专利名称：辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一种方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种辅助鉴定大豆百粒重相关位点的ー种方法及其专用引物。
背景技术：
基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异大豆新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR 的分子标记如微卫星或SSR(simple sequence repeat)等具有多态率高、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因(或称胶上选择)，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为大豆等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得足够多的与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。大豆籽粒产量=単位面积株数X单株粒数X粒重。因此，荚粒数、粒大小(粒长、 粒宽)、单株英数/粒数及单株粒重等均与籽粒产量密切相关。大豆产量构成因素都是由许多微效基因或QTL控制的复杂数量性状，遗传カ大都较低。但大豆百粒重(是指100粒大豆种子的重量，其数值的高低直接反映籽粒体积的大小)在产量构成因素中是ー个确定的重要数量性状，品种之间差异明显，遗传力比较高(55%左右)，以加性遗传效应为主，在产量性状中其遗传规律相对简単，主要受少数主基因与若干微效基因共同控制。在大豆荚粒数性状方面，朱保葛等通过诱变方法筛选到个发生単位点突变的多粒荚(即4粒荚)突变系，使得复杂的数量遗传性状转变为简单的质量遗传性状，便于分子标记与定位分析，并利用所创造的近等基因系NILfcear isogenic line)材料研究表明，该位点能使大豆植株的4粒荚比率至少提高15%，并发现与突变位点相连锁的4个SSR标记 (位于其两侧)，两侧标记Sat_107和Satt491 (3. 2cM和4. 2cM)已经成功地用于高产材料的辅助选择。
发明内容
本发明的目的是提供辅助鉴定大豆百粒重相关位点的ー种方法及其专用引物。本发明提供的辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE070a引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个特异DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重性状的大豆；所述GNE070a引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对；所述特异DNA片段的大小为；所述高百粒重性状为籽粒百粒重彡25. 0克的性状。所述方法可用于大豆育种。具体来说，可将所述候选的具有高百粒重性状的大豆用于所述育种。本发明还提供了ー种辅助鉴定大豆高百粒重性状的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE070a引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个特异DNA片段的待测大豆具有高百粒重的性状；所述GNE070a引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对；所述特异DNA片段的大小为 275bp-285bp ；所述高百粒重性状为籽粒百粒重彡25. 0克的性状。所述方法可用于大豆育种。具体来说，可将具有所述高百粒重性状的大豆用于所述育种。本发明还保护序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对 (GNE070a 引物对)。所述引物对的功能为如下(a)和/或(b)(a)辅助鉴定大豆百粒重性状；(b)辅助筛选具有高百粒重性状的大豆；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0 克的性状。从实际应用角度出发，所述(a)中，GNE070a引物对主要用于辅助鉴定大豆的高百粒重性状；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0克的性状。所述引物对在制备试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的功能为如下(a)和/或(b)(a)辅助鉴定大豆百粒重性状；(b)辅助筛选具有高百粒重性状的大豆；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0 克的性状。从实际应用角度出发，所述(a)中，所述试剂盒主要用于辅助鉴定大豆高百粒重性状；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0克的性状。本发明还保护ー种试剂盒，包括所述引物对。所述试剂盒的功能为如下(a)和/或(b)(a)辅助鉴定大豆百粒重性状；(b)辅助筛选具有高百粒重性状的大豆；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0 克的性状。从实际应用角度出发，所述(a)中，所述试剂盒主要用于辅助鉴定大豆高百粒重性状；所述高百粒重性状为籽粒百粒重> 25. 0克的性状。由于大豆的百粒重性状与大豆产量密切相关，所述方法、所述引物对和所述试剂盒均可应用于大豆育种(如高产大豆育种)。本发明同时发现一个控制大豆百粒重性状的相关位点(hswl)，被定位于大豆分子遗传图谱的A2连锁群，与EST-SSR功能标记GNE070a之间的遗传距离为2. 8cM。本发明发现，GNE070a引物对可用于选择大豆的百粒重相关位点，并且得到了ー个百粒重相关位点(高百粒重相关位点，hswl)，通过该位点可以辅助筛选高百粒重性状的大豆材料。从而，应用GNE070a引物对可以辅助筛选大豆的百粒重性状(特別是高百粒重性状)和不同百粒重性状(特別是高百粒重性状)的大豆。因此，本发明的引物对可以应用于培育具有高产性状的大豆品种。
本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用GNE070a引物对对大豆高百粒重相关位点进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出籽粒较大的高产大豆材料。本发明可应用于大豆高产育种，以提高育种效率和大豆产量水平。
