本发明涉及一种鱼胶原蛋白的提取方法，属于天然蛋白提取技术领域。
背景技术：
胶原蛋白(collagen)是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质，在动物细胞中扮演结合组织的角色。胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸，其中维持人体生长所必需的氨基酸有7种。胶原蛋白中的甘氨酸占30%，脯氨酸和羟脯氨酸共占约25%，是各种蛋白质中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比较高。同时，还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸和在其他蛋白质几乎不存在的羟基赖氨酸。所以，胶原蛋白的营养十分丰富。鱼胶原蛋白主要是从罗非鱼、鳕鱼新鲜皮和鱼鳞中通过生物酶定向剪切技术提取得到，分子量在2000da～5000da长度之间，具有很高的消化吸收性，热稳定性极好，具有极好生物亲和性，能够很好的发挥其渗透、保湿、修复等功能。
鱼胶原蛋白主要含有i和v型胶原蛋白，分布在鱼类的皮、骨、鳞等处，是由3条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质。其主要氨基酸组成为甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丙氨酸，羟赖氨酸等，氨基酸组成与其它蛋白质有显著区别，甘氨酸的含量很高，几乎占总氨基酸残基的三分之一，即每隔2个其它氨基酸残基(x，y)即有1个甘氨酸，故其肽链可用(gly-x-y)n来表示；其所含有的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基在其它蛋白质中较为罕见。由于海洋生态环境的特殊性（如高压、低温等），使得鱼胶原蛋白在氨基酸的组成和氨基酸的序列上与陆生动物胶原蛋白相比都有一定的差异，从而使鱼胶原蛋白拥有独特生理功能和物化特性。鱼胶原蛋白易溶于中性盐溶液或稀酸，较易调制成可溶性胶原溶液，由于其鱼胶原蛋白低抗原性的特点，使其在医疗和食品业领域中更受人们欢迎。
以2009年为例，鱼类总产量为2990万t，则废弃鱼骨的数量高达1000万t，这表明鱼类产品的副产品资源十分丰富。如果将废弃鱼骨进行深加工，开发出高科技产品，挖掘渔业产品组合方案的深度，则能大大提升我国的渔业产业发展水平，进而占领更多的市场份额，具有十分广阔的发展前景。因此从鱼副产品中提取胶原蛋白不仅能够充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且可以减少环境污染，对促进鱼类加工业的发展具有重要意义。
到目前为止，国内外的研究者报道了很多胶原蛋白的提取方法。总的来说，依据提取介质的不同，鱼类胶原蛋白的提取方法可分为五类：热水法、酸法、碱法、盐法以及酶法等。不论哪种方法，其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质或基质中分离出来。在很多情况下，单一的提取方法到不到预期目标，所以在实际操作中，通常将多种提取方法相互结合。
胶原蛋白提取分离前要进行脱脂和去除杂蛋白，如果胶原蛋白中混入脂质，则最终形成乳浊状的胶原溶液，使得脂质难以去除；胶原蛋白中混入杂蛋白，会影响到后续分离提取效率，从而影响到胶原成品的纯度。脱脂在鱼胶原蛋白的提取、分离过程中非常必要，现对目前已有的鱼胶原蛋白脱脂方法包括有：(1)有机溶剂浸提法，是鱼胶原蛋白脱脂最常用的方法，溶剂可回收，节约成本，减少环境污染，目前应用较多的溶剂有甲醇、正己烷、乙醚、乙醇、异丙醇、丙酮等。例如利用乙醇、丙酮和正己烷，除去鱼皮中所含的脂肪，提高了胶原的纯度。但有机溶剂具有毒性，若去除不干净将对人体有害。(2)碱性溶液脱脂法，碱性溶液可以与脂肪发生皂化反应，有效地除去脂肪。如以鱼鳞为原料，加入碳酸氢钠溶液进行脱脂，得到低脂的鱼鳞胶原蛋白。但碱浓度必须严格控制，以免破坏鱼胶原蛋白的三螺旋结构。(3)co2超临界处理器脱脂，co2超临界处理可以避免这些缺点。用水解蛋白酶提取胶原蚤白后，水解液用co2超临界脱脂，鱼皮经处理后，不仅很大程度地降低其油脂含量，同时还达到脱腥、脱色、脱臭的效果，提高了胶原的纯度，并且可较好保持胶原的三螺旋结构。(4)脂肪酶法，主要利用脂肪酶对油脂分子的水解作用易被乳化而除去。
技术实现要素：
本发明的目的是鱼胶原蛋白在提取过程中脂类物质与蛋白分离过程中需要使用较多有机溶剂而导致的操作时间长、污染严重的问题；本发明通过采用了一种不使用有机溶剂的鱼胶原蛋白提取工艺，实现了脂肪的去除分离，技术构思主要是：首先通过在超声作用下的研磨和均浆，使鱼皮组织细胞充分破碎，使脂肪与蛋白在后续的碱处理和酶处理过程中能够更多地被去除，可以得到低脂含量的粗提物，接下来，再将粗提物溶液通过经过了亲油改性的树脂床，实现将低含量的脂类吸附的目的。
技术方案是：
一种鱼胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：
第1步，组织破碎：将鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.2～1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与nacl溶液混合，搅拌均匀后浸泡，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与碱溶液混合，搅拌均匀后浸泡，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与酸溶液混合，搅拌均匀后浸泡，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，再加入第三沉淀重量1～5%的蛋白酶进行酶解，反应结束后升温灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为0.5～1.5mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用0.5～1.5mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第1步中，鱼皮来源选自鲤鱼、鲫鱼、青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼或者罗非鱼。
所述的第2步中，nacl溶液的质量浓度4～10%，浆料与nacl溶液重量比1：5～10，浸泡时间是10～30h。
所述的第3步中，所述的碱溶液选自naoh溶液、koh溶剂、nahco3溶液或者k2co3溶液；碱溶液的质量浓度2～5%，第一沉淀与碱溶液重量比1：7～12，浸泡时间20～35h。
所述的第4步中，所述的酸溶剂选自柠檬酸、乙酸或者草酸，酸溶剂的质量浓度是5～12%，第二沉淀与酸溶液重量比1：4～8，浸泡时间是5～10h。
