专利名称：一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合及其制备方法与应用，尤其涉及纳米氧化石墨烯作为蛋白质的载体，在递送蛋白质进入细胞用以调控细胞生物活性方面的应用。
背景技术：
由于蛋白质能够调控细胞凋亡和细胞内信号转导，影响细胞新陈代谢的过程，因此可以作为一种新型的分子药理学靶点，比如通过蛋白药物治疗肿瘤和其他疾病。与化学药物不同，蛋白药物虽然其生物活性好，毒性低，但易被生物体内存在的蛋白酶降解，而且不能有效的递送到细胞内或病变组织，导致它们的生物利用度低，大大降低了蛋白药物的疗效，限制了其在生物医学领域中的应用。氧化石墨烯作为一种新型二维平面纳米材料，具有独特的结构和理化性质，且易于规模化生产，其在生物医学领域的应用已引起广泛关注。文献表明氧化石墨烯具有良好的生物相容性和生物安全性，以及其他纳米材料无可比拟的超高负载能力，成为一种很有前景的药物递送体系(Sun X, Liu Z, Welsher K, Robinson JT, Goodwin A, Zaric S, and Dai H. Nano Res, 2008，I: 203-212; Liu A，Robinson JTj Sun X，and Dai H. J Am Chem Soc， 2008， 130 (33): 10876-10877)。通过氧化和超声剥离石墨制得的纳米氧化石墨烯带有多种亲水性含氧基团，其水溶液具有一定的稳定性。通过进一步羧基化修饰，可以获得水稳定性更好的氧化石墨烯(Si Y and Samulski ET. Nano Lett. , 2008, 8(6): 1679-1682)。但是,上述氧化石墨烯在含盐的溶液如磷酸缓冲液或细胞培养基中的稳定性仍然较差。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是为了提高蛋白质的稳定性和抗蛋白酶降解的能力，增强蛋白质递送进入细胞的能力，提出一种在生理条件下稳定纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，并提供这种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的制备方法，利用氧化石墨烯的特殊结构，使氧化石墨烯负载上蛋白质，尤其是具有治疗或者调控细胞功能作用的蛋白质，实现有效递送这些蛋白药物进入细胞，并调节细胞新陈代谢活动。本发明的第一个目的，将通过以下技术方案得以实现
一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，其特征在于，所述复合物为蛋白质吸附在纳米氧化石墨烯表面的复合结构，其中所述纳米氧化石墨烯含有羧酸官能团及聚乙二醇基团，所述蛋白质含有荧光素分子。进一步的，所述荧光素分子为异硫氰酸荧光素分子或具有异硫氰基团的荧光素分子。进一步的，所述纳米氧化石墨烯蛋白质复合物投影尺寸为5 300nm,厚度为 I 4nm。
本发明还提供一种该纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的制备方法，包含如下步骤
I、采用荧光素对蛋白质进行荧光标记；
II、对天然石墨氧化剥离制备氧化石墨烯，并通过氯乙酸钠进行羧基化修饰后，再通过末端氨基化的聚乙二醇(PEG)进行修饰，制得PEG修饰的纳米氧化石墨烯；
III、通过物理吸附作用将修饰有荧光素的蛋白复合到PEG修饰的纳米氧化石墨烯表面。其中，步骤III中所述物理吸附包括纳米氧化石墨烯和蛋白质之间的堆积作用、静电作用、氢键和亲疏水作用等。本发明同时还提供一种该纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的应用，所述纳米氧化石墨烯蛋白质复合物具有避免蛋白酶对蛋白质的酶切水解作用的功能，且体外生理条件下具有使蛋白质在细胞中从氧化石墨烯表面上释放到细胞中并调控细胞生理活动的功能。应用本发明的突出效果为本发明设计的纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，蛋白质可以快速负载至氧化石墨烯表面上，并具有极高的负载效率和稳定性；在体外生理环境中， 物理吸附在氧化石墨烯表面的蛋白质可以逐渐释放。且该种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物还可以有效避免蛋白酶对蛋白的酶切水解作用，同时还可以细胞中，并使蛋白质在细胞中从氧化石墨烯表面上有效的递送到细胞中。最后，本发明提高了对细胞生理活动调节控制的效果，为其在生理条件下的医学应用提供了有力保障。且通过本发明介绍的制备方法，方法简便，成本低，利于量产。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图I是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物制备示意图。图2是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的原子力显微镜照片。图3是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物、荧光标记蛋白、纳米氧化石墨烯以及聚乙二醇(PEG)修饰纳米氧化石墨烯的紫外可见吸收光谱。图4是纳米氧化石墨烯对蛋白质吸附率与蛋白浓度关系图。图5a是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物在磷酸盐缓冲液(PBS)中蛋白的释放行为图。图5b是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物在RPMI 1640细胞培养基中蛋白的释放行为图。图5c是本发明纳米氧化石墨烯蛋白质复合物在含有血清(serum)细胞培养基中蛋白的释放行为图。