图1为大豆百粒重性状相关位点hswl的定位情況。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、大豆百粒重相关位点(高百粒重相关位点)hswl的获得一、引物合成GNE070引物对序列获自S0YBASE数据库；上游正向引物序列为 5，-TGCTTTCCTCTATTGGTTGT-3，；下游反向引物序列为5，-TCTTTCTCTGATCCATCACC-3，，委托北京奥赛博生物公司合成。ニ、双亲基因组扩增检测用于创建大豆重组自交系(recombinant inbred line，RIL)群体的双亲分别是中黄4 (国家大豆种质资源库)和中品661 (国家大豆种质资源库)。中黄4为母本，其籽粒体积较大02. 0-26. 5克/百粒)；中品661为父本，其籽粒体积较小(17. 7-19. 5克/百粒)。采用CTAB法提取双亲叶片的基因组DNA，以GNE070a引物对进行扩增实验。PCR 反应体系(20 μ 1) 10 X Buffer 2 μ 1 (含 Mg2+)，dNTP 0. 4 μ 1 (IOmM)，上游正向引物(5 μ Μ) 和下游反向引物(5μΜ)各2μ 1，基因组DNAGOng/μ 1)1μ l，Taq酶(5U/μ 1) 0. 5 μ 1，其余为 ddH20，滴加一滴矿物油覆盖。PCR 反应程序:94°C 5min ；94°C 60s,53. 5°C 60s,72°C 60s， 35 个循环；72°C IOmin。PCR扩增产物用9%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯下观察拍照。结果显示，GNE070a引物对的扩增产物在双亲基因组之间呈现多态性。三、群体扩增检测及连锁分析定位用以上两个亲本进行杂交，得到杂种F1,通过“单粒传”法构建群体，获得475个F12 代重组自交系。“单粒传”法步骤如下在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成ー个F1代单株，其自交(即自花授粉)结实收获1株F2代种子，后者种植长成ー个包含分离性状的F2代株行，它的每ー单株自交结实收获F3代种子，将分离的同类性状植株单收并脱粒装袋，每株种子次年单独种植ー个F3株行，自交结实收获F4代种子，……，直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、 纯化、种植、选育及鉴定等程序，最终发展成ー个由数百个甚至数千个重组自交系构成的大群体，即为“单粒传”法构建群体。其特征是各家系内不同植株之间的性状稳定一致，而家系间的性状差异较大。用GNE070a引物对逐一扩增群体中所有株系的基因组DNA，结合计算机作图软件 (MAPMAKER/EXP VER 3. 0和WINQTLCART VERSION 2. 5)分析，确定了一个百粒重性状相关位点，将其命名为hswl，被定位于大豆分子遗传图谱的A2连锁群，与其连锁标记GNE070a间的遗传距离为2. ScM(见图1)。实施例2、GNE070a引物对的扩增产物与粒重性状的相关性验证实验样本为48份大豆植物材料(纯合品种或品系)。采用CTAB法分别提取每份大豆植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板采用 GNE070a引物对进行PCR扩增实验。PCR反应体系じ0 μ 1) =IOXBuffer 2μ 1 (含Mg2+)，dNTP (IOmM)O. 4 μ 1，上游正向引物(5μΜ)和下游反向引物(5 μ Μ)各2 μ 1，基因组DNA^Ong/ μ 1)1 μ 1，Taq酶(5U/μ 1) 0. 5 μ 1，其余为ddH20，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序 940C 5min ；94°C 60s,53. 5°C 60s,72°C 60s，35 个循环；72°C IOmin0PCR扩增产物用9%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯下观察。回收PCR扩增产物并测序。也可以采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，观察相应的特异片段。对48份植株所结的籽实进行百粒重称量(设置三次重复试验，结果取平均值)，该 48份大豆根据籽实的百粒重可以划分为两组36份为大粒组(百粒重> 25. 0克)，12份为小粒组(百粒重< 17.3克)，详见表1。表1大粒组与小粒组大豆材料的百粒重和PCR扩增产物测序得到的大小
权利要求
1.ー种辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用GNE070a引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个特异 DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重性状的大豆；所述GNE070a引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对；所述特异DNA片段的大小为 275bp-285bp ；所述高百粒重性状为籽粒百粒重彡25. 0克的性状。
2.ー种辅助鉴定大豆高百粒重性状的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA 为模板，用GNE070a引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个特异DNA片段的待测大豆具有高百粒重的性状；所述GNE070a引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对；所述特异DNA片段的大小为；所述高百粒重性状为籽粒百粒重彡25. 0克的性状。
3.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物对。
4.权利要求3所述引物对在制备试剂盒中的应用。
5.包括权利要求3所述引物对的试剂盒。
6.权利要求1所述方法在大豆育种中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于将所述候选的具有高百粒重性状的大豆用于所述育种。
8.权利要求2所述方法在大豆育种中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于将具有所述高百粒重性状的大豆用于所述育种。
10.权利要求3所述引物对或权利要求5所述试剂盒在大豆育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一种方法及其专用引物。本发明提供了辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的一种方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，用序列1和序列2所示DNA组成的GNE070a引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中具有一个特异DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重性状的大豆；所述特异DNA片段的大小为275bp-285bp。本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用专用引物对对大豆高百粒重相关位点进行早期世代选择鉴定而缩短育种周期，从而快速筛选出籽粒较大的高产大豆材料。本发明可应用于大豆高产育种，以提高育种效率和大豆产量水平。
文档编号C12N15/11GK102534026SQ201210031778
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者任海红, 周国安, 朱保葛, 李素坤, 杨瑞, 潘毅 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所