所述的第5步中，第三沉淀与水的重量比是1：15～35，蛋白酶是指木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶或胰蛋白酶，酶解温度是35～45℃，酶解时间是4～10h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5；灭酶是指在90～95℃下处理5～15min。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素10～15份、水150～200份、分散剂0.5～1份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯5～10份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)2～4份、交联剂0.3～0.6份、致孔剂1.5～3份、水15～20份，升温至75～85℃进行反应4～8h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
所述的分散剂是聚乙烯醇；所述的交联剂为乙二胺、丁二胺、碳化二亚胺、三羟甲基三聚氰胺、二羟甲基脲或氮丙啶；所述的致孔剂是乙酸乙酯。
所述的第6步中，树脂的体积是粗提物体积的1/40～1/20，粗提物的流速是3～5bv/h，吸附过程温度是20～35℃。
上述的除脂树脂中，主要是通过微晶纤维素作为吸脂的主体成分，通过致孔剂处理后，使其表面大孔化，同时利用甲基丙烯酸丁酯单体接枝修饰提高吸脂效果，利用甲基丙烯酸缩水甘油酯单体修饰提高对蛋白的排斥力，提高了蛋白收率。
有益效果
本发明通过采用了一种不使用有机溶剂的鱼胶原蛋白提取工艺，实现了脂肪的去除分离，技术构思主要是：首先通过在超声作用下的研磨和均浆，使鱼皮组织细胞充分破碎，使脂肪与蛋白在后续的碱处理和酶处理过程中能够更多地被去除，可以得到低脂含量的粗提物，接下来，再将粗提物溶液通过经过了亲油改性的树脂床，实现将低含量的脂类吸附的目的。制备得到的鱼胶原蛋白具有纯度高、脂肪含量少、水溶解性好的优点。
附图说明
图1是不同ph条件下的鱼胶原蛋白的溶解性图。
具体实施方式
实施例1
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.2，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与4wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：5，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是10h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与2wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：7，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间20h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与5wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：4，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是5h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：15，再加入第三沉淀重量1%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是35℃，酶解时间是4h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在90℃下处理5min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/40，粗提物的流速是3bv/h，吸附过程温度是20℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为0.5mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用0.5mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素10份、水150份、分散剂聚乙烯醇0.5份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯5份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)2份、交联剂乙二胺0.3份、致孔剂乙酸乙酯1.5份、水15份，升温至75℃进行反应4h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
实施例2
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：1，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与10wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：10，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是30h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与5wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：12，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间35h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与12wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：8，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是10h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：35，再加入第三沉淀重量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是45℃，酶解时间是10h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在95℃下处理15min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/20，粗提物的流速是5bv/h，吸附过程温度是35℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为1.5mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用1.5mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素15份、水200份、分散剂聚乙烯醇1份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯10份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)4份、交联剂乙二胺0.6份、致孔剂乙酸乙酯3份、水20份，升温至85℃进行反应8h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
