防治小麦禾谷孢囊线虫病的生防菌株09b18、制备生防菌剂的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18，所述防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18为蜡质芽孢杆菌（BacillusCereus），保藏号为CGMCCNO：8632。本发明是专门针对小麦孢囊线虫病开发的生防菌剂，由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于小麦作物的无公害生产，农民可以不用或者少用其他化学农药的用量，这样不仅可以为农民节省开支，而且有利于提升粮食品质。防治试验验证了09B818菌剂对小麦孢囊线虫病具有较好的防治效果，在室内和田间试验中孢囊减退率分别达到75.9%和43.47%。同时，该菌剂还有增产功能，可以为农民增加收入。
【专利说明】防治小麦禾谷孢囊线虫病的生防菌株09B18、制备生防菌剂的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物保护领域，涉及一种防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18及
其应用。
【背景技术】
[0002]禾谷孢囊线虫病(Cereal Cyst Nematode, CCN)是一种危害严重的全球性植物线虫病害，也是近年来我国发生的一种新的小麦土传病害。病原为小麦禾谷孢囊线虫{Heterodera avenae group),属线虫纲,垫刃线虫目，异皮线虫科,异皮线虫属，为害小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物和紫羊茅、牛尾草、羊茅等40余种牧草。病原线虫主要危害小麦的根部，侵入小麦根系并在其中繁殖，使根系形成球瘤状根结，从而抑制植株对营养的吸收，造成小麦地上部分叶片发黄，植株矮化，最终影响产量。
[0003]国内外对于小麦禾谷孢囊线虫病的防治主要措施有:采取与非寄主作物的轮作；种植抗耐病性品种；使用有效的杀线虫化学药剂等综合有效的防治措施，来控制小麦禾谷孢囊线虫病的危害。但是在我国广大小麦种植区，与非寄主作物的轮作往往因为多种原因难以大面积实施；一些研究发现，我国生产上大面积推广的小麦品种中对小麦禾谷孢囊线虫的抗病品种很少，大多数品种属于感病或高感品种；化学农药的筛选虽然取得了一些进展，但能够有效防治小麦禾谷孢囊线虫病的药剂毒性大、成本高等原因，从而受到很大程度的限制，生物防治因为自身的优点受到越来越多的重视，但如今对小麦禾谷孢囊线虫的生物防治研究方面报道还是很少，针对我国小麦禾谷孢囊线虫病防治中存在的问题及生产的需要，开发高效稳定且能够大规模生产的生防制剂是可持续农业发展的需求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中没有对小麦禾谷孢囊线虫病有较高防效的生防制剂的现状，提供开发一种防治小麦禾谷孢囊线虫病的单一生防菌株及其菌剂，该菌剂对小麦禾谷孢囊线虫的室内防治效果达到70%以上。一种防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18，所述防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18，分类命名:蜡质芽孢杆菌，拉丁文学名-Jiacillus Cereus。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位简称:CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2013年12月23日，保藏号为CGMCC NO:8632。
[0005]本发明的技术方案是:所述的防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18制备生防菌剂的方法，09B18菌株在LB培养液中30°C，180rpm震荡培养32-36小时，然后将培养液用无菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO8-1 X 109CFU/ml，制成生防菌剂。
[0006]所述的生防菌剂在防治小麦孢囊线虫病中的应用。
[0007]所述的生防菌剂在小麦增产中的应用。
[0008]所述的生防菌剂进行8-10 ml/kg拌种处理。[0009]本发明的有益效果是:本发明是专门针对小麦孢囊线虫病开发的生防菌剂，由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于小麦作物的无公害生产，农民可以不用或者少用其他化学农药的用量，这样不仅可以为农民节省开支，而且有利于提升粮食品质。防治试验验证了 09B818菌剂对小麦孢囊线虫病具有较好的防治效果，在室内和田间试验中孢囊减退率分别达到75.9%和43.47%。同时，该菌剂还有增产功能，可以为农民增加收入。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为09B18菌落特征；
图2为09B18菌体及芽孢(革兰氏染色为紫色)；
图3为09B18菌体电镜照片；
图4为菌株09B18基于16s-rRNA序列同源性的系统发育树。
【具体实施方式】
[0011]一种防治小麦禾谷孢囊线虫病的单一生防菌株及其菌剂，该菌剂对小麦禾谷孢囊线虫的室内防治效果达到70%以上。一种防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18，所述防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18,分类命名:腊质芽孢杆菌,拉丁文学名'BacillusCereus0保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称:CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期:2013年12月23日，保藏号为 CGMCC NO:8632。
[0012]所述的防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18制备生防菌剂的方法，09B18菌株在LB培养液中30°C，180rpm震荡培养32-36小时，然后将培养液用无菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO8-1 X 109CFU/ml，制成生防菌剂。