具体实施例方式鉴于上述现有技术的不足和实际应用蛋白过程中的迫切需求，本发明针对现有技术的不足研究并提出了一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，该纳米氧化石墨烯蛋白质复合物为蛋白质吸附在纳米氧化石墨烯表面的复合结构，其中所述纳米氧化石墨烯含有羧酸官能团及聚乙二醇基团，所述蛋白质含有荧光素分子。
其中荧光素分子为异硫氰酸荧光素分子或具有异硫氰基团的荧光素分子。且该种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，投影尺寸为5 300nm,厚度为l 4nm。本发明提出的制备该种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的方法，将分别荧光素标记的蛋白和聚乙二醇修饰的氧化石墨烯复合在一起，所涉及的纳米氧化石墨烯蛋白质复合物如图I的合成示意图所示，是通过纳米氧化石墨烯和蛋白质之间的π-π共轭吸附、静电作用等物理吸附的方式获得的。具体制备分为三个部分包括荧光素标记蛋白、聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制备以及氧化石墨烯蛋白质复合物的制备。具体步骤如下
第一步，荧光素标记蛋白质的制备。以牛血清白蛋白(BSA)为模型，分别将Img荧光素3溶于O. 2ml的二甲亚砜中， 20mg牛血清白蛋白11 (以下简称蛋白)溶于5ml碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中。将此两种溶液混合，避光条件下反应10小时后，透析除去未反应的荧光素。第二步，纳米氧化石墨烯的制备及化学修饰。将Ig片状石墨烯、O. 5g过硫酸钾、O. 5g五氧化二磷溶于I. 5ml浓硫酸中，加热至 80°C反应6小时，冷却到室温后，再用水将其洗成中性，自然干燥成粉末。将上述粉末Ig加入到23ml事先预冷至(TC的浓硫酸中，边搅拌边加入3g高锰酸钾，同时保持温度在20°C以下。将混合物的温度升至35°C，搅拌2小时后，加入46ml的水三次，搅拌15分钟。为中止氧化反应，加入140ml三次水和IOOml浓度为30%的过氧化氢。将混合物用250ml的10% 盐酸离心清洗，以除去溶液中的金属粒子。将上述氧化石墨用超声I小时，13000转/分钟离心30分钟，通过以上步骤获取的上清液即为纳米氧化石墨烯21。其次，先将5g氢氧化钠和5g氯乙酸钠加到50ml水中溶解,然后加入到约含IOOmg 上述制得的纳米氧化石墨烯溶液中。水浴超声3小时。反应后，氧化石墨烯上的羟基被氯乙酸钠的COOH取代，棕色的氧化石墨烯溶液变成黑色。最后，取25mg末端氨基化的聚乙二醇溶于Iml水中，并在不断搅拌下加入上述羧基化的氧化石墨烯(lmg/ml) 10ml。向其中加入乙基碳二亚胺盐酸盐(100mg/ml) O. 1ml,室温搅拌12小时。最后透析除去未反应的聚乙二醇以及乙基碳二亚胺盐酸盐。通过对纳米氧化石墨烯进行聚乙二醇修饰，制得生理条件下稳定的纳米氧化石墨烯22。第三步，纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的制备，即纳米氧化石墨烯负载蛋白。取Iml荧光素标记的蛋白溶液12 (4mg/ml)加入到3ml上述制得的聚乙二醇修饰的lmg/ml纳米氧化石墨烯溶液中，搅拌反应过夜，通过物理吸附作用将蛋白负载到氧化石墨烯表面上。透析除去未负载上的蛋白，制得本发明的纳米氧化石墨烯蛋白质复合物4。图2以及图3结果显示蛋白质吸附在了氧化石墨烯表面，说明通过物理吸附作用可以制备氧化石墨烯蛋白质复合物。本发明还涉及了该种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的生物应用第一，该种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物具有避免蛋白酶对蛋白质的酶切水解作用的功能。以牛血清白蛋白(BSA)为模型，在37°C胰蛋白酶相同作用时间后，氧化石墨烯蛋白质复合物可以有效地降低胰蛋白酶对吸附在氧化石墨烯表面上的蛋白酶切水解作用。当游离的牛血清白蛋白 (BSA)完全的被蛋白酶降解时，吸附在氧化石墨烯表面的部分蛋白还保持完整的蛋白结构。第二，体外生理条件下具有使蛋白质在细胞中从氧化石墨烯表面上释放到细胞中的功能，并且能够调控细胞的生理活性。以牛血清白蛋白(BSA)、异硫氰酸荧光素(FITC)和HeLa细胞为模型，分别将相同蛋白浓度的游离BSA-FITC和纳米氧化石墨烯-BSA-FITC与 HeLa细胞孵育15小时后，通过荧光共聚焦显微镜观察其被细胞摄入情况。