专利名称：一种从猪皮中提取i型胶原的方法
技术领域：
本发明属于生物化工分离领域，具体地，本发明涉及一种类型均一的胶原制备方法。
背景技术：
胶原是一种由动物细胞表达的天然生物高分子，作为细胞外基质的主要成分几乎存在于所有组织，约占哺乳动物体内总蛋白的33%。胶原对于维持组织的结构与机械强度十分关键，胶原与蛋白和多糖等相互作用构成复杂的网状结构，不仅起到细胞结构支架的作用，而且对细胞和组织的形态结构、新陈代谢、生长、分化都有重要影响。胶原由3条链组成，每条肽链约1000个氨基酸残基，根据其每条链的氨基酸组成差异，胶原可分为多种类型，目前在哺乳动物体内已发现27种不同类型的胶原，不同类型胶原的性质存在一定差异。胶原具有良好的生物相容性、弱抗原性、生物可降解、生物可吸收性以及良好的吸水性，胶原作为一种理想的生物材料，可用于组织工程、医疗器械、组织修复、药物控释和动物细胞培养等领域，如胶原可用于制造人工器官、止血材料、组织修复与再生材料、组织填充材料、支架材料、神经缺损修复材料以及动物细胞培养等。不同类型胶原的功能、机械强度及其热稳定性存在一定差异，与其它生物分子、细胞或材料界面之间的相互作用也存在一定差异，因此，制备不同生物材料对胶原类型及其比例等存在一定要求。在组织工程材料方面，Ohno T等证明使用胶原制备三维支架接种软骨细胞并用于软骨组织修复和再生时，I型和II型胶原对结果影响十分显著(Materials Science andEngineering:C, 2004, 24-3:407 - 411);胶原蛋白用于制备止血材料方面，不同类型的胶原与血小板之间的相互作用也存在一定差异，如Zhu JQ证明血小板表面上存在可与不同类型胶原结合的活性位点，且结合位点种类与胶原类型密切相关(Thrombosis Research,2007，119-1:111-119)。在组织再生材料方面，I型和III型胶原对于膀胱壁的无细胞基质的移植和再生效果影响十分显著(European Urology Supplements, 2003, 2-1:121)。因此，提高胶原的类型均一性对改进组织工程产品或医疗器械等产品十分关键，制备类型均一的胶原具有广阔的应用前景。由于胶原在天然状态下不溶于水溶液，直接分离不同类型的胶原存在一定难度，也是近年来的生物材料领域中胶原研究的热点。范代娣等采用基因工程的方法制备了一种重组胶原蛋白(范代娣，马晓轩，严建亚等，重组胶原蛋白，专利申请号CN102351954.A)，杨树林等采用基因重组的方法制备了人III型胶原的具有序列(一种重组人源胶原蛋白及其制备方法申请号102443057.A)。基于基因的胶原制备技术不同于以动物皮肤或骨为原料制备胶原的方法，其成本较低，制备的胶原纯度较高，但基因重组技术只能制备出胶原的一条链活局部序列，而在制备具有三螺旋结构的胶原方面存在难度。任伟业申请的一种具有三螺旋结构的活性胶原的制备方法(申请号CN102391372.A)公开了一种制备具有三螺旋结构胶原的方法，但该方法只能制备出混合胶原，而不涉及不同类型胶原的分离。李洁等以动物软骨为原料，经过粉碎后采用胃蛋白酶进行降解，采用盐析和离心的方法获得非变性II型胶原蛋白(李洁、朱大开，龚辉，非变性II型胶原蛋白生产方法，专利申请号CN102154425.A)，该过程需要反复的盐析处理和离心过程。蒋波等采用新鲜新生牛皮为原料，采用酶解、盐析、变性和复性的技术制备了牛III型胶原(蒋波，李霞、陈露等，医用级III型胶原的制备方法，申请号200910216686.7)，该专利用于制备牛III型胶原。从实际应用效果分析，已有方法制备的胶原纯度以及胶原的分子量范围存在不稳定性，用于制备生物材料时，尤其是对I型胶原纯度要求较高的生物材料时，其应用效果难以满足实际要求。不同类型胶原的热变性温度存在一定差异，热变性后的胶原可通过非胶原类的酶进行降解。因此，通过温度控制可实现不同类型胶原的变性，加入酶后可实现不同类型胶原的选择性酶解，是实现分离不同类型胶原的一种良好方法。
