本发明涉及胶原蛋白制备技术领域，具体是一种从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法。
背景技术：
胶原蛋白又称胶原，是由三条肽链相互缠绕形成的纤维状蛋白质，是一种糖蛋白，含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及糖，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，是机体含量最多的一类蛋白质。现已发现的胶原种类为19种，其中ⅰ型胶原、ⅱ型胶原和ⅲ型胶原是构成胶原纤维的主要成分，主要存在于动物的结缔组织中，起支持器官、保护机体的功能，是重要的结构蛋白质。
动物的皮胶原以ⅰ型胶原为主，通常为无色、透明、无分支的原纤维，分子量约285kda，长约300nm，由3条多肽链组成。3条a多肽链中有两条链是完全相同的，称为a1链，另外一条链与a1链的一级序列结构不同，称为a2链。肽链由大约1000个氨基酸残基组成，具有重复的氨基酸序列（gly-x-y）n，x通常为脯氨酸，y为羟脯氨酸或其它氨基酸，三肽形成胶原特有的左手螺旋，每个旋转的部位有3个氨基酸残基，构成胶原的二级结构。
现有技术如授权公告号为cn103740793b的中国发明专利，公开了一种生产鱼皮胶原蛋白的方法，它是将冻干的鱼手工剥下鱼皮，或手工分割的鲜鱼皮低温烘干或冻干，鱼皮的水份保持在10-15%，经捶打、揉搓、剪切，鱼肉、鱼鳞、鱼骨等破碎，与鱼皮分离，再风选，变得膨松、色白、柔软；起到了去杂、脱色和脱腥作用，90℃热提取，lcalase2.4l和neutrase0.8l酶解，脱色除味，5微米孔径滤膜过滤，灭菌、浓缩、喷雾干燥，得到胶原蛋白。上述胶原蛋白的提取率低，得到的胶原蛋白的活性低，产品质量较差，不适合工厂化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白的提取率高，制备步骤较为简单，所需的设备量少，重现性好的从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法，提取得到的胶原蛋白的生物活性高。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法，包括预处理、洗涤、酶法提取、盐析、透析和冷冻干燥。上述方法对胶原蛋白的提取率高，可达97.8%以上，制备步骤简单，所需的设备量少，每一步操作均有准确的数据，重现性好，适合大规模生产；以鲫鱼加工下脚料鱼皮为原料制备，成本低廉，对鲫鱼的资源利用率提高，增加鲫鱼的附加值；制备的胶原蛋白的生物活性高，可用于药品、食品、保健品和化妆品等领域。酶法提取步骤为在鱼皮中加入胃蛋白酶、活性多肽和醋酸溶液，酶解，离心取上清液。胶原的三股螺旋结构对胃蛋白酶具有相当的稳定性，胃蛋白酶可以选择性的切除非螺旋的端肽而溶解出胶原分子，并且保留了胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其生物活性。醋酸可以起到胶原蛋白膨胀和增溶的作用，从而提高胶原蛋白的提取率。
作为优选，鱼皮与醋酸溶液体积比为1:40~60，胃蛋白酶：鱼皮干重比为1:8~14，活性多肽为胃蛋白酶重量的2~5%，醋酸溶液浓度为0.4~0.7mol/l。上述条件下胃蛋白酶的酶解效率高，胶原蛋白在醋酸溶液中的溶解度高，胶原蛋白的生物活性高，不会造成资源浪费。
作为优选，活性多肽的氨基酸序列为scasvckahcrarrcgcsyyvsvfhrgkahrcycrclrc。上述活性多肽可与胶原蛋白通过静电作用和氢键结合，将胶原蛋白分子间隔开来，防止胶原蛋白分子之间反应生成交联键，从而提高其在醋酸溶液中的溶解率。
作为优选，预处理步骤为将鲫鱼鱼皮浸于含0.7~1.5%过氧化氢的0.02~0.06mol/l氢氧化钠溶液，溶液温度为4~20℃。过氧化氢可将鱼皮中的黑色素漂白，氢氧化钠可去除鱼皮中的杂蛋白，并通过皂化反应脱脂。氢氧化钠浓度过低脱杂蛋白效果不好，过高会导致胶原蛋白的高分子量键断裂，上述浓度条件下脱除鱼皮中非胶原蛋白的效果好，对胶原蛋白性质影响很小。
作为优选，洗涤步骤为将预处理结束的固液混合物以5000~8000r/min高速搅拌2~6min，纱布过滤取沉淀，先用7~15%正丁醇清洗沉淀，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗至中性。正丁醇清洗去除沉淀中残留的脂质及其他脂溶性杂质，再来水冲洗去除残留的过氧化氢和氢氧化钠，最后用蒸馏水冲洗至中性。
