专利名称：小麦禾谷孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法
小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法技术领域
本发明属生物技术领域，涉及小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性 SCAR标记引物序列及小麦禾谷孢囊线虫SACR特异性标记快速PCR检测方法。
背景技术：
小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae ；俗名 Cereal Cyst Nematode,CCN)是温带禾谷作物上的世界性重要病原线虫，自1874年在德国被发现以来，随后在英国、俄罗斯、 挪威、澳大利亚、加拿大、美国、中国等40多个国家均发生不同程度的危害，严重影响禾谷作物尤其是麦类作物的产量和质量。我国自1989年彭德良等首次在湖北省天门县发现小麦禾谷孢囊线虫为害小麦后，目前已发现在湖北、河南、河北、北京、山东、山西、内蒙古、青海、江苏、安徽、甘肃、陕西、宁夏等13省市都有禾谷孢囊线虫的分布。因此，该线虫已成为严重威胁我国小麦生产的主要病害。
在为害小麦的孢囊线虫中，主要有禾谷孢囊线虫(H. avenae)，菲利普孢囊线虫 (H. filipjevi)，大麦孢囊线虫(H. Iatipons)三个种，它们具有很相似的形态学结构，形态学特征差异较小。目前孢囊线虫的鉴定大部分依赖于传统的形态学鉴定方法，耗时较多且需要很熟练的专业技术，通常需要专门从事分类的人员来完成，从而给危害小麦的孢囊线虫鉴定增加了难度。
以PCR为基础的分子生物学手段为解决线虫快速鉴定中存在的问题提供了工具。随着PCR检测技术的发展，线虫的分子诊断取得重要进展。Mulholland等(1996)分别构建了基于rDNA-ITS的马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫 (G. pallida)的特异性引物，描述了这两种线虫的特异性多重PCR检测技术，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了 3个引物，通用引物5. 8S rRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITSl-Gr和马铃薯白线虫的特异性引物ITSl-Gp。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。Bulman和Marshall (1997)在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSrf 和白线虫的特异性引物PITSp4，应用多重PCR技术可以快速诊断马铃薯孢囊线虫。通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，通用引物ITS5与PITSp4 可以扩增出265bp马铃薯白线虫的特异性片段。在一个PCR反应中，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。
Amiri和Subbotin等Q002)构建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊线虫 (H. schachtii)特异性引物SHF6.特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时与通用引物D2A和D!3B放在一个PCR反应体系中进行一步双重PCR，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，甜菜孢囊线虫群体中可以扩增200bp特异性片段，而非甜菜孢囊线虫中不能扩增出200bp的片段。
彭德良和SiAbotin等Q001)构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyFl，应用两组引物D3A和D!3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl和引物rDNA2 成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。内标引物D3A和D!3B是保证DNA的有效性， 第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双重PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都能扩增ISlbp的大豆孢囊线虫的特异性DNA片段，而在所有测试的其他8种孢囊线虫22个群体不能扩增出ISlbp的特异性片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆谷孢囊线虫种特异性片段。
此外，国外有一些基于基因组DNA的SCAR标记用于植物线虫特异性检测的报道。 在马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的快速分子诊断中，Fullanodo等(1999)用RAPD随机引物0PG5分别扩增出马铃薯金线虫特异性片段826bp，马铃薯白线虫特异性片段llOObp。对扩增出的片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计马铃薯金线虫的SCAR 标记特异性引物FullGrf和FullGn ，扩增出了 315bp的特异性片段；设计马铃薯白线虫的 SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，扩增出79^ρ的特异性片段，从而可以快速检测马铃薯金线虫和马铃薯白线虫。
Ou, S. Q. Peng D. L.(欧师琪彭德良等2008)采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了大豆孢囊线虫特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI，可扩增出473bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR标记片段，选用核糖体引物D2A和D!3B作为内标与上述特异性引物SCNFl和SCNRl相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，PCR产物可获得47!3bp的特异性片段和SOObp的内标片段，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了 473bp的特异性SCAR标记片段和SOObp片段。
国内外关于小麦禾谷孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域有一些研究。主要集中在 ITS序列特征、利用限制性内切酶分析ITS区酶切片段的长度多态性等方面，但未见基于基因组DNA的SCAR标记引物特异性检测小麦禾谷孢囊线虫的报道。因此，开发小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记，建立快速PCR检测方法，对于快速准确鉴定小麦禾谷孢囊线虫的种类，明确其发生与分布特征，制定相应的防控措施等具有重要意义。发明内容
