禾谷孢囊线虫Ha‑63744蛋白、编码基因及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白、编码基因及其应用。

背景技术：

小麦是我国三大重要粮食作物之一，在保障我国粮食安全方面具有举足轻重的作用。2015年我国小麦播种面积和产量分别占全国粮食作物的14.51％和20.95％。禾谷孢囊线虫(cerealcystnematodes，简称ccns)是植物内寄生线虫，ccn在世界范围内38个国家发生危害，主要危害小麦(t.aestivum),大麦(hordeumvulgare)，燕麦(avenasativa)及牧草等重要禾谷类作物。我国自从1991年首次在湖北被发现以来，在不到30年的时间内，已经在我国包括河南，河北，西藏，新疆等16个省市地区发现[pengdl,nicoljm,lih,hous,lih,chens,map,lih,andrileyit.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina.in'cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.'editeredbyitriley,jmnicolandaadababat.2009:29-34]。ccn在我国80％的小麦产区均有发生，涵盖了我国主要小麦产区,尤以黄淮麦区危害最严重，危害面积达6000余万亩，年产量损失在23％-50％以上，严重地块减产达73％-89％，甚至毁种绝收，而且有不断加速蔓延趋势[pengdl,nicoljm,lih,hous,lih,chens,map,lih,andrileyit.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina.in'cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.'editeredbyitriley,jmnicolandaadababat.2009:29-34；彭德良,subbotins,moensm.小麦禾谷孢囊线虫(heteroderaavenae)的核糖体基因(rdna)限制性片段长度多态性研究.植物病理学报.2003,33(4):323-329；赵洪海，杨远永，彭德良，刘峰.小麦禾谷孢囊线虫在山东省的分布新报道和发生特点浅析.青岛农业大学学报.2011,28(4):17-22]。目前，对小麦禾谷孢囊线虫致病机理仍不清楚，缺乏经济有效的防治方法，虽然作物轮作及生防菌的应用具有一定的防治作用，但是不够经济有效，而化学杀虫剂容易对土壤造成污染，引起环境问题。因此，针对我国小麦禾谷孢囊线虫的严重危害，开展ccn内源靶标基因，应用于线虫防控具有重要意义，并能够深入解析ccn致病和成灾机理，开发安全高效的防治方法，具有重要的理论价值和实际意义。

技术实现要素：

本发明提供一种来源于禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白，该蛋白在线虫食道腺表达，在禾谷孢囊线虫的寄生后三龄时期、四龄幼虫时期表达量较高。实验表明该基因在禾谷孢囊线虫寄生致病过程中发挥重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。

一种来源于禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

编码禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白的基因,其核苷酸序列如seqidno：2所示。

ha-63744基因特异的dsrna片段，其核苷酸序列如seqidno：3所示。

所述的禾谷孢囊线虫ha-63744蛋白在线虫防控中的应用。

所述应用，将权利要求3所述的dsrna片段取食到禾谷孢囊线虫体内，抑制禾谷孢囊线虫发育，从而防控禾谷孢囊线虫侵染寄主。

禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白，其序列如seqidno：1所示，编码该蛋白的基因序列如seqidno：2所示。植物内寄生线虫的食道腺由3个大的分泌细胞组成，两个亚腹食道腺细胞，一个背食道腺细胞，能够表达，编码产生分泌蛋白，在线虫侵入、建立并维持取食位点的过程中起重要作用。食道腺与食道腔相连，通过复杂的瓣膜阀门，控制分泌蛋白胞外分泌，通过口针释放到植物体内。本发明提供的ha-63744基因，在线虫食道腺表达，在禾谷孢囊线虫的寄生后三龄时期、四龄幼虫时期表达量较高。

含有该基因的表达载体或转基因个体包括重组表达载体、干扰载体、重组病毒、dsrna、转基因细胞系、转基因植物或组织、重组菌。含有ha-63744的基因的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等。含有ha-63744基因的载体构建过程中，可以单独或者多个组合使用诱导型、增强型、组成型、组织特异型启动子。载体可以包括抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如gus，或者发光标记蛋白，例如红色或绿色荧光蛋白，便于后续转化子的筛选。构建的载体可以转化细菌，真菌及单双子叶植物，具体可以为大肠杆菌，酵母，烟草，拟南芥及小麦，大麦。