作为优选，盐析步骤为在上清液中加入含4~7mol/l氯化钠的0.4~0.7mol/l醋酸溶液，至最终盐浓度为0.6~1.3mol/l，静置过夜，离心取沉淀。氯化钠的加入可破坏胶原蛋白的胶体性质，使其在醋酸溶液中的溶解度大幅下降，从而达到对胶原蛋白提取纯化的目的。
作为优选，透析步骤为在沉淀中加入8~13倍体积的0.4~0.7mol/l醋酸溶液，搅拌均匀后离心取上清液，然后在0.08~0.14mol/l醋酸溶液中透析8~15h，每2~4h换一次溶液，最后用蒸馏水透析至中性。
作为优选，冷冻干燥步骤为：预冻：-35~-45℃预冻3~5h；冷冻干燥：-45~-35℃，0~4pa冷冻干燥5~7h，-10~-5℃，6~14pa冷冻干燥1~2h；升华干燥：13~20℃，50~60pa升华干燥2~3h；解析干燥：5~10℃，3~5pa解析干燥2~4h，得到胶原蛋白粉末。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低压下干燥，活性短肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性短肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明方法制备步骤简单，所需的设备量少，每一步操作均有准确的数据，重现性好，适合大规模生产；以鲫鱼加工下脚料鱼皮为原料制备，成本低廉，对鲫鱼的资源利用率提高，增加鲫鱼的附加值；制备的胶原蛋白的生物活性高，可用于药品、食品、保健品和化妆品等领域；2）酶解法提取胶原蛋白的速度快，胃蛋白酶可以选择性的切除非螺旋的端肽而溶解出胶原分子，并且保留了胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其生物活性；3）对胶原蛋白的提取率高，可达97.8%以上，酶解法提取胶原蛋白过程中加入氨基酸序列为scasvckahcrarrcgcsyyvsvfhrgkahrcycrclrc的活性多肽。上述活性多肽可与胶原蛋白通过静电作用和氢键结合，将胶原蛋白分子间隔开来，防止胶原蛋白分子之间反应生成交联键，从而提高其在醋酸溶液中的溶解率。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法，包括预处理、洗涤、酶法提取、盐析、透析和冷冻干燥。上述方法对胶原蛋白的提取率高，可达97.8%以上，制备步骤简单，所需的设备量少，每一步操作均有准确的数据，重现性好，适合大规模生产；以鲫鱼加工下脚料鱼皮为原料制备，成本低廉，对鲫鱼的资源利用率提高，增加鲫鱼的附加值；制备的胶原蛋白的生物活性高，可用于药品、食品、保健品和化妆品等领域。酶法提取步骤为在鱼皮中加入胃蛋白酶、活性多肽和醋酸溶液，酶解，离心取上清液。胶原的三股螺旋结构对胃蛋白酶具有相当的稳定性，胃蛋白酶可以选择性的切除非螺旋的端肽而溶解出胶原分子，并且保留了胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其生物活性。醋酸可以起到胶原蛋白膨胀和增溶的作用，从而提高胶原蛋白的提取率。
鱼皮与醋酸溶液体积比为1:47，胃蛋白酶：鱼皮干重比为1:9，活性多肽为胃蛋白酶重量的3%，醋酸溶液浓度为0.5物活性高，不会造成资源浪费。
活性多肽的氨基酸序列为scasvckahcrarrcgcsyyvsvfhrgkahrcycrclrc。上述活性多肽可与胶原蛋白通过静电作用和氢键结合，将胶原蛋白分子间隔开来，防止胶原蛋白分子之间反应生成交联键，从而提高其在醋酸溶液中的溶解率。
预处理步骤为将鲫鱼鱼皮浸于含1%过氧化氢的0.05mol/l氢氧化钠溶液，溶液温度为7℃。过氧化氢可将鱼皮中的黑色素漂白，氢氧化钠可去除鱼皮中的杂蛋白，并通过皂化反应脱脂。氢氧化钠浓度过低脱杂蛋白效果不好，过高会导致胶原蛋白的高分子量键断裂，上述浓度条件下脱除鱼皮中非胶原蛋白的效果好，对胶原蛋白性质影响很小。
洗涤步骤为将预处理结束的固液混合物以7000r/min高速搅拌4min，纱布过滤取沉淀，先用10%正丁醇清洗沉淀，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗至中性。正丁醇清洗去除沉淀中残留的脂质及其他脂溶性杂质，再来水冲洗去除残留的过氧化氢和氢氧化钠，最后用蒸馏水冲洗至中性。
盐析步骤为在上清液中加入含5mol/l氯化钠的0.5mol/l醋酸溶液，至最终盐浓度为1mol/l，静置过夜，离心取沉淀。氯化钠的加入可破坏胶原蛋白的胶体性质，使其在醋酸溶液中的溶解度大幅下降，从而达到对胶原蛋白提取纯化的目的。
