一种能够同时繁殖大豆孢囊线虫并进行大豆孢囊线虫抗性筛选方法与流程

本发明涉及一种大豆孢囊线虫抗性筛选方法。

背景技术：

大豆孢囊线虫(soybeancystnematode，scn，heteroderaglycinesichinohe)是一种植物寄生线虫，主要寄生在豆科植物的根部，严重阻碍植株的生长，导致产量下降，造成巨大的经济损失。

目前，选用大豆抗孢囊线虫品种是最经济有效的手段，而筛选大豆孢囊线虫抗病品种主要通过温室盆栽法，即普遍采用的塑料钵柱法和pvc管法，即将灭菌的沙和土按照体积比1:1比例混合后装入营养钵或pvc管，把1粒大豆种子种植在混合好的沙土中，萌发后，待子叶展开后接种大豆孢囊线虫二龄幼虫，接种21天后，用大量的清水轻柔的冲洗大豆的根部，将泥沙冲洗干净后统计根上孢囊数目。

现有方法存在以下问题：1)、由于大豆是种植在沙土中，统计孢囊数需要用大量的水冲洗，且冲洗时需要格外小心避免孢囊掉落，但仍会有部分孢囊损失，需要大量劳动力，且操作时间长；2)、大豆根不易彻底冲洗干净，为统计孢囊数目增加难度，统计出来的孢囊数平行性差；3)、脱落在土中的雄虫难以获得；4)、群体遗传抗性研究需要进行大批量植株后代筛选，而营养钵以及pvc管占用空间大；5)、试验过程需要大量的灭菌沙和土，沙和土的运输、筛选、灭菌和装灌环节多，并且耗时耗人力。另外，对大豆孢囊线虫侵染、致病机理方面的深入研究过程中，需要大量的大豆孢囊线虫二龄幼虫、雌虫、雄虫或孢囊，用沙土法繁殖需要空间大，耗时耗力。所以需要一种简易的，省时省力省空间的培养方法。

技术实现要素：

本发明是要解决现有方法存在统计孢囊数目难度大，费时费力，雄虫难以获得，培养占用空间大的问题，提供能够同时繁殖大豆孢囊线虫并进行大豆孢囊线虫抗性筛选方法。

本发明能够同时繁殖大豆孢囊线虫并进行大豆孢囊线虫抗性筛选方法，包括以下步骤：

一、首先将双层滤纸重叠放置于培养袋内，培养袋开口向上，滤纸上部与培养袋开口处高度一致；所述培养袋为扁平的塑料袋；

二、用移液器向培养袋加入无菌水9～11ml，使培养袋中的滤纸充分浸湿，且保证培养袋底部有少量无菌水存留；

三、将大豆幼苗移到浸湿的滤纸上部，使幼苗的根部通过滤纸的空隙放入培养袋中，保持子叶高于培养袋的上边缘，然后将培养袋竖直放入夹子内，每个夹子中放置两个培养袋，然后将夹子悬挂在培养架上，再将整个培养架置于培养箱中，光照周期为：16h光照，8h黑暗，昼夜温度分别为24℃和22℃，每天向每个培养袋内浇无菌水3-5ml，每三天向每个培养袋内浇5～6ml霍格兰氏营养液，每天保持培养袋底部略有存水，滤纸保持湿润，第二天存水恰好蒸发完为宜。

四、植株继续生长5-7天，之后从夹子中取出培养袋，向大豆的主根和侧根周围均匀滴入3ml100条/ml的大豆孢囊线虫二龄幼虫悬浮液，然后将培养袋水平放置在培养箱中进行暗培养，24h后取出培养袋竖直放入培养架的夹子中，在培养箱中继续光照培养15～21天；

五、用无菌水在培养袋内冲洗根表面，然后将培养袋内的无菌水收集至灭菌的容器中，完成雄虫收集，在接种大豆孢囊线虫21天后，将培养袋内的滤纸连同大豆的整个根系取出，剪去地上部分，平铺在实验台上，进行孢囊数目统计，然后根据孢囊数目和感病对照品种的孢囊数目比较确定大豆孢囊线虫抗性品种，除去用于统计的孢囊数的样品，剩余的样品在接种大豆孢囊线虫40-45天收集成熟孢囊，用于后续的研究。