本发明保护ha-63744蛋白在抑制孢囊线虫对植物的寄生与危害，和/或抑制孢囊线虫对植物的致病性，和/或抑制孢囊线虫发育中的应用。抑制ha-63744基因表达的物质具体可为以抑制ha-63744基因表达的干扰载体、病毒载体，以及rna。所述寄主植物具体可为小麦和大麦，例如小麦温麦19，大麦goldenpromise。

利用dsrna处理沉默ha-63744基因后，小麦根部的禾谷孢囊线虫数量明显低于对照，表明该基因在禾谷孢囊线虫寄生致病过程中发挥重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。本发明对于孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值。

附图说明

图1为ha-63744基因pcr扩增结果，扩增片段大小为558bp。

图2为ha-63744基因在禾谷孢囊线虫2龄幼虫中原位杂交分析。a：反义链杂交分析结果表明ha-63744基因由食道腺细胞分泌；b：正义链杂交分析结果为负对照。

图3为通过rt-qpcr检测ha-63744基因在5个龄期中的发育表达。相对表达分析的方法为2^-δδct法，内参基因为β-actin。侵染前2龄幼虫(prej2)的表达量设定为100％。prej2:侵染前二龄幼虫；j2,j3和j4:分别为2龄，3龄及4龄幼虫；f:雌成虫。

图4为平均每各处理禾谷孢囊线虫雌虫数量的统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本申请人的试验材料均可以对公众发放。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、ha-63744蛋白以及ha-63744基因的发现

1、收集线虫幼虫虫体(约5000头)，使用depc处理水洗2-3次，转入1.5ml离心管，加入1mltrizol(invitrogen)，液氮中速冻30s，37℃水浴30s，重复冻融4-5次，然后在室温下静置5min，提取总rna，采用dna-free^tmdnaremovalkit试剂盒去除总rna中残存的dna，反转录得到cdna。

2、以cdna为模板，采用上游引物hafull-f：5’-atgcgcgccatcctcttcct-3’；下游引物hafull-r1：5’-ctaatttgtcggttcattaatctg-3’进行pcr扩增。

上游引物hafull-f：5’-atgcgcgccatcctcttcct-3’；

下游引物hafull-r1：5’-ctaatttgtcggttcattaatctg-3’

扩增体系为10×pcrexbuffer(mg2+)，5μl；dntp(10mm)，4μl；正向引物(10mm)，反向引物(10mm)各1μl；extaq，0.5μl；cdna第一链模板，1μl；去离子水，35.5μl，总体积50μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，57℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定(图1)

3、将t载体与步骤2中的pcr扩增产物连接，然后转化大肠杆菌dh5α，测序。见seqidno：2。测序结果表明，扩增产物中具有序列表的seqidno：2所示的开放阅读框，编码序列表的seqidno：1所示的蛋白质。将序列表的seqidno：1命名为ha-63744蛋白，将其编码基因命名为ha-63744基因。

实施例2、ha-63744基因的原位杂交定位分析

以ha-63744基因克隆载体为模板通过常规pcr扩增靶标序列，以上游引物hah-f：5’-gatgcgcacaaaggagcaag-3’；下游引物hah-r：5’-tctactggtgcactgcttgg-3’，进行pcr反应，体系如下10×pcrexbuffer(mg²⁺)，2μl；dntp(10mm)，1μl；正向引物(10mm)，反向引物(10mm)各1μl；extaq，0.3μl；质粒模板，1μl；去离子水，14.2μl，总体积20μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，60℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化。以不对称pcr合成地高辛标记的正链探针和反链探针。以hah-f或hah-r为引物，以步骤1回收的目的片段为模板进行pcr扩增扩增，得到反义探针/正义探针。体系如下10×pcrexbuffer(mg²⁺)，2μl；地高辛标记的dntpmix(10mm)，1μl；正向引物(10mm)或反向引物(10mm)，2μl；extaq，0.5μl；pcr产物(上步骤获得)，2μl；去离子水，12.5μl，总体积20μl。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，60℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。按照说明书进行原位杂交。结果见图2。结果显示，反义探针有杂交信号，杂交信号位于亚腹食道腺。结果表明，ha-63744基因为亚腹食道腺细胞表达基因。

