专利名称：一种草鱼基因组dna快速提取方法
技术领域：
本发明涉及一种动物组织DNA提取的方法，更具体的说涉及一种草鱼基因组DNA 的提取方法。
背景技术：
基因组DNA提取作为一项最基础的分子生物学技术，是开展诸多分子生物学研究的成功保证。对于水产动物育种研究，基础群体遗传多样性研究及早期选育工作，要求尽量保证在不处死并需要大量的研究个体。伴随高通量测序技术及各种基因芯片的发展应用， 大规模基因组DNA的提取已成为现在科研工作的必要，而目前许多DNA提取方法已经不能很好的满足这种要求。常规使用的酚/氯仿的基因组DNA提取方法，不仅操作复杂、耗时长，而且抽提过程中多次使用挥发性试剂，并产生大量的有毒废液，既不安全也不环保。而采用试剂盒进行大规模提取DNA，昂贵的价格不适于大规模作业。本发明提供一种简便快捷并健康安全的草鱼基因组DNA的提取方法。发明内容DNA本发明的目的是提供一种草鱼基因组DNA的快速提取方法，以克服现有DNA提取方法存在的缺陷，本发明的提取方法操作简单，快速、安全。为实现本发明的目的，本发明的技术方案是一种草鱼基因组DNA提取方法，包括以下步骤1)裂解草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中，加入裂解液，颠倒混勻，45-65°C下，裂解1-2. 5小时至澄清得草鱼鳍条组织裂解液，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；2)离心将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；3)吸附吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置2-^iin后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；4)漂洗向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；5)溶解将漂洗后的吸附柱放置在无菌离心管中，静置l-2min，加入无菌水，静置 2-^iin后离心，离心管中即为收集的DNA。在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中裂解液由PH值为8.0，摩尔浓度为IM 的1Tris -HCl水溶液，pH值为8. 0，摩尔浓度为0. 5M的EDTANa2水溶液，质量含量为10%的 SDS水溶液，无菌水，蛋白酶K按体积比5 20 10 64 1混合而成。在本发明的一优选实施例中，所述步骤1)中裂解液的其用量为lmg鳍条组织加入20 μ 1裂解液。在本发明的一优选实施例中，所述步骤3)中NaAc溶液为3Μ，冰醋酸调节pH值至
5 · 2 ο在本发明的一优选实施例中，所述步骤4)中洗涤液由pH值为7. 4，摩尔浓度为IM的Tris -HCl水溶液，pH值为8. 0，摩尔浓度为0. 5M的EDTA水溶液，无水乙醇，无菌水按体积比4 1 350 235混合而成。在本发明的一优选实施例中，所述步骤4)中洗涤液的体积为步骤幻中加入到吸附柱中上清液体积的1-3倍。在本发明的一优选实施例中，所述步骤幻中无菌水的体积为步骤幻中加入到吸附柱中上清液体积的0. 5-1. 2倍。在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)-5)中，离心温度为4_8°C下，离心转速为 3000-5000rpm，离心时间为 l_5min。本发明的草鱼基因组DNA提取方法与传统的酚/氯仿的基因组DNA提取方法相比，不仅操作简便、耗时短，减低繁琐操作导致出错的概率，而且抽提过程中避免了使用大量的有毒试剂，更加健康环保；与试剂盒提取基因组DNA的方法相比，本发明的方法成本大大降低。
图1是本发明的方法和传统酚/氯仿法提取的草鱼基因组DNA电泳结果，其中1-4 为本发明的方法提取获得的DNA样，5-8为传统酚/氯仿法提取获得的DNA样，M为分子量标准D2000。图2是本发明的方法和传统酚/氯仿法提取的草鱼基因组DNA的PCR扩增产物电泳结果，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以传统酚/氯仿法提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。图3本发明的方法和DNA提取试剂盒提取的草鱼基因组DNA电泳结果，其中1_4 为本发明的方法提取获得的DNA样，5-8为DNA提取试剂盒提取获得的DNA样，M为分子量标准D2000。图4是本发明的方法和DNA提取试剂盒提取的草鱼基因组DNA的PCR扩增产物电泳结果，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以DNA提取试剂盒提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。
具体实施例方式下面通过实施例和对比例进一步说明本发明。在以下实施例和对比例中，所用IM Tris · HCl (pH7. 4和pH8. 0)溶液通过如下方法制备121. Ig Tris碱于 800ml水中溶解，加入浓HCl调节pH值至所需值(ρΗ7· 4，HCl 70ml ；pH8. 0，HCl 42ml)，冷却至室温后调节PH值，加水定溶至1L，分装后高压灭菌；所用0. 5M EDTANa2 (pH8. 0)溶液通过如下方法制备在800ml水中加入186. Ig 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2 ·Η20)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8. 0 (约需20gNa0H颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用；所用10% SDS (pH7. 2)溶液通过如下方法制备称取IOOg电泳级SDS在900ml水中溶解，加热至68°C助溶，加入几滴浓盐酸，调节溶液的PH至7. 