一种酶法高效制备低分子量鱼皮胶原蛋白肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶法高效制备低分子量鱼皮胶原蛋白肽的方法，特别涉及一种利 用海洋胶原蛋白酶MCP-01高效制备低分子量鱼皮胶原蛋白肽的方法，属于生物技术技术 领域。
【背景技术】
[0002] 我国的渔业产业历史悠久，水产品产量占世界的1/3,拥有世界1/4的渔船，1/6 的捕捞量，近70%的养殖产量。全国有渔业劳动力约1400万，养殖面积780万公顷，渔船 100万艘，渔业产值6752亿元人民币。2010年我国水产品产量5373万吨，约占全球产量的 30%。我国作为水产养殖大国，占世界养殖水产品产量的70%以上。据我国海关总署统计， 2010年我国水产品出口总额达到138. 28亿美元，继续位居世界首位。在如此大的鱼类产品 加工中必然会产生大量的鱼皮等下脚料，鱼皮作为渔业加工的副产品，其中胶原蛋白的含 量占其蛋白质总量的80%以上，而大多数企业并未将其加工利用而是直接掩埋丢弃，不仅 会造成环境污染，更是对资源的一种极大浪费。因此以鱼皮作为一种新型的胶原资源提取 胶原蛋白或生产新型的食物产品提高鱼副产品的附加值，不仅可以缓解巨大的胶原蛋白资 源需求压力，有效地避开宗教信仰和习俗争议，还能有效避免资源浪费及环境污染。科学证 实，天然蛋白质经水解后所产生的多肽具有免疫调节、激素调节降血压、降血脂、抗疲劳、抗 氧化等生理调节功能，是当前国际医药界、食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功 能因子。胶原蛋白肽可用于开发多种功能性健康食品；同时，胶原多肽以其独特的分子结构 和较小的分子量、良好的渗透性、与皮肤良好的相容性等优势，还可作为保湿剂及口服液应 用于化妆品和保健品行业中。
[0003] 胶原蛋白活性肽的获得方法包括从天然生物体中提取、通过化学方法和重组DNA 技术合成、体外水解蛋白质等。然而天然产物中活性肽含量很少，只能提取用于试验研究； 化学合成法成本高，副产物对人体有害；重组DNA技术合成法多用于生产长肽和蛋白质，而 许多活性肽却是短肽。所以体外水解蛋白质成为获得活性肽的有效方式。目前已用于商业 化小肽制备的酶有植物性蛋白酶、细菌性蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白酶（胰酶、胶原酶） 等几大类。这些酶均具有降解胶原蛋白或弹性蛋白的能力。但是目前尚没有酶解鱼皮制备 鱼皮胶原蛋白肽的适冷胶原蛋白酶的报道，也没有商品化的适冷鱼皮胶原蛋白酶。
[0004] 目前市面上所售商品化胶原蛋白肽大都是由多种商业化的酶制剂共同酶解胶原 材料制备而成，普遍存在两方面的问题：（1)分子量范围分布广泛且肽段分子量较高，从 1000~10000不等，不能满足对分子量更小且分布均一的小肽产品的市场需求，且研究表 明2~5个氨基酸的短肽链可以通过两类肽转运载体直接进入血液，即平均分子量低的小 肽更快的被吸收，平均分子量高的短肽受胃消化过程的影响十分显著，即分子量越高，小肽 的水溶性及组织吸收性都会受到不同程度的影响。（2)酶解鱼皮制备胶原蛋白肽的产品得 率较低，酶解过程结束后，残留大量未被酶解的鱼皮底物，造成大量的鱼皮原料的浪费，提 高了生产成本，严重降低了企业效益。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种酶法高效制备低分子量鱼皮胶原蛋白肽的 方法。该方法利用适冷蛋白酶MCP-01高效酶解鱼皮，获得低分子量的鱼皮胶原蛋白肽，提 尚鱼副广品的附加值，变废为宝。
[0006] -种酶法高效制备低分子量鱼皮胶原蛋白肽的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将预处理后的鱼皮打碎后，按照1~30U/g的量加入MCP-01酶液，在37~ 40°C、150~170rpm，pH为7~7. 5的条件下，酶解0· 5~2h后，制得反应液；
[0008] (2)将步骤（1)制得的反应液灭酶活，然后经固液分离，纯化，制得低分子量鱼皮 胶原蛋白肽。