其中确定大豆孢囊线虫抗性品种的方法为：根据schmittandshannon，1992划分方法，雌虫指数(femaleindex，fi)<10为抗，fi＝10-30为中抗，fi＝31-60为中感，fi>60为感病。

进一步的，所述滤纸的长为15～18cm，宽为12～14cm。

进一步的，所述培养袋的长为17～19cm，宽为16～18cm。

进一步的，所述培养袋的材质为塑料。

进一步的，所述大豆幼苗为在蛭石中萌发3-5天的，全株长7～9cm的幼苗。

进一步的，步骤三所述培养架包括底板、侧柱、支撑杆、悬挂杆和提手，所述底板为矩形底板，底板的四个角上分别竖直设置4个侧柱，所述支撑杆水平设置在侧柱的上部，支撑杆的两端分别与相邻的两个侧柱固定连接，侧柱上对称设置2个支撑杆，所述悬挂杆水平设置在侧柱的上部，悬挂杆的两端分别与相邻的两个侧柱固定连接，侧柱上对称设置2个悬挂杆，所述悬挂杆与支撑杆相邻，所述支撑杆上部分别设有提手。

进一步的，所述培养架中悬挂杆的长度为39～40cm，支撑杆的长度为32～33cm。

步骤三所述夹子包括横梁和本体，所述本体包括上封页、下封页和连接上封页和下封页的背脊，所述上封页和下封页与背脊相反的一侧分别设有横梁，所述横梁的两段分别设有挂钩。

进一步的，所述夹子中背脊的长度为29～30cm，横梁和背脊之间的距离为23～24cm。

所述夹子放置在培养架上是通过横梁的两端搭在两侧悬挂杆上实现的。

步骤四中所述暗培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％。

步骤四中所述光照培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照强度为18000lx。

本发明的有益效果：

采用本发明培养大豆孢囊线虫，可以直接观测孢囊线虫发育状态，快速收集干净的大豆孢囊线虫雄虫，统计孢囊数不需要水冲洗，减少操作步骤，孢囊清晰易于观察统计，非常直观，节省时间、空间和人力，结果平行性好。

1、本发明方法无需在沙土中种植，本方法的大豆根无需清洗，统计孢囊数不需要用水冲洗，不会损失孢囊。操作简单，用时短，统计出来的孢囊数平行性好；

2、本方法中雄虫不会脱落在土中，因此容易获得；

3、本方法将大豆种植在扁平的培养袋中，无需营养钵以及pvc管，占用空间小；

4、本方法不需要沙土，省去了运输、装罐等环节，而且能够容易的分离大豆孢囊线虫二龄幼虫、雌虫、雄虫或孢囊，省时省力。

附图说明

图1为本发明方法中培养架及夹子的结构示意图；

图2为观察大豆孢囊线虫在大豆根部从接种后10天到40天的一个孢囊发育过程图；

图3为从培养袋中收集的干净的雄虫；

图4为本方法培养后的大豆根系照片；

图5为温室盆栽法培养后的大豆根系照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式能够同时繁殖大豆孢囊线虫并进行大豆孢囊线虫抗性筛选方法，包括以下步骤：

一、首先将双层滤纸重叠放置于培养袋内，培养袋开口向上，滤纸上部与生长袋开口处高度一致；

二、用移液器向培养袋加入无菌水9～11ml，使培养袋中的滤纸充分浸湿，且保证培养袋底部有少量无菌水存留；

三、将大豆幼苗移到浸湿的滤纸上部，使幼苗的根部通过滤纸的空隙放入培养袋中，保持子叶高于培养袋的上边缘，然后将培养袋竖直放入夹子内，每个夹子中放置两个培养袋，然后将夹子悬挂在培养架上，再将整个培养架置于培养箱中，光照周期为：16h光照，8h黑暗，昼夜温度分别为24℃和22℃，每天向每个培养袋内浇无菌水3-5ml，每三天向每个培养袋内浇5～6ml霍格兰氏营养液，每天保持培养袋底部有1～2ml的存水，滤纸保持湿润；