实施例3
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.6，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与6wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：7，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是20h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与4wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：11，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间26h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与5～12wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：6，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是8h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是40℃，酶解时间是7h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在92℃下处理10min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附过程温度是25℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为1mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素12份、水170份、分散剂聚乙烯醇0.7份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯6份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)3份、交联剂乙二胺0.5份、致孔剂乙酸乙酯2份、水17份，升温至80℃进行反应7h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
对照例1
与实施例3的区别在于：在树脂除脂的制备中未加入单体甲基丙烯酸丁酯，其重量由甲基丙烯酸缩水甘油酯代替。
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.6，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与6wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：7，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是20h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与4wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：11，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间26h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与5～12wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：6，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是8h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是40℃，酶解时间是7h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在92℃下处理10min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附过程温度是25℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为1mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素12份、水170份、分散剂聚乙烯醇0.7份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)6份、交联剂乙二胺0.5份、致孔剂乙酸乙酯2份、水17份，升温至80℃进行反应7h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
对照例2
与实施例3的区别在于：在树脂除脂的制备中未加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯，其重量由甲基丙烯酸丁酯代替。
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.6，将混合物进行粉碎和研磨，在粉碎和研磨的同时外加超声作用，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与6wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：7，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是20h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与4wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：11，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间26h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与5～12wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：6，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是8h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是40℃，酶解时间是7h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在92℃下处理10min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附过程温度是25℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为1mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素12份、水170份、分散剂聚乙烯醇0.7份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯9份、交联剂乙二胺0.5份、致孔剂乙酸乙酯2份、水17份，升温至80℃进行反应7h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
对照例3
与实施例3的区别在于：第1步中未加入超声处理。
第1步，组织破碎：将鲫鱼鱼皮解冻之后，加入水，使鱼皮与水的重量比在10：0.6，将混合物进行粉碎和研磨，得到浆料；
第2步，去除盐溶性杂质：将浆料与6wt%nacl溶液混合，浆料与nacl溶液重量比1：7，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是20h，再经过离心处理，去除上清，得到第一沉淀；
第3步，去除脂类和碱溶性杂质：将第一沉淀与4wt%naoh溶液混合，第一沉淀与碱溶液重量比1：11，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间26h，再经过离心处理，去除上清，得到第二沉淀；
第4步，去除酸溶性杂质：将第二沉淀与5～12wt%柠檬酸溶液混合，第二沉淀与酸溶液重量比1：6，搅拌均匀后浸泡，浸泡时间是8h，再经过离心处理，去除上清，得到第三沉淀；
第5步，酶解处理：第三沉淀与水混合，第三沉淀与水的重量比是1：20，再加入第三沉淀重量3%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度是40℃，酶解时间是7h，酶解过程中通过hcl或者naoh控制反应液ph在4～5，反应结束后在92℃下处理10min灭酶，经过离心后，取上清液得到粗提物；
第6步，树脂除脂处理：粗提物送入除脂树脂床层中进行吸附处理，得到除脂液，树脂的体积是粗提物体积的1/30，粗提物的流速是4bv/h，吸附过程温度是25℃；
第7步，精制处理：除脂液中加固体nacl，使nacl浓度为1mol/l，冷冻离心得盐析后的胶原蛋白沉淀；再用1mol/l的醋酸对胶原沉淀物复溶后装袋透析除去盐离子，冷冻干燥得到精制鱼胶原蛋白。
所述的第6步中，除脂树脂的制备方法是：按重量份计，在反应釜中加入微晶纤维素12份、水170份、分散剂聚乙烯醇0.7份，加热并搅拌均匀；再在氮气气氛下，加入甲基丙烯酸丁酯6份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)3份、交联剂乙二胺0.5份、致孔剂乙酸乙酯2份、水17份，升温至80℃进行反应7h，反应结束后，将固态物依次用乙醇和水洗涤之后，真空干燥、粉碎后，得到除脂树脂。
得率测定
采用凯氏定氮法分别测定第5步得到的粗提物和精制鱼胶原蛋白中的蛋白质含量，折算为蛋白质量，计算树脂吸附得率，采用如下公式计算：
树脂吸附得率=精制鱼胶原蛋白中的蛋白质含量×精制鱼胶原蛋白重量/（粗提物中的蛋白质含量粗提物重量）×100%。
从上表中可以看出，采用树脂吸附脂类杂质时，可以保证有较多的蛋白透过树脂，使鱼胶原蛋白的摄取率较高；实施例3相对于对照例2来说，通过在树脂制备中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯可以提高对蛋白的排斥力，避免树脂吸附蛋白，使收率提高。
紫外光谱分析
采用紫外光谱分析所提胶原蛋白紫外吸收峰。用0.5m醋酸溶液溶解胶原蛋白样品，配制成浓度1mg/ml的胶原溶液。在室温下用紫外可见分光光度计测定吸光度。扫描波长范围200～400nm，波长精度1nm。
以上实施例和对照例制备得到的鱼胶原蛋白样品的最大吸收波长如下：
从上表中可以看出，最大吸收波长峰均在230nm处，符合i型胶原的特征紫外吸收。其中，实施例13中的紫外光吸收曲线上无杂峰，显示鱼胶原蛋白纯度较高。
氨基酸组成分析
胶原蛋白样品的氨基酸组成采用高效液相色谱法测定。测定条件：sopiumaminoacidanalysis色谱柱，梯度洗脱，a相为ph=3.00的0.2mol/l柠檬酸钠水溶液，b相为ph=9.80的0.2mol/l硼酸钠水溶液，洗脱液流速0.4ml/min，柱温为65℃。
羟基化率%=羟脯氨酸残基数×100/（脯氨酸残基数+羟脯氨酸残基数）
溶解性测定
氮溶解指数（nsi）可以被用来确定蛋白质水解产物的溶解性。取0.01g/ml海鲈鱼胶原蛋白肽溶液的上清液。采用全自动凯氏定氮仪测定上清液和胶原蛋白肽样品中的氮含量，得到其在各ph下的水溶性蛋白含量。绘制出nsi-ph曲线，作为不同组分胶原蛋白肽在不同ph下的溶解性指标。
氮溶解指数nsi按下式计算：
nsi（%）=a/b×100%
其中，a为上清液中蛋白质含量（g/g）；b为样品中的总蛋白含量（g/g）。
不同的ph条件下的溶解性如图1所示，从图中可以看出，实施例1～3中制备得到的鱼胶原蛋白具有较好的溶解性，说明其中杂质含量少。
溶解性数据如下表所示：
表中可以看出，实施例3相对于对照例1来说，由于未采用甲基丙烯酸丁酯单体对微晶纤维素改性处理，使得其对于脂肪的吸附性较低，导致有较多的脂肪会存在于提取得到的蛋白中，使溶解性较差。而实施例3相对于对照例3来说，由于没有采用超声对组织破碎过程进行处理，导致脂肪在后续的酸碱、酶解处理过程中不能被去除，导致后续的树脂除脂工艺负荷较大，不能完全将脂肪去除，从而导致溶解性较差。
脂肪含量测定
采用氯仿-甲醇提取法测定鱼胶原蛋白中的脂肪含量，如果如下：
从表中可以看出，采用上述工艺得到的鱼胶原蛋白具有较低的脂肪含量，实施例3相对于对照例1来说，通过甲基丙烯酸丁酯单体对微晶纤维素改性处理可以有效地提高对脂肪的去除率；同样地，采用超声预处理可以减轻后续树脂除脂工艺的负荷。