发明内容
针对I型胶原制备难度高以及医疗器械类生物材料对I型胶原纯度要求高的情况，本发明目的在于提供一种从猪皮中提取I型胶原的方法，制备的猪I型胶原纯度超过98%且保持三螺旋的天然结构。本发明的一种从猪皮中提取I型胶原的方法，该方法包括以下步骤:(1)称重:取新鲜的猪皮，准确称重，其重量作为后续处理步骤的计量依据。(2)清洗: 使用2-3倍猪皮重量的清水在常温下将新鲜的猪皮直接清洗，去除附着物。(3)冷冻:将猪皮在-20°c以下冷冻24-36小时。(4)切片:使用刀具在猪皮平面的垂直方向上将猪皮切成片状，切片厚度小于Imm0(5)打浆:向猪皮切片中加入2-4倍重量的清水，均匀悬浮后将其冷冻到0-4°C，使用匀浆机或胶体磨将切片后的猪皮处理成浆状。(6)第一次萃取:向匀浆中加入1-2倍匀浆液体积的正己烷、氯仿或石油醚等有机溶剂，在室温下震荡2-4小时，将其转移到分液器中萃取，收集水溶液；(7)第二次萃取:向步骤(6)收集的水溶液总加入1-2倍匀浆液体积的正己烷、氯仿或石油醚等有机溶剂，在室温下震荡2-4小时，将其转移到分液器中萃取，收集水溶液。(8)过滤:使用孔径为5微米的微滤膜过滤水溶液，收集透过液；(9)加盐:向步骤(8)获得的透过液中加入NaCl，控制NaCl的浓度为0.2-1.0mol/L，加入磷酸氢二钠调节pH至7.5-8.5。(10)控温:将步骤(9)获得的溶液温度准确控制在40.5±1°C。(11)酶解:向步骤(10)溶液中加1/50-1/20倍猪皮重量的蛋白酶，在40.5 土 1°C条件下酶解16-24小时，以去除非I型胶原。(12)离心:将酶解后的溶液在12000-16000r/m条件下离心，收集沉淀物。(13)洗涤:使用2-4倍沉淀物重量的去离子水将步骤(12)获得的沉淀物悬浮，离心后收集沉淀物，重复上述过程两次。(14)干燥:将洗涤后的沉淀物在_20°C冷冻，置于冷冻干燥机内干燥，干燥后的粉末即为I型胶原蛋白。
优选的，所述的步骤(4)切片过程中，使用刀具在猪皮平面的垂直方向上将猪皮切成片状。优选的，所述的步骤(6)第一次萃取过程中，直接向猪皮匀浆中加入有机溶剂。优选的，所述步骤(10 )控温过程中，溶液的温度准确控制在40.5 ± I °C。优选的，所述的步骤(11)酶解过程中，使用的酶可以是固定化酶，或在40.5 ± IV保持活性的游离酶。本发明与现有技术相比，其优点包括:(I)将猪皮切片处理后进行匀浆，有利于后续的萃取等步骤，脱脂彻底。(2)使用了固定化酶，提供了酶的耐受温度，固定化酶易于回收，有利于降低生产成本。(3)操作简便，工艺条件对仪器设备的依赖性较低，易于实现。(4)制备出的I型胶原纯度高，分子量高。
具体实施例下面通过具体实施例对本发明进行具体的描述，值得提出的是，本实施例只是用于对本发明一种实施方法，并不能代表本发明专利的全部，更不能理解为对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明实质的构思的前提条件下，还可以做出若干调整或改进，这些都属于本发明的保护范围。实施例1:( I)称重:称量新鲜猪皮1kg。(2)清洗:使用2kg的清水在常温下将新鲜猪皮正反两面清洗干净。(3)冷冻:将猪皮在-20°C以下冷冻24小时。(4)切片:将猪皮平铺在桌面，在其垂直方向使用刀片进行切片，切片厚度为