四、植株继续生长5-7天，之后从夹子中取出培养袋，向大豆的主根和侧根周围均匀滴入3ml100条/ml的大豆孢囊线虫二龄幼虫悬浮液，然后将培养袋水平放置在培养箱中进行暗培养；24h后取出培养袋竖直放入培养架的夹子中，在培养箱中继续光照培养15～21天；其中暗培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％；光照培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照强度为18000lx；

五、用无菌水在培养袋内冲洗根表面，然后将培养袋内的无菌水收集至灭菌的容器中，完成雄虫收集，在接种大豆孢囊线虫21天后，将培养袋内的滤纸连同大豆的整个根系取出，剪去地上部分，平铺在实验台上，进行孢囊数目统计，然后根据孢囊数目和感病对照品种的孢囊数目比较确定大豆孢囊线虫抗性品种，除去用于统计的孢囊数的样品，剩余的样品在接种大豆孢囊线虫40-45天收集成熟孢囊，用于后续的研究。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述滤纸的长为15～18cm，宽为12～14cm。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述培养袋的长为17～19cm，宽为16～18cm。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述培养袋的材质为塑料。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中所述大豆幼苗为在蛭石中萌发3-5天的，全株长7～9cm的幼苗。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：结合图1说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三所述培养架包括底板1、侧柱2、支撑杆3、悬挂杆4和提手5，所述底板1为矩形底板，底板1的四个角上分别竖直设置4个侧柱2，所述支撑杆3水平设置在侧柱2的上部，支撑杆3的两端分别与相邻的两个侧柱2固定连接，侧柱2上对称设置2个支撑杆3，所述悬挂杆4水平设置在侧柱2的上部，悬挂杆4的两端分别与相邻的两个侧柱2固定连接，侧柱2上对称设置2个悬挂杆4，所述悬挂杆4与支撑杆3相邻，所述支撑杆3上部分别设有提手5。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述培养架中悬挂杆4的长度为39～40cm，支撑杆3的长度为32～33cm。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：结合图1说明本实施方式，本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三所述夹子包括横梁6和本体7，所述本体7包括上封页8、下封页9和连接上封页8和下封页9的背脊10，所述上封页8和下封页9与背脊10相对的一侧分别设有横梁6，所述横梁6的两端分别设有挂钩61。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是：所述背脊10的长度为29～30cm，横梁6和背脊10之间的距离为23～24cm。其它与具体实施方式八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：所述夹子放置在培养架上是通过横梁6的两端搭在两侧悬挂杆4上实现的。其它与具体实施方式六至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五中确定大豆孢囊线虫抗性品种的方法为：根据schmittandshannon,1992划分方法，雌虫指数<10为抗，fi＝10-30为中抗，fi＝31-60为中感，fi>60为感病。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例能够同时繁殖大豆孢囊线虫并进行大豆孢囊线虫抗性筛选方法，具体是按以下步骤完成的：

一、首先将双层滤纸重叠放置于培养袋内，培养袋开口向上，滤纸上部与培养袋开口处高度一致；其中滤纸的长为16cm，宽为12.8cm，培养袋的长为17.8cm，宽为16.5cm；

二、用5ml的移液器向培养袋加入无菌水10ml，使培养袋中的滤纸充分浸湿，且保证培养袋底部有少量无菌水存留；

三、将已在蛭石中萌发5天的大豆品种东升1号，全株长8cm左右的大豆幼苗移到浸湿的滤纸上部，使幼苗的根部通过滤纸的空隙放入培养袋中，保持子叶高于培养袋的上边缘，然后将培养袋竖直放入夹子内，每个夹子中放置两个培养袋，然后将夹子悬挂在培养架上，再将整个培养架置于培养箱中，光照周期为：16h光照，8h黑暗，昼夜温度分别为24℃和22℃，每天向每个培养袋内浇无菌水3ml，每三天向每个培养袋内浇5ml霍格兰氏营养液，每天保持培养袋底部略有存水，滤纸保持湿润，第二天存水恰好蒸发完为宜。

