH4Cl的人工摄取缓冲液孵育20min，换成AUB继续孵育5min， 完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，在MDCK-pcDNA3. 1和MDCK-hMATEl细胞同 时进行待研究药物孵育相同时间的实验，若待研究药物在MDCK-hMATEl细胞上的积聚量超 过mock细胞上积聚量的2倍，则可认为待研究药物是MATEl的底物。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，抑制剂筛选通过以下步骤实现：在待研究 药物孵育前，先用添加30mmol/LNH 4Cl的AUB孵育20min，换成AUB继续孵育5min，完成前 两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，MPP+、二甲双胍作为MATEl的经典底物，分别与不 同浓度的待研究药物共孵育，通过检测药物对细胞内MPP +或二甲双胍积聚量的影响，计算 待检测药物对MPP+或二甲双胍的抑制率及IC5tl值，MPP +和二甲双胍都采用液质联用法进行 测定。
6. 根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3. I (+) -hMTEl重组质粒构建稳定表 达hMTEl的MDCK-hOCTl/hMATEl细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用 pcDNA3. l(+)-hMATEl重组质粒转染MDCK-hOCTl细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物 DAPI的筛选方法与获得MDCK- hMATEl细胞模型的方法相同，以GAPDH为内参进行hMATEl mRNA的相对含量测定时，同时测定细胞中hOCTl mRNA的相对含量，GAPDH、hMATEl及hOCTl 各自的上、下游引物序列如 SEQ ID No :3、SEQ ID No :4，SEQ ID No :5、SEQ ID No :6 及 SEQ ID No:7、SEQ ID No:8所示，MDCK-hOCTl/hMATEl细胞进行MPP+的摄取实验验证功能，进行 MDCK-hOCTl/hMATEl单层细胞对西咪替丁的转运能力验证实验，在costar转运板的给药池 加入20 μ mol/L西咪替丁，每20min在接收池取100 μ L缓冲液进行含量测定，转运实验进 行2hrs，西咪替丁采用液质联用法进行测定。
7. 根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3. I (+) -hMTEl重组质粒构建稳定表 达hMATEl的MDCK-hOCT2/hMATEl细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现： 用pcDNA3. I (+) -hMATE 1重组质粒转染MDCK-hOCT2细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光 底物DAPI的筛选方法以及运用MPP+和西咪替丁两种底物进行功能确证的方法与获得 MDCK-hOCTl/hMATEl细胞模型的方法相同，以GAPDH为内参测定mRNA相对含量测定时，同 时测定 hMATEl mRNA、hOCTl mRNA 和 hOCT2 mRNA 三种 mRNA 的相对含量，GAPDH、hMATEl、 hOCTl 及 hOCT2 各自的上、下游引物序列如 SEQ ID No:3、SEQ ID No:4，SEQ ID No:5、SEQ ID No :6，SEQ ID No :7、SEQ ID No :8 及 SEQ ID No :9、SEQ ID No :10 所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的稳定表达hMATEl的MDCK-hOCT2/ hMATEl细胞模型在hOCT2和hMATEl共同底物的肾小管排泄机制研究中的应用。
【文档编号】C12Q1/02GK104212834SQ201410325014
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】雷红梅, 孙思源, 李丽萍, 涂美娟, 王凯, 白梦如, 周慧, 曾苏, 蒋惠娣 申请人:浙江大学