专利名称：一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法
技术领域：
本发明涉及保健食品领域，具体地，本发明涉及一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法。
背景技术：
纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌合成的一种溶栓酶，该酶可由微生物发酵大量制备，价格低廉；来源于纳豆食品，可口服、安全副作用小；该酶具有高效的双重溶栓活性，不仅可以直接降解纤维蛋白，而且可激活人体纤溶酶原，产生内源性纤溶酶；体内试验显示该酶作用持久，半衰期长。因其诸多优势，成为近年来溶栓类产品的开发热点(详见参考文献 I:Peng Y, Yang X, Zhang Y.Microbial fibrinolytic enzymes:an overview ofsource，production，properties，and thrombolytic activity in viv0.Appl MicrobiolBiotechnol，2005，69:126-132)。
纳豆激酶对pH环境比较敏感，在pH < 5的情况下，活性逐渐丧失，暴露在胃酸(PH1.2-3)的环境下lh，几乎完全失活。通过聚谷氨酸微胶囊技术包裹纳豆激酶，未解决胃酸失活的问题(详见参考文献 2:Hsieh，Cff, Lu WC, Hsieh, WC, Huang YP, Lai CH, KoWC.1mprovement of the stability of nattokinase using[gamma]-polyglutamic acidas a coating material for microencapsulation.LffT-Food Science and Technology,2009,42 =144-149)。目前市场上存在的纳豆激酶产品以胶囊为主，通过对收集到的8种纳豆激酶胶囊进行检测，均不具备耐酸性，在模拟胃酸环境下保持2h，胶囊迅速崩解，酶活完全丧失。纳豆激酶酸性失活现象是制约其口服效果的重要因素。有文献报道，通过甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯聚合物包衣技术制备纳豆激酶肠溶片剂，解决了纳豆激酶片剂胃酸失活的问题(详见参考文献 3:Law D, Zhang Z.Stabilization and target delivery ofnattokinase using compression coating.Drug Dev Ind Pharm, 2007, 33:495-503)。甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物是一种新型的肠溶包衣材料，具有较好的抗酸活性，然而未见将该聚合物应用到纳豆激酶产品包衣的报道。
因此，本发明期望运用甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物对纳豆激酶胶囊进行包衣处理，制备纳豆激酶肠溶胶囊，通过对纳豆激酶进行抗酸保护，希望解决纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳豆激酶肠溶胶囊。
本发明的另一目的是提供上述纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法。
本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，其中，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒；
其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22 (Bacil Iussubtilis)，其保藏编号为:CGMCC N0.4970。上述枯草芽孢杆菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为:CGMCC N0.4970。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，在不同pH的酸性环境下保持2h，酶活均没有损失；在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，包括以下步骤:1)纳豆激酶冻干粉制备:向鹰嘴豆纳豆食品中添加2倍体积(v/w)的30 % -50 %的乙醇溶液，200r/min,浸提lh。5000_10000g离心10_50min,收集上清液,继续添加无水乙醇至75%，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10_50min，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉；2)肠溶胶囊制备:按照0.15-0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5-15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液浸泡3-5次，400C _50°C鼓风干燥lh，制得纳豆激酶肠溶胶囊。根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述鹰嘴豆纳豆食品的制备方法，包括以下步骤:1)将枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37°C培养12h后放置于无菌管中，-70°C冷冻保藏；2)制备种子液；