2，加水定容至1L，分装后备用；所用0. 5M EDTA (pH8. 0)溶液通过如下方法制备在800ml水中加入146. Ig乙二胺四乙酸，剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8. 0 (约需20gNa0H颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用；所用裂解液(500μ 1)体系由 25 μ 1 IM Tris · HCl (pH 8. 0), 100 μ 1 0. 5Μ EDTANa2 (ρΗ8. 0), 50 μ 1 10% SDS, 320 μ 1 无菌水，5 μ 1 蛋白酶 K 组成；所用洗涤液(500μ 1)体系由 4μ1 IM Tris · HCl (pH 7· 4)，1 μ 1 0. 5Μ EDTA (ρΗ8. 0)，350 μ 1无水乙醇，235 μ 1无菌水组成；所用3Μ NaAc (pH 5. 2)溶液可通过如下方法制备称取40. 8gNaAc · 3H20,加水定溶至100ml，用冰醋酸调节pH至5. 2 ；所用NaAc溶液滤洗吸附柱的过程为向吸附柱加入300 μ 1 3Μ NaAc (pH 5. 2)溶液，下面附收集管，静置anin，4000rpnK4°C )离心lmin，弃去收集管中废液；所用蛋白酶K，硅胶膜离子吸附柱及收集管子等试剂耗材购置于天根生化科技 (北京)有限公司。所用2XTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1由天根生化科技有限公司生产。所采用微卫星引物序列信息为(XiaJ. H. et al. A consensus linkage map of the grass carp (Ctenopharyngodon idella)based on microsatellites and SNPs. BMC Genomics 2010,11 :135.)CID1528F GCTGGTTTAAACAGGCACACCTTC ；CID1528R :TTGGGACGGAAAGCTGCTCTG。实施例1用本发明的方法提取草鱼基因组DNA1)剪取约25mg鳍条组织，无菌水清洗，用滤纸吸干水分，剪成小碎块，置于1. 5ml 无菌离心管中，加入500 μ 1裂解液，颠倒混勻，55°C水浴锅或摇床，裂解1. 5-2小时至澄清， 裂解过程将离心管来回颠倒数次；2)取出以上步骤1)的裂解液，在离心机上4000rpm(4°C )离心Imin ；3)吸取150 μ 1裂解液的上清液，加入到用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，下面附收集管，室温静置:3min，4000rpnK4°C )将吸附柱离心2min，弃去收集管中的废液；4)向每个吸附柱中加入300 μ 1洗涤液，4000rpnK4°C )将吸附柱离心3min，弃去收集管中的废液；5)将漂洗后的吸附柱转移至无菌的1. 5ml离心管中，静置lmin，加入120-150 μ 1 无菌水，静置:3min，4000rpnK4°C )离心:3min，弃去吸附柱，离心管中即为收集的DNA，4°C保
存备用。对比例1传统酚/氯仿法提取草鱼基因组DNA组织裂解方法依照实施例1中步骤1)，DNA提取过程，经过多次酚/氯仿抽提后收集DNA，4°C保存备用。对比例2试剂盒提取草鱼基因组DNAa. 20_50mg组织剪成小碎块，转入装有180 μ 1组织裂解液的1. 5ml离心管中，用大口径枪头吹打混勻；
b.加入20 μ 1的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻涡旋震荡充分混勻；c.将裂解物放置在55°C水浴1-3小时，期间轻柔震荡几次；d.加入200 μ 1结合液，立刻涡旋震荡充分混勻，70°C放置IOmin ；e.冷却后加100 μ 1异丙醇，立刻涡旋震荡充分混勻；f.用Iml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱中，吸附柱放入收集管， 13000rpm离心60s，倒掉收集管中废液；g.加入500 μ 1抑制物去除液，12000rpm离心30s，弃去废液；h.加入700 μ 1漂洗液，12000rpm离心30s，弃去废液；i.将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；j.取出吸附柱，放入干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μ 1洗脱缓冲液 EB,室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。离心管中DNA放置4°C备用。发明人对实施例1和对比例1提取的草鱼基因组DNA及其相应的SSR扩增产物进行了比较。分别吸取实施例1和对比例1提取获得的草鱼基因组DNA 3 μ 1同时进行1. 0%琼脂糖胶电泳检测，结果如图1所示，其中1-4为本发明提取获得DNA样，5-8为传统酚/氯仿法提取获得DNA样，M为分子量标准D2000。从图中可以看出相比传统酚/氯仿法在获得量上较少，但存在拖带更少的优点，说明本发明方法能有效获得高质量的草鱼基因组DNA。对以上DNA样品采用分光光度计检测浓度，再稀释至终浓度lOng/μ 1，用于 SSR 扩增，引物为 CID1528，25 °C PCR 反应体系，ZXiTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1, CID1528F(10yM)ly 1，CID1528R(10 μ Μ) 1 μ 1, DNA(IOng/μ 1)2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1 ；程序设置为预变性 94°C 3min，30 个循环(94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S)，72°C 5min;吸取 PCR 产物3 μ 1采用检测1. 