一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物工程领域，具体地说是一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白（collagen)是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无支链的纤 维性蛋白质，主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙 齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础。
[0003] 大多数的胶原蛋白在天然状态下不溶于水，在体内以胶原原纤维或称胶原纤维的 形式存在。胶原原纤维的基本结构单位是原胶原分子，肽链(亚基)相互缠绕成独特的三股 右手螺旋结构。由于上述结构非常稳定，胶原蛋白很难被生物学降解，只有少数的蛋白酶能 够在特定的pH和温度条件下水解胶原纤维，这类酶被称为胶原蛋白酶。按照其来源，胶原蛋 白酶可以分为微生物胶原蛋白酶和动物胶原蛋白酶。其中，哺乳动物胶原蛋白酶以基质金 属蛋白酶为主。
[0004] 目前国内外的胶原蛋白主要从鱼皮、动物皮及肌腱中提取制备，临床上胶原海绵 是无过敏性、无菌冻干胶原，是促进伤口痊愈的特效药，还可作为各种外科手术填充剂和止 血药，疗效显著，用途广泛。
[0005] -般胶原蛋白的提取主要采用酸溶、酶解、盐析等方法，最后冻干成品经干热病毒 灭活和钴-60辐照。公告号为CN100366303C的发明专利公开了一种肌腱、韧带防粘连生物膜 的制备方法，以牛肌腱组织为基料，经过除杂、清洗、酸、碱、酶处理、硫酸软骨剂交联，冷冻 干燥、灭菌后制得蛋白纯度在95%以上的医用胶原蛋白。
[0006] 但是上述方法并未公开具体的工艺参数，例如用何种酶处理、处理时间，而现有的 制备方法又存在以下缺陷：酶解过程中采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，反应时间 长，收率低，纯度低，生产的胶原蛋白材料存在机械性能、生物稳定性等方面的缺陷，限制其 实际应用。为克服上述缺点，也采用高电压脉冲法提取，但是仍然无法达到令人满意的效 果。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种收率高、生产周期短、产品纯度高的牛肌 腱胶原蛋白提取方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种牛肌腱胶原蛋白的提取 方法，包括如下步骤：
[0009] 将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05%~0.15%牛肌 腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38°C~42°C酶解后，得酶解液；
[0010] 将酶解液离心后，取沉淀，用〇 · 08 %~0 · 12 %乙酸溶解后过滤，得滤液；
[0011] 将滤液盐析，得盐析液；
[0012] 将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加〇. 08 %~0.12 %乙酸继续溶解，得胶原蛋 白液；
[0013] 将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。
[0014] 本发明的有益效果在于:提取效率高，现有的提取方法每千克肌腱能提取86.7克 胶原蛋白产品，采用本发明方法收率能提高到106.2克，收率提高近20%;产品纯度高，紫外 扫描图谱呈现在250~500nm之间均无吸收峰，同时在180~240nm之间有强吸收峰，表明在 波长280am附近无吸收峰，不含杂蛋白；而在230am及以下存在强烈的吸收峰，表明胶原蛋白 的羰基及肽键的特征吸收峰强，胶原蛋白含量近100%;生产周期短，由原来的两天时间现 缩短至一天，原有的酶解时间需长达8小时，而采用适冷蛋白酶MCP-01酶解时间可控制在4 小时内，当日就能完成生产过程;产品弹性好，亲水性强，生物相容性好。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明的流程图。
【具体实施方式】
[0016] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0017]本发明最关键的构思在于：用适冷蛋白酶MCP-01在缓冲液体系下水解肌腱，使胶 原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松散，使其快速水解且水解充分， 进而提尚收率和广品纯度。
[0018] 请参照图1，一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
[0019] 将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05%~0.15%牛肌 腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38°C~42°C酶解后，得酶解液；
[0020] 将酶解液离心后，取沉淀，用0.08%~0.12%乙酸溶解后过滤，得滤液；
[0021 ]将滤液盐析，得盐析液；
[0022] 将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加0.08 %~0.12 %乙酸继续溶解，得胶原蛋 白液；