0.6mm-0.8mm。(5)打浆:向切除薄片的猪皮切片中加入4kg清水，混合均匀后将其冷冻到0_4°C，使用匀浆机将猪皮切片打成浆状。(6)第一次萃取:向匀浆中加入2L倍匀浆液体积的正己烷，震荡2小时，将悬浮液转移到分液器，收集下层溶液，收集水溶液。(7)第二次萃取:向步骤(6)获得的水相中加入2L倍匀浆液体积的正己烷，震荡2小时，将悬浮液转移到分液器，收集下层溶液，收集水溶液。(8)过滤:使用孔径为5微米的微滤膜过滤水溶液，收集透过液，获得透过液4kg ；(9)加盐:向步骤(8)获得的透过液中加入200g NaCl，加入磷酸氢二钠直至溶液pH 至 8.0。(10)控温:将步骤(8)获得的溶液转移到带夹套的搅拌釜中，准备控制搅拌釜内的温度为41 °C。(11)酶解:向步骤(10)溶 液中加300g碱性蛋白酶，在41°C条件下酶解20小时，酶法法去除非I型胶原。(12)离心:将酶解后的溶液在12000-16000r/m条件下离心，收集沉淀物，湿重
0.9kg。
(13)洗涤:使用0.9kg去离子水将步骤(12)获得的沉淀物悬浮，在室温、5000r/m条件下离心，收集沉淀物，重复上述过程两次，收集沉淀物。 (14)干燥:将洗涤后的沉淀物在_20°C冷冻，置于冷冻干燥机内干燥，干燥后获得猪皮I型胶原蛋白0.3kg。
权利要求
1.一种从猪皮中提取I型胶原的方法，其特征在于提取方法包括以下步骤: (1)称重:取新鲜的猪皮，准确称重，其重量作为后续处理步骤的计量依据。
(2)清洗:使用2-3倍猪皮重量的清水在常温下将新鲜的猪皮直接清洗，去除附着物。
(3)冷冻:将猪皮在_20°C以下冷冻24-36小时。
(4)切片:使用刀具在猪皮平面的垂直方向上将猪皮切成片状，切片厚度小于1mm。
(5)打浆:向猪皮切片中加入2-4倍重量的清水，均匀悬浮后将其冷冻到0-4°C，使用匀浆机或胶体磨将切片后的猪皮处理成浆状。
(6)第一次萃取:向匀浆中加入1-2倍匀浆液体积的正己烷、氯仿或石油醚等有机溶齐U，在室温下震荡2-4小时，将其转移到分液器中萃取，收集水溶液； (7)第二次萃取:向步骤(6)收集的水溶液总加入1-2倍匀浆液体积的正己烷、氯仿或石油醚等有机溶剂，在室温下震荡2-4小时，将其转移到分液器中萃取，收集水溶液。
(8)过滤:使用孔径为5微米的微滤膜过滤水溶液，收集透过液； (9)加盐:向步骤(8)获得的透过液中加入NaCl，控制NaCl的浓度为0.2-1.0mol/L，加入磷酸氢二钠调节PH至7.5-8.5。
(10)控温:将步骤(9)获得的溶液温度准确控制在40.5±1°C。
(11)酶解:向步骤(10)溶液中加1/50-1/20倍猪皮重量的蛋白酶，在40.5土 1°C条件下酶解16-24小时，以去除非I型胶原。
(12)离心:将酶解后的溶液在12000-16000r/m条件下离心，收集沉淀物。
(13)洗涤:使用2-4倍沉淀物重量的去离子水将步骤(12)获得的沉淀物悬浮，离心后收集沉淀物，重复上述过程两次。
(14)干燥:将洗涤后的沉淀物在_20°C冷冻，置于冷冻干燥机内干燥，干燥后的粉末即为I型股原蛋白。
2.根据权利要求1所述一种从猪皮中提取I型胶原的方法，其特征在于猪皮切片过程中，在猪皮平面的垂直方向上将猪皮切成片状，切片厚度小于1mm。
3.根据权利要求1所述一种从猪皮中提取I型胶原的方法，其特征在于酶解法去除非I型胶原过程的温度控制在40.5± 1°C。
全文摘要
本发明公开了一种从猪皮中提取I型胶原的方法，该方法首先将新鲜猪皮在-20℃以下冷冻后切片，切片厚度小于1mm，采用匀浆法将猪皮制成匀浆，使用有机溶解萃取后在40.5±1℃条件下进行酶解以去除非I型胶原，根据不同类型胶原的热稳定性差异进行选择性酶解，离心法去除酶解后的多肽，收集不溶性的固体，多次洗涤，干燥后获得猪皮I型胶原。制备的猪I型胶原纯度超过99%且保持三螺旋的天然结构。该方法具有操作简单，制备出的I型胶原纯度高和随机降解率低等优点。
文档编号C07K1/14GK103215334SQ201310173789
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者王云松, 吴士龙 申请人:河北考力森生物科技有限公司