针对上述技术领域的空白，本发明提供小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的全长序列，同时提供了 SCAR标记的特异性引物。
本发明还提供小麦禾谷孢囊线虫特异性SACR快速PCR检测方法，将为制定线虫的快速分子检测方法，开展小麦禾谷孢囊线虫病的早期诊断，制定其综合治理对策提供理论依据。
小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于具有如SEQ ID NOl 所示的核苷酸序列。
根据小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的特异性引物。
优选为HaFl和HaRl，其序列为
HaFl :5’ -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3，
HaRl :5，-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，
小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述特异性引物。
优选所述PCR反应体系中含有特异性引物HaFl和HaRl。
本发明利用RAPD技术，获得了基于小麦禾谷孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD 标记，将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆、测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列 SEQ ID N01，利用该SCAR标记的保守序列可以设计出其特异性引物，用于PCR检测出目标线虫。
本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HaFl和HaRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用小麦禾谷孢囊线虫特异性引物HaFl和HaRl，在PCR扩增条件下，所有小麦禾谷孢囊线虫群体都获得了 IOlObp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有IOlObp的特异性SCAR标记片段。本发明构建的特异性引物HaFl和HaRl，特异性强，准确性好，灵敏度尚。
本发明应用特异性SCAR标记PCR技术检测目标线虫，与随机扩增多态性DNA技术 (RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性片段长度多态性技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更省时、更准确、更灵敏，能够更加快速、准确地检测小麦禾谷孢囊线虫。该技术可应用于携带小麦禾谷孢囊线虫的田间土壤样品及植株的早期快速分子检测，具有较高的实用价值。
图1 用随机引物0PD13扩增的小麦禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫大麦孢囊线虫、马铃薯腐烂茎线虫的RAPD的多态性结果。
M为标准的DNA分子质量标记(DNA markerDL 2,000) ； 1_6为小麦禾谷孢囊线虫群体(编码为HaOl，Ha03, Ha07, Hal2, Hal7, Ha 18) ；7-8为菲利普孢囊线虫群体(编码为 HfOl, Hf04) ；9为大豆孢囊线虫群体(编码为HgOl) ； 10为旱稻孢囊线虫(编码为HeOl)； 11为大麦孢囊线虫群体(编码为H101) 12为马铃薯腐烂茎线虫群体(编码为DdOl) ；13为阴性对照(群体代码及来源见表1和表2)
图2 小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记特异性引物扩增检测的特异性DNA片段M为标准的DNA分子质量标记(DNA markerDL 2，000) ； 1_8分别为小麦禾谷孢囊线虫8个不同群体(编码为HaOl, Ha03, Ha07, Ha08, HalO, Hall, Hal2，Ha 17) ；9为菲利普孢囊线虫群体 (编码为HfOl) ；10为大豆孢囊线虫群体(编码为HgOl) ；11为旱稻孢囊线虫群体(编码为HeOl) ；12为为大麦孢囊线虫群体(编码为H101) 13为马铃薯腐烂茎线虫群体(编码为 DdOl) ；14为阴性对照(群体代码及来源见表1和表2)
图3 小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记特异性引物的灵敏度检测
M 为标准的 DNA 分子质量标记(DNA marker DL 2,000) ； 1-7 分别为 1，10、IOO"2, 0_3，IO-4, IO-5, IO-6μ 1小麦禾谷孢囊线虫单个孢囊的DNA ；8为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明的实验选用的材料
16个小麦禾谷孢囊线虫群体为本实验室长期从山东省、青海省、河南省、甘肃省、 安徽等地收集且在小麦上进行繁殖的孢囊线虫种群，11个菲利普孢囊线虫群体为本实验室从河南等省市收集保存，2个小麦禾谷孢囊线虫国外群体，3个菲利普孢囊线虫国外群体以 及其他线虫群体为本实验室工作人员收集(表1、表2〉。上述样本本实验室均有保存，可以 对公众发放。
〔0030〕 表1供试小麦禾谷孢囊线虫及其它线虫样品代码及群体来源 〔0031〕
权利要求
1.小麦禾谷孢囊线虫特异SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有SEQIDNOl所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。
3.权利要求2所述的特异性引物，其为HaFl和HaRl，其序列为HaFl :5’ -TGACGAGAACATATGATGGGGAT-3’，HaRl :5’ -GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3，。
4.小麦禾谷孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求2或3所述的特异性引物。
全文摘要
本发明为“小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法”，属生物技术领域。小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。根据小麦禾谷孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的特异性引物HaF1和HaR1，在PCR快速检测小麦禾谷孢囊线虫的方法中，可扩增出1010bp的特异性片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在小麦禾谷孢囊线虫检测和小麦孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/11GK102559669SQ201210032018
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者亓晓莉, 彭德良, 彭焕, 贺文婷, 黄文坤 申请人:中国农业科学院植物保护研究所