[0013]所述的生防菌剂在防治小麦孢囊线虫病中的应用。
[0014]所述的生防菌剂在小麦增产中的应用。
[0015]所述的生防菌剂进行8-10 ml/kg拌种处理。
[0016]菌株来源:生防菌株09B18，2009年7月由许昌小麦孢囊线虫病田中的孢囊上分离得到。
[0017]菌株分离方法:将取来的孢囊用70%的酒精消毒3min，再用1%的次氯酸钠消毒Imin,用无菌水冲洗3次，把孢囊在灭过菌的玻片上压破，转移到牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏 3g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 5g/L，琼脂 18g/L，pH=7.4-7.6)进行分离，25°C培养 48h 后，在无菌条件下用挑针挑取孢囊边缘细菌菌落进行划线分离并纯化，4°C冰箱中保存。
[0018]菌株筛选依据:对小麦孢囊线虫二龄线虫(J2)的致死作用，具有方法如下，将分离到的细菌菌株的培养液200ul加入50ul线虫液(2000条/ml)，同时设空白液体培养基做对照，放入15°C培养箱中，24h和48h后观察线虫的死亡情况，用NaOH确定线虫的死活，将24后校正死亡率为83.22%，48h后校正死亡率为100%的处理的菌株命名为09B18。
[0019]菌株鉴定方法:鉴定方法为结合形态学鉴定，分子生物学鉴定及生理生化特征分析。
[0020]形态学鉴定:在PDA培养基(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉18 g/L)上可形成圆形或近圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落。菌落大，表面粗糙，扁平，不规贝U。无荚膜，菌体呈不规则杆状，直或接近直。菌体大小(1-1.2) X (3-5) um。单个存在或2-3个相连结，少数呈短链排列。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，革兰氏染色为阳性。
[0021]生防菌株09B18的分子生物学鉴定:用细菌基因组试剂盒提取细菌基因DNA后，利用 16s-rRNA 通用引物 fxj-f 5，AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3，和 fxj-r 5，AGA AAGGAG GTG ATC CAG CC3’进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化后，将DNA片段连接到PMD19，然后将连接产物转化到感受态细胞中，进行阳性克隆的筛选，将白色克隆挑入添加氨苄的LB培养液中培养，菌液送上海生物工程技术服务有限公司测序，将测定结果提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)登录(登录号:KC814716)并进行比对，与登录号为FJ982658饱Bacillus cereus 16s_rRNA基因比对，序列相似度为99%。
[0022]生防菌株09B18的生理生化特征:对菌株09B18的生理生化特征进行鉴定，发现09B18菌株无伴孢晶体，含过氧化氢酶，卵磷脂酶，溶菌酶，能够水解淀粉，能够利用柠檬酸盐，丙酸盐和葡萄糖，能够还原硝酸盐。与蜡质芽孢杆菌的生理生化特征一致。综上，将09B18鉴定为腊样芽胞杆菌Cfeci77w5.cereus )?
[0023]09B18生防菌剂的制备方法:将生防菌株09B18在LB (牛肉膏3g/L，蛋白胨IOg/L，NaCl 5g/L，pH=7.4-7.6)培养液中30°C，180rpm震荡培养32-36小时，然后将培养液用无菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO8-1 X 109CFU/ml。
[0024]09B18对小麦孢囊线虫的温室防治效果
从许昌地区发生小麦禾谷孢囊线虫病的田块中采集土壤，过筛后与灭菌土按1:0.5混合(25-30个孢囊/100 g)，然后将土装于纸杯中，每杯装病土 200 _230g。供试小麦品种为对小麦孢囊线虫病高感的温麦19，利用制备好的生防菌剂8-10ml/kg进行拌种处理，种植于小纸杯中，每纸杯播种6粒，同时设不接菌的病土处理为阴性对照,60%阿维菌素6ml/kg拌种处理作为药剂对照，6次重复，15-20°C温室中培养，90天后，调查发病情况。
[0025]将植株从纸杯中取出，并且尽可能保持根系完整。讲取出的植株根系用自来水冲洗干净，放在盛有清水的塑料盆中进行调查单株孢囊数，计算孢囊减退率。
[0026]孢囊减退率(％)=(对照单株孢囊数一处理单株孢囊数)/对照单株孢囊数X 100% 表1 09B18生防菌剂对小麦禾谷孢囊线虫病室内防治效果测定
【权利要求】
1.一种防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18，其特征在于:所述防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18为蜡质芽孢杆菌心Cferem)，保藏号为CGMCC NO:8632。
2.如权利要求1所述的防治小麦禾谷孢囊线虫的生防菌株09B18制备生防菌剂的方法，其特征在于:09B18菌株在LB培养液中30°C，180rpm震荡培养32-36小时，然后将培养液用无菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为I X IO8-1 X 109CFU/ml，制成生防菌剂。
3.如权利要求2所述的生防菌剂在防治小麦孢囊线虫病中的应用。
4.如权利要求2所述的生防菌剂在小麦增产中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的生防菌剂进行8-10ml/kg拌种处理。
【文档编号】A01C1/06GK103789233SQ201410016968
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】张洁, 李洪连, 李永辉, 袁虹霞, 邢小萍, 胡艳峰 申请人:河南农业大学