[0023]将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。由于胶原蛋白是水不溶性蛋白， 具有特殊超分子结构，除了胶原蛋白酶外，其他蛋白酶很难降解，而适冷蛋白酶MCP-01是分 离自深海沉积物的适冷菌？8611(1〇3]^61'01]101^8 8口.319913分泌的主要蛋白酶，适冷蛋白酶 MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P结构域和PKD结构域四部分，含有C端的PKD结 构域作用于不溶性底物，使胶原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松 散，大大提高了蛋白质水解效率，减少了酶解的时间。由于PKD结构域的对胶原纤丝的膨胀 作用与温度关系较大，以往都认为4~10°C条件下用适冷蛋白酶MCP-01酶解胶原蛋白，效果 较好，但是我们发现在Tris-HCL缓冲液中在38°C~42°C条件下酶解，并配合后续的多次离 心和溶解，在相同时间内得到的胶原蛋白纯度最高、收率最大。进一步的，38°C~42°C时适 冷蛋白酶MCP-01在pH=8的Tris-HCL缓冲液中活性最高，可大大提高酶解效率，减少酶解时 间。
[0024]进一步的，所述预处理包括：剔除牛肌腱上的肉、骨、膜后，用2倍牛肌腱体积的体 积分数为〇. 3%的聚山梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用 2倍牛肌腱体积的0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性， 最后将牛肌腱浸泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物。
[0025]经过上述预处理后，牛肌腱上的杂物可以完全除去，避免对后续的胶原蛋白提取 造成影响。
[0026]进一步的，所述缓冲液中Tris-HCL的浓度为0.0 lmol/L，缓冲液pH=8.0，缓冲液体 积为2倍牛肌腱体积。
[0027] 在上述酸碱环境和比例下，牛肌腱可以宰最短时间内水解完全，同时使用的酶、缓 冲液量最少，有利于降低提取成本。
[0028] 进一步的，将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和乳盖后，在98~ 100°C水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行 钴-60辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
[0029] 具体的，上述牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
[0030] 步骤1、剔除牛肌腱上的肉、骨、膜后，用2倍牛肌腱体积的体积分数为0.3%的聚山 梨酯80水溶液搅拌清洗牛肌腱，用水冲洗牛肌腱至溶液清澈，然后用2倍牛肌腱体积的 0.005mol/L氢氧化钠溶液浸泡牛肌腱，再用水冲洗至牛肌腱表面为中性，最后将牛肌腱浸 泡在水中，剔除牛肌腱上粘附的膜后用水冲洗牛肌腱至无杂物；
[0031 ]步骤2、将冲洗至无杂物的牛肌腱冷冻、破碎，将破碎后的牛肌腱放入2倍牛肌腱体 积的浓度为〇. 〇lmo 1 /L、pH=8.0的Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.1 %牛肌 腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在40°C酶解后，得酶解液;将酶解液离心后，取沉淀，用0.1 % 乙酸溶解后过滤，得滤液;将滤液盐析，得盐析液;将盐析液离心，将沉淀加水溶解后再次离 心，然后加水溶解沉淀，再加0.1%乙酸继续溶解，冻干即得牛肌腱胶原蛋白；
[0032]步骤3、将冻干后的牛肌腱胶原蛋白进行分装、真空度检测和乳盖后，在98~100°C 水浴保温30分钟的条件下对胶原蛋白的非脂包膜病毒进行干热病毒灭活，然后进行钴-60 辐照，得医用胶原蛋白无菌制品。
[0033] 以下实施例中所采用的牛肌腱均来自于新鲜屠宰的牛蹄筋，经摘挑剔除肌腱上的 肉、骨、膜等物后牛肌腱总量约为17kg。
[0034] 实施例1所有操作均在无菌万级净化区中进行，其中分装和冻干操作均在局部百 级净化区进行，所进行的操作均符合洁净区操作要求。
[0035] (1)称取2kg牛肌腱；
[0036] (2)用2倍体积的0.3% (V/V)聚山梨酯80水溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌 腱至溶液清澈；
[0037] (3)用2倍体积的0.005M氢氧化钠溶液搅拌清洗肌腱10分钟，用水冲洗肌腱至溶液 为中性；
[0038] (4)将肌腱浸泡在水中，用弯剪剔除肌腱上粘附的膜；
[0039] (5)用水冲洗至无杂物；
[0040] (6)将清洗好的肌腱排列整齐，放入_30°C冷冻30分钟；
[00411 (7)取出肌腱，用刀将其切成1 -2mm厚，2-4_粗的颗粒；
[0042] (8)称取肌腱2kg，加40L纯水，用破碎机高速破碎；
[0043] (9)滤去水分并尽量挤掉已破碎肌腱中的水分；
[0044] (10)加乩0.01]?1^8-!〇^4!18.0缓冲液；
[0045] (11)加0.1%适冷蛋白酶1?^-0140°(3进行酶解4小时；
[0046] (12)离心，沉淀用40L