实施例3、ha-63744基因的发育表达分析

参考long等，所述方法[longh,pengh,huangw,wangg,gaob,moensm,andpengd.identificationandmolecularcharacterizationofanewβ-1,4-endoglucanasegene(ha-eng-1a)inthecerealcystnematodeheteroderaavenae.europeanjournalofplantpathology.2013,134:391-400.]，在温麦19感病小麦根部大量接种ccn二龄幼虫5d、10d、20d和30d后，采用酶裂解法分离得到侵染后j2、j3、j4和雌虫，同时收集的侵染前j2和卵。采用磁珠法分别提取6个龄期的mrna，反转录成第一链cdna作为模板，采用primer5软件设计ha-63744基因特异性引物上游引物haq-f：5’-tcgcctcaaaagcagttgtc-3’；下游引物haq-r：5’-tctgccaaatcgccattgtc-3’，采用realtimepcr相对定量技术检测靶基因在不同龄期的表达量，以actin(genbank登录号jq074059)作为内参基因，采用premixextaq^tm试剂盒(takara)，在abiprism7500荧光定量pcr仪上进行realtimert-pcr检测，分别进行三次生物学重复实验，采用2^-△△ct法分析结果，从而明确ha-63744基因在小麦禾谷孢囊线虫不同发育阶段表达特征。

反应体系(20μl)：premixextaq^tm(2×)10μl，roxdye0.4μl，上游引物(10μm)0.4μl，下游引物(10μm)0.4μl，模板1μl，ddh2o补足。反应程序：95℃30s；95℃5s、60℃31s，40个循环；95℃15s、60℃1min、95℃15s。结果见图3。相对于卵时期的表达量，ha-63744基因在寄生期二龄幼虫、四龄幼虫和成熟雌虫中表达量高。结果显示，ha-63744基因主要在禾谷类孢囊线虫寄生后期表达。

实施例4、通过体外rnai沉默ha-63744基因验证其作为靶标在抗线虫中的应用。

采用block-it^tmrnaidesigner软件设计基因特异性引物ha-if：5’-cctttggctggagatgctttg-3’，ha-ir：5’-cgccatcctcttccttaccatg-3’，5′端引入t7启动子序列taatacgactcactataggg，合成dsrna模板并纯化用于下一步实验。按照hiscribet7quickhighyieldrnasynthesiskit说明书，进行合成ha-63744基因特异的dsrna，针对egfp的dsrna及水处理为对照，采用章鱼胺与亚精胺刺激小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫摄入dsrna，将新孵化的小麦禾谷孢囊线虫j2幼虫浸泡在2mg/ml的dsrna中避光缓慢振荡36h，无菌水洗涤多次后，接种到预培养10d的感病小麦温麦19根部。每管种植3株、重复6次。平均每管接种500头，50d后，分离统计每株根系的白雌虫量,从而确定靶基因沉默后对ccn侵染和发育的影响。结果表明针对ha-63744的dsrna处理后，与对照相比白雌虫量下降70.94％(图4)，可以作为线虫防控的靶标基因。

sequencelisting

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>禾谷孢囊线虫ha-63744蛋白、编码基因及其应用

<130>pp17065-zwb

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

<213>禾谷孢囊线虫的ha-63744蛋白

<400>1

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202530

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505560

aspalalysglylyslysasplyslysglulysproglualalyslys

65707580

glylysglyalaalathrprolyslysasplyslyssergluasnala

859095

lysalaserproalalysglylyslysthrprothrlysprolysval

100105110

alaserlysalavalvalprolysalagluproalaglnasnglupro

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serseralaprovalgluthrgluglnaspglyaspaspglyileasp

130135140

thrvalasnaspileglyalaalagluaspalaalaaspasnglyasp

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leualagluaspgluleuleugluasptyrglyileserglyaspglu

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<210>2

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<213>ha-63744蛋白基因

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