结果表明，纳米氧化石墨烯-BSA-FITC可以很好的进入细胞，而游离BSA-FITC很难被细胞摄取。以RNA酶A (RNase A)为模型，比较了游离的RNase A与通过纳米氧化石墨烯递送的RNase A对细胞活性的影响。由于RNA酶可以非特异的降解细胞质中的mRNA和tRNA ，导致细胞不能正常合成蛋白质，从而影响细胞活性。分别将相同蛋白浓度的游离RNase A-FITC和纳米氧化石墨烯-RNase A-FITC与HeLa细胞孵育48小时后检测细胞的活性。结果表明，游离的RNase A-FITC不能很好的进入细胞，对细胞活性影响不大；纳米氧化石墨烯-RNase A-FITC可以更好的进入细胞,通过纳米氧化石墨烯递送作用RNase A可以高效的进入细胞，影响细胞活性。氧化石墨烯-蛋白质复合物可以有效递送蛋白进入细胞并且调控细胞的生理活性。最后，该种复合物的蛋白还可以高效的负载到纳米氧化石墨烯表面，并且在体外生理环境中缓慢释放出来。以牛血清白蛋白(BSA)以及异硫氰酸荧光素(FITC)为模型，具体实施方法如下
第一步，纳米氧化石墨烯对蛋白的负载效率
不同浓度的荧光素标记的蛋白溶液分别加入到相同浓度的纳米氧化石墨烯溶液中，避光搅拌反应12小时，再将其稀释以后通过荧光光谱检测及计算蛋白负载率。结果发现，纳米氧化石墨稀可以闻效负载蛋白，负载效率可以闻达近400% (如图4所不)。第二步，在生理条件下，负载到纳米氧化石墨烯表面上的蛋白缓慢释放
取制得纳米氧化石墨烯蛋白质复合物按比例1:5 -1:2 O分别加入到磷酸盐缓冲液 (PBS),RPMI 1640细胞培养基以及含有血清的细胞培养基中。分别在37 1震荡反应O小时至72小时，再通过荧光光谱检测及计算蛋白释放率。结果发现，负载到纳米氧化石墨烯表面上的蛋白在体外生理条件下缓慢的从氧化石墨烯表面释放(图5)。上述具体的制备工艺仅是作为示例给出，其中所提到的蛋白与荧光素不仅仅局限于上述例子中所提到的异硫氰酸荧光素以及牛血清白蛋白和RNA酶，也可以选用其它荧光素分子和蛋白分子。以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
权利要求
1.一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，其特征在于所述复合物为蛋白质吸附在纳米氧化石墨烯表面的复合结构，其中所述纳米氧化石墨烯含有羧酸官能团及聚乙二醇基团， 所述蛋白质含有荧光素分子。
2.根据权利要求I所述的一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，其特征在于所述荧光素分子为异硫氰酸荧光素分子或具有异硫氰基团的荧光素分子。
3.根据权利要求I所述的一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，其特征在于所述纳米氧化石墨烯蛋白质复合物投影尺寸为5 300nm,厚度为l 4nm。
4.一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的制备方法，通过物理吸附的方法复合，其特征在于包含如下步骤I、采用荧光素对蛋白质进行荧光标记；II、对天然石墨氧化剥离制备氧化石墨烯，并通过氯乙酸钠进行羧基化修饰后，再通过末端氨基化的聚乙二醇(PEG)进行修饰，制得PEG修饰的纳米氧化石墨烯；III、通过物理吸附作用将修饰有荧光素的蛋白复合到PEG修饰的纳米氧化石墨烯表面。
5.根据权利要求3所述的一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物的制备方法，其特征在于步骤III中所述物理吸附包括纳米氧化石墨烯和蛋白质之间的堆积作用、静电作用、氢键和亲疏水作用等。
6.权利要求I所述一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物在调控细胞生理功能方面的应用，其特征在于所述纳米氧化石墨烯蛋白质复合物具有避免蛋白酶对蛋白质的酶切水解作用的功能，且体外生理条件下具有使蛋白质在细胞中从氧化石墨烯表面上释放到细胞中并调控细胞生理活动的功能。
全文摘要
本发明揭示了一种纳米氧化石墨烯蛋白质复合物及其制备方法与应用，该复合物为蛋白质吸附在纳米氧化石墨烯表面的复合结构。通过对蛋白药物荧光标记，对纳米氧化石墨烯进行聚乙二醇(PEG)修饰，再将蛋白药物通过物理吸附的方式复合聚集到纳米氧化石墨烯之上。本发明设计的纳米氧化石墨烯蛋白质复合物，具有极高的负载效率和稳定性；在体外生理环境中，物理吸附在氧化石墨烯表面的蛋白质可以逐渐释放，有效避免蛋白酶对蛋白的酶切水解作用，同时还可以使蛋白质在细胞中从氧化石墨烯表面上有效的递送到细胞中。本发明提高了对细胞生理活动调节控制的效果，为其在生理条件下的医学应用提供了有力保障；本发明介绍的制备方法，方法简便，成本低，利于量产。
文档编号C12N5/09GK102603896SQ201210031478
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者张智军, 沈贺 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所