3)制备鹰嘴豆发酵底物；4)发酵培养:按照2% -5% (v/w)的接种量，将种子液加入鹰嘴豆发酵底物中混匀，31-37°C静止培养36-48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述种子液制备方法包括以下步骤:1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37°C培养12h，使其活化；2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，37°C，180rpm培养8-14h，制得种子液。根据本发明的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其中，所述鹰嘴豆发酵底物制备方法包括以下步骤:1)精选:去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗；2)浸泡:加入5倍体积(v/w)的水,室温浸泡12h ；3)浙水，使豆子的初始含水量为50% -70% ；4)蒸煮:将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115°C高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。本发明所提供的纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法，具有较强的创新性和实用性，其优点如下:(1)首次通过甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物对鹰嘴豆纳豆食品来源纳豆激酶明胶胶囊进行包衣处理，制备纳豆激酶肠溶胶囊，该胶囊在不同PH的酸性环境下保持2h，酶活均没有损失。
(2)体外释放试验表明，本发明所制备纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。解决了纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。
图1为纳豆激酶冻干粉及纳豆激酶肠溶胶囊的抗酸性能，其中对照组为纳豆激酶冻干粉。
图2为纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃肠道环境中的释放曲线。
枯草芽孢杆菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，于2011年6月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为:CGMCC N0.4970。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。
实施例1纳豆激酶冻干粉的制备
1、鹰嘴豆纳豆食品制备:
I)用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌LSSE-22为原始菌种；其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22 (Bacillus subtilis)，其保藏编号为:CGMCC N0.4970 ；
2)斜面菌种活化:将冷冻保藏的菌种，转接到LB固体平板，37°C培养12h ；
3)种子液培养:将LB固体平板活化的种子转接到LB液体培养基，37°C，180rpm培养8-14h ；
4)鹰嘴豆底物制备:
a、鹰嘴豆精选:去除变色、霉烂、虫蛀的鹰嘴豆，除去其中混有的砂石、土块等杂物，并用水清洗两边；
b、浸泡:加入5倍体积(v/w)水,室温浸泡12h ；
C、浙水:浙去浸泡后的鹰嘴豆中多余的水分，初始含水量为50% -70% ；
d、蒸煮:将完整豆子或者经破碎处理的豆子115°C高温高压蒸煮30min，冷却至室温;
5)发酵培养:按照2% -5 % (v/w)的接种量，加入鹰嘴豆中混匀，31_37°C静止培养36-48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。
2、冻干粉制备:以鹰嘴豆纳豆食品为原料，向其中添加2倍体积(v/w)的30% -50%的乙醇溶液，200r/min，浸提lh。5000_10000g离心10_50min，收集上清液，继续添加无水乙醇至75%，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10_50min，冷冻干燥48h。
3、活性检测:纳豆激酶活性检测通过纤维蛋白溶解法进行，向试管中依次加入0.4mL 纤维蛋白原溶液(0.72%, w/v), 1.4mL Tris-HCl (50mM, pH 7.8)，37°C温浴 5min，然后加入0.1mL凝血酶溶液(20U/mL)，37°C温浴lOmin，再加入0.1mL的稀释酶样品，37°C温浴60min,加入2mL三氯乙酸(0.2M)静止20min终止反应,4000g离心15min,取上清于275nm比色测定吸光度，I个单位的纤维蛋白降解酶活(FU)相当于每分钟275nm处吸光度增加0.0l所需要的酶量。经检测，纳豆激酶冻干粉中纳豆激酶活性为3250.82-4000.58FU/g°实施例2纳豆激酶肠溶胶囊的制备纳豆激酶肠溶胶囊制备:将纳豆激酶冻干粉，按照0.15g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5 %的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3次，40°C鼓风干燥lh。所制胶囊纳豆激酶活性为600FU/粒。实施例3纳豆激酶肠溶胶囊的制备纳豆激酶肠溶胶囊制备:将纳豆激酶冻干粉，按照0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过10%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3次，40°C鼓风干燥lh。所制胶囊纳豆激酶活性为800FU/粒。实施例4纳豆激酶肠溶胶囊的制备纳豆激酶肠溶胶囊制备:将纳豆激酶冻干粉，按照0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣5次，50°C鼓风干燥lh。所制胶囊纳豆激酶活性为800FU/粒。实施例5纳豆激酶肠溶胶囊特性试验1、抗酸试验:以0.2g纳豆激酶冻干粉为对照，将对照及纳豆激酶肠溶胶囊分别暴露在不同的 pH 环境条件下: pH 1.2(0.lmol/L HCl，pH 2.5 (0.0lmol/L HCl)，pH