透析步骤为在沉淀中加入11倍体积的0.5mol/l醋酸溶液，搅拌均匀后离心取上清液，然后在0.12mol/l醋酸溶液中透析14h，每3h换一次溶液，最后用蒸馏水透析至中性。
冷冻干燥步骤为：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到胶原蛋白粉末。冻干整个过程都在程序的控制下，操作简单，工序简洁，自动化程度高，减少了人力、物力。低温下干燥能更好地保留活性短肽的活性；低压下干燥，活性短肽不易氧化，疗效更好；冻结时活性短肽形成“骨架”，干燥后保存原形，为多孔疏松结构且颜色基本不变，产品外观更加优良；复水性好，冻干活性短肽能迅速吸水还原成冻干前状态，使用方便；脱水彻底，活性短肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利于长途运输和长期保存。
实施例2：
从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
1）预处理：将鲫鱼鱼皮浸于含1%过氧化氢的0.04mol/l氢氧化钠溶液中24h，溶液温度为10℃；
2）洗涤：将预处理结束的固液混合物用食物搅拌机以6000r/min高速搅拌5min，纱布过滤取沉淀，先用10%正丁醇清洗沉淀，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗至中性；
3）酶法提取：在鱼皮中加入胃蛋白酶、活性多肽和醋酸溶液，酶解，离心取上清液。鱼皮与醋酸溶液体积比为1:50，胃蛋白酶：鱼皮干重比为1:10，活性多肽为胃蛋白酶重量的4%，醋酸溶液浓度为0.5mol/l。活性多肽的氨基酸序列为scasvckahcrarrcgcsyyvsvfhrgkahrcycrclrc；
4）盐析：在上清液中加入含5mol/l氯化钠的0.5mol/l醋酸溶液，至最终盐浓度为0.9mol/l，静置过夜，离心取沉淀；
5）透析：在沉淀中加入10倍体积的0.5mol/l醋酸溶液，搅拌均匀后离心取上清液，然后在0.1mol/l醋酸溶液中透析10h，每3h换一次溶液，最后用蒸馏水透析至中性。
6）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到胶原蛋白粉末。上述方法对胶原蛋白的提取率高，达98.5%；上述方法制备步骤简单，所需的设备量少，每一步操作均有准确的数据，重现性好，适合大规模生产；以鲫鱼加工下脚料鱼皮为原料制备，成本低廉，对鲫鱼的资源利用率提高，增加鲫鱼的附加值；制备的胶原蛋白的生物活性高，可用于药品、食品、保健品和化妆品等领域。
实施例3：
从鲫鱼鱼皮中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
1）预处理：将鲫鱼鱼皮浸于含1%过氧化氢的0.05mol/l氢氧化钠溶液中20h，溶液温度为4℃；
2）洗涤：将预处理结束的固液混合物用食物搅拌机以8000r/min高速搅拌4min，纱布过滤取沉淀，先用10%正丁醇清洗沉淀，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗至中性；
3）酶法提取：在鱼皮中加入胃蛋白酶、活性多肽和醋酸溶液，酶解，离心取上清液。鱼皮与醋酸溶液体积比为1:45，胃蛋白酶：鱼皮干重比为1:8，活性多肽为胃蛋白酶重量的3.5%，醋酸溶液浓度为0.5mol/l。活性多肽的氨基酸序列为scasvckahcrarrcgcsyyvsvfhrgkahrcycrclrc；
4）盐析：在上清液中加入含6mol/l氯化钠的0.5mol/l醋酸溶液，至最终盐浓度为1mol/l，静置过夜，离心取沉淀；
5）透析：在沉淀中加入10倍体积的0.5mol/l醋酸溶液，搅拌均匀后离心取上清液，然后在0.1mol/l醋酸溶液中透析10h，每3h换一次溶液，最后用蒸馏水透析至中性。
6）冷冻干燥：预冻：-40℃预冻5h；冷冻干燥：-40℃，4pa冷冻干燥6h，-7℃，16pa冷冻干燥2.6h；升华干燥：13℃，57pa升华干燥3h；解析干燥:10℃，4pa解析干燥3h，得到胶原蛋白粉末。上述方法对胶原蛋白的提取率高，达97.8%；上述方法制备步骤简单，所需的设备量少，每一步操作均有准确的数据，重现性好，适合大规模生产；以鲫鱼加工下脚料鱼皮为原料制备，成本低廉，对鲫鱼的资源利用率提高，增加鲫鱼的附加值；制备的胶原蛋白的生物活性高，可用于药品、食品、保健品和化妆品等领域。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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