四、植株继续生长6天，侧根长至5cm左右，之后从夹子中取出培养袋，用1ml移液器向大豆的主根和侧根周围均匀滴入3ml100条/ml的大豆孢囊线虫二龄幼虫悬浮液，然后将培养袋水平放置在培养箱中进行暗培养，24h后取出培养袋竖直放入培养架的夹子中，在培养箱中继续光照培养20天；其中暗培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％；光照培养的条件为：昼夜温度分别为24℃和22℃，湿度80％，光照周期：16h光照，8h黑暗，光照强度为18000lx；

五、用无菌水在培养袋内冲洗根表面，然后将培养袋内的无菌水收集至灭菌的容器中，完成雄虫收集，在接种大豆孢囊线虫21天后，将培养袋内的滤纸连同大豆的整个根系取出，剪去地上部分，平铺在实验台上，进行孢囊数目统计，然后根据孢囊数目和感病对照品种的孢囊数目比较确定大豆孢囊线虫抗性品种，除去用于统计的孢囊数的样品，剩余的样品在接种大豆孢囊线虫45天收集成熟孢囊，用于后续的研究。

其中确定大豆孢囊线虫抗性品种的方法为：根据schmittandshannon，1992划分方法，雌虫指数(femaleindex，fi)<10为抗，fi＝10-30为中抗，fi＝31-60为中感，fi>60为感病。

另外，以传统的营养钵培养法作为对照组，营养钵培养法除采用灌装了沙土的营养钵代替培养袋外，其他培养条件与生长袋培养法一致。

步骤三所述培养架包括底板1、侧柱2、支撑杆3、悬挂杆4和提手5，所述底板1为矩形底板，底板1的四个角上分别竖直设置4个侧柱2，所述支撑杆3水平设置在侧柱2的上部，支撑杆3的两端分别与相邻的两个侧柱2固定连接，侧柱2上对称设置2个支撑杆3，所述悬挂杆4水平设置在侧柱2的上部，悬挂杆4的两端分别与相邻的两个侧柱2固定连接，侧柱2上对称设置2个悬挂杆4，所述悬挂杆4与支撑杆3相邻，所述支撑杆3上部分别设有提手5。

所述培养架中悬挂杆4的长度为39.5cm，支撑杆3的长度为32.5cm。

步骤三所述夹子包括横梁6和本体7，所述本体7包括上封页8、下封页9和连接上封页8和下封页9的背脊10，所述上封页8和下封页9与背脊10相对的一侧分别设有横梁6，所述横梁6的两端分别设有挂钩61。

所述背脊10的长度为29.8cm，横梁6和背脊10之间的距离为23.3cm。

所述夹子放置在培养架上是通过横梁6的两端搭在两侧悬挂杆4上实现的。

本实施例所述的100条/ml二龄幼虫悬浮液为大豆孢囊线虫(heteroderaglycinesichinohe)。

观察大豆孢囊线虫在大豆根部从接种后10天到40天(dpi)的一个孢囊发育过程如图2。从培养袋中收集的干净的雄虫如图3。本实施例方法培养后的大豆根系照片如图4。对照组的温室盆栽法培养后的大豆根系照片如图5。

通过计算可知：采用本方法培育相同植株数量的大豆孢囊线虫与营养钵培养相比节省空间约73.5％，同等接种量，相同大豆品种东升1号孢囊数统计，营养钵培养法统计的孢囊数范围35-151个，采用本方法统计的孢囊数范围32-68个，虽然最高数目低于营养钵培养统计的孢囊数目，但采用该方法孢囊的生长易于观察，调查结果的平行性明显好于传统的营养钵法，同时实验操作时间节省40％-50％左右。

实施例2：

采用与实施例1相同的方法培养大豆感病对照品种lee、抗病品种peking和抗线2号，同时传统的营养钵培养法作为对照组。

通过计算可知：同等接种量的情况下，感病对照品种lee统计得到的孢囊数范围66-87，抗病品种peking以及抗线2号统计得到的孢囊数均为0，虽然最高数目低于营养钵培养统计的孢囊数目，但抗感能够很好的被区分，且采用该方法调查结果的平行性明显好于传统的营养钵法，同时实验操作时间节省40％-50％左右。