5.0 (50mmol/L乙酸缓冲液体系),pH 7.4 (50mmol/L磷酸缓冲液体系)，37°C，100r/min处理2h，然后将各缓冲液pH调至7.4，通过200r/min进行5h均质处理，检测酶活。结果如图1所示，纳豆激酶冻干粉在PH 1.2和pH 2.5的条件下，酶活完全丧失；纳豆激酶胶囊在所测的各种酸性PH条件下，酶活没有显著性变化，说明所制备的纳豆激酶肠溶胶囊具有良好的抗酸效果，对纳豆激酶起到了较好的保护作用。2、体外释放试验:将纳豆激酶肠溶胶囊暴露在模拟胃酸条件下(pH 1.2,0.1mol/LHC1)，37°C，100r/min处理2h，然后将其转移到模拟肠道环境中(pH 7.4，50mmol/L磷酸缓冲液体系)，37°C，100r/min处理继续处理8h，每隔lh，取样检测纳豆激酶酶活，结果如图2所示，在模拟胃酸条件下，纳豆激酶肠溶胶囊保持完整的外形，未释放纳豆激酶；当转移到模拟肠道环境后，纳豆激酶肠溶胶囊缓慢崩解，纳豆激酶逐渐释放，在8h，纳豆激酶完全释放。说明所制备的肠溶胶囊可保护纳豆激酶免受胃酸失活，实现了纳豆激酶在肠道环境中的控制释放。
权利要求
1.一种纳豆激酶肠溶胶囊，其特征在于，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒； 其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22 (Bacillus subtil is)，其保藏编号为:CGMCC N0.4970。
2.—种纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)纳豆激酶冻干粉制备:向鹰嘴豆纳豆食品中添加2倍体积(v/w)的30%-50%的乙醇溶液，200r/min，浸提Ih ;5000-10000g离心10_50min，收集上清液，继续添加无水乙醇至75%，沉淀纳豆激酶，5000-10000g离心10_50min，冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉； 2)肠溶胶囊制备:按照0.15-0.2g/粒的规格装填纳豆激酶明胶胶囊，通过5-15%的甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物的乙醇溶液进行浸泡包衣3-5次，400C _50°C鼓风干燥lh，制得纳豆激酶肠溶胶囊。
3.根据权利要求2所述纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆纳豆食品的制备方法，包括以下步骤: 1)将枯草芽孢杆菌LSSE-22菌株接在LB液体培养基上37°C培养12h后放置于无菌管中，-70°C冷冻保藏； 2)制备种子液； 3)制备鹰嘴豆发酵底物； 4)发酵培养:按照2%-5%(v/w)的接种量，将种子液加入鹰嘴豆发酵底物中混匀，31-37°C静止培养36 -48h，获得鹰嘴豆纳豆食品。
4.根据权利要求3所述的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述种子液制备方法包括以下步骤: 1)将冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37°C培养12h，使其活化； 2)将活化的菌种转接到LB液体种子培养基中，370C，180rpm培养8_14h，制得种子液。
5.根据权利要求3所述的纳豆激酶肠溶胶囊的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆发酵底物制备方法包括以下步骤: 1)精选:去除变色、霉烂、虫蛀的豆子，除去其中杂物，并用水清洗； 2)浸泡:加入5倍体积(v/w)的水,室温浸泡12h； 3)浙水，使豆子的初始含水量为50%-70% ； 4)蒸煮:将完整豆子或者经破碎处理的豆子在115°C高温高压蒸煮30min，制得豆类发酵底物。
全文摘要
本发明涉及保健食品领域，具体地，本发明涉及一种纳豆激酶肠溶胶囊及其制备方法。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊，其中，所述胶囊外包有甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯-共聚物包衣，胶囊纳豆激酶冻干粉含量为0.15-0.2g/粒，纳豆激酶活性为600-800FU/粒；其中，所述纳豆激酶冻干粉经由鹰嘴豆纳豆食品制备获得，所述鹰嘴豆纳豆食品经由枯草芽孢杆菌LSSE-22发酵所得，其中，所述枯草芽孢杆菌LSSE-22(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.4970。本发明的纳豆激酶肠溶胶囊在模拟胃酸环境中不崩解，保持良好的外观，酶活无损失，在模拟肠道环境中缓慢释放，8h达到完全释放。解决了纳豆激酶胃酸失活问题，并实现其在肠道环境中的控制释放。
文档编号A23L1/29GK103238829SQ20121003151
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者刘会洲, 魏雪团, 罗明芳, 谢渝春, 李昊剑, 杨良嵘 申请人:中国科学院过程工程研究所