2%琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以传统酚/氯仿法提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。从图中可以看出传统酚/氯仿法与本发明方法获得的草鱼基因组DNA均能较好地用于SSR的PCR扩增。发明人对实施例1和对比例2提取的草鱼基因组DNA及其相应的SSR扩增产物进行了比较。分别吸取实施例1和对比例2提取获得的草鱼基因组DNA 3 μ 1同时进行1. 0%琼脂糖胶电泳检测，结果如图3所示，其中1-4为本发明提取获得DNA样，5-8为DNA提取试剂盒提取获得DNA样，M为分子量标准D2000。从图中可以看出本发明方法相比试剂盒提取方法在获得量方面稍差，均能有效获得高质量的草鱼基因组DNA。对以上DNA样品采用分光光度计检测浓度，再稀释至终浓度lOng/μ 1，用于 SSR 扩增，引物为 CID1528，25 °C PCR 反应体系，ZXiTaq PCR MasterMix 12. 5μ 1, CID1528F(10yM)ly 1，CID1528R(10 μ Μ) 1 μ 1, DNA(10ng/y 1)2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1 ；程序设置为预变性 94°C 3min，30 个循环(94°C 30S，55°C 30S，72°C 30S)，72°C 5min;吸取 PCR 产物3 μ 1采用检测1. 2%琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示，其中1-4为以本发明提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，5-8为以DNA提取试剂盒提取获得DNA为模板的PCR扩增产物，M为分子量标准D2000。从图中可以看出本发明方法与试剂盒提取方法获得的草鱼基因组DNA均能较好地用于SSR的PCR扩增。
权利要求
1.一种草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤1)裂解草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中， 加入裂解液，颠倒混勻，45-65°C下，裂解1-2. 5小时至澄清得草鱼鳍条组织裂解液，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；2)离心将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；3)吸附吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置2-^iin后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；4)漂洗向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；5)溶解将漂洗后的吸附柱放置在无菌离心管中，静置0.5-2min，加入无菌水，静置 2-^iin后离心，离心管中即为收集的DNA。
2.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤1)中裂解液由PH值为8. 0，摩尔浓度为IM的Tris · HCl水溶液，pH值为8. 0，摩尔浓度为0. 5M的EDTANa2水溶液，质量含量为10 %的SDS水溶液，无菌水，蛋白酶K按体积比 5 20 10 64 1 混合而成。
3.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤1)中裂解液的其用量为lmg鳍条组织加入20 μ 1裂解液。
4.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤)中NaAc 溶液为3Μ，冰醋酸调节pH值至5. 2。
5.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤4)中洗涤液由PH值为7. 4，摩尔浓度为IM的Tris · HCl水溶液，pH值为8. 0，摩尔浓度为0. 5Μ的 EDTA水溶液，无水乙醇，无菌水按体积比4 1 350 235混合而成。
6.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤4)中洗涤液的体积为步骤幻中加入到吸附柱中上清液体积的1-3倍。
7.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤幻中无菌水的体积为步骤3)中加入到吸附柱中上清液体积的0. 5-1. 2倍。
8.根据权利要求1所述的草鱼基因组DNA提取方法，其特征在于，所述步骤幻-5)中， 离心温度为4-8°C下，离心转速为3000-5000rpm，离心时间为l_5min。
全文摘要
本发明涉及一种草鱼基因组DNA提取方法，包括步骤1)裂解草鱼鳍条组织经无菌水清洗后，吸干水分，剪成小碎块，置于无菌离心管中，加入裂解液，颠倒混匀，45-65℃下，裂解1-2.5小时至澄清，裂解过程中将离心管来回颠倒数次；2)离心将草鱼鳍条组织裂解液在离心机上离心；3)吸附吸取草鱼鳍条组织裂解液离心后的上清液，加入用NaAc溶液滤洗过的吸附柱中，其下面附收集管，静置后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；4)漂洗向吸附柱中加入洗涤液后将吸附柱离心，弃去收集管中的废液；5)溶解将漂洗后的吸附柱放置在离心管中，静置，加入无菌水，再静置后离心，离心管中即为收集的DNA。
文档编号C12N15/10GK102559663SQ20121003174
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者傅建军, 李家乐, 沈玉帮, 白志毅, 陈勇 申请人:上海海洋大学