[0009] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，预处理后的鱼皮为经去除脂肪和去除灰分 后的鱼皮。进一步优选的，去除脂肪步骤如下：
[0010] 将鱼皮经水冲洗干净后，采用浓度0. 08~0. 12M的NaOH溶液浸泡10~14h，水洗 至中性，制得去除脂肪的鱼皮。
[0011] 进一步优选的，去除灰分步骤如下：
[0012] 将去除脂肪的鱼皮浸入浓度为0. 25~0. 35M的盐酸中3~5h，水洗纸中性，制得 去除灰分的鱼皮。
[0013] 根据本发明优选的，所述加入MCP-01酶液后，反应体系中打碎后的鱼皮与反应体 系体积的比例为（〇. 5~1) : 1，单位g/mL。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中每克预处理后的鱼皮加入20U的MCP-01酶 液，酶解时间1. 5h，酶解温度37°C。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的MCP-01酶液采用如下方法制备：
[0016] 将深海细菌（Pseudoalteromonassp. )SM9913活化后，接种于液体种子培养基中， 在15~20°C条件下震荡培养20~28h，然后按体积百分比1 %~5%接种于发酵培养基中， 12~18°C震荡培养72~84h，固液分离，制得MCP-01酶液。
[0017] 进一步优选的，所述活化为在15~20°C条件下，于活化培养基中活化2~3天；
[0018] 所述活化培养基组分如下，均为重量份：
[0019] 蛋白胨0. 8~1. 0份，酵母粉0. 5~0. 75份、琼脂1. 0~1. 5份，人工海水100份， pH为 7. 5 ~8. 0。
[0020] 进一步优选的，所述液体种子培养基组分如下，均为重量份：
[0021] 蛋白胨0· 8~1. 0份，酵母粉0· 5~0· 75份，人工海水100份，pH为7. 5~8. 0。
[0022] 进一步优选的，所述发酵培养基组分如下，均为重量份：
[0023] 麸皮 1 份，豆柏 2 份，玉米粉 2 份，CaCl2 0· 1 份，Na2HP04 · 12H20 1 份，ΚΗ2Ρ04 0· 03 份，人工海水100份，pH为8. 0。
[0024] 进一步优选的，所述的固液分离为在4°C、10000~14000rpm离心15~30min。
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中灭酶活为在90~100°C的水浴锅中灭酶活 5 ~10min〇
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中固液分离为在4°C条件下，13000r/min离心 10 ~15min〇
[0027] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中纯化为经孔径为50μm的过滤装置过滤后，-80 °C冷冻干燥。
[0028] 所述步骤⑴中所述深海适冷菌假交替单胞菌株（Pseudoalteromonas sp.SM9913)，购自中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种 保藏号CCTCCN0:M2010223。
[0029] 有益效果
[0030] 1、通过本发明所述制备方法获得的鱼皮胶原蛋白肽的得率为：按照鲜鱼皮中 21. 0%的干物质比例计算，肽粉干重得率（肽粉干重/鱼皮干重）约为71. 1 ±2. 8%，尚于 现有酶解方法获得的产量；
[0031] 2、通过本发明所述制备方法获得的鱼皮胶原蛋白肽的肽含量为96. 7±0. 35%，高 于现有胶原蛋白肽含量92%;
[0032] 3、通过本发明所述制备方法获得的鱼皮胶原蛋白肽的肽段分子量集中分布于 300~800之间，肽段分子量小且分布均一，具有更高的水溶性及消化吸收性，预示着其在 医药、食品、化妆品等高附加值领域中有巨大的应用潜力；
[0033] 4、通过本发明所述制备方法酶解鱼皮胶原蛋白肽的酶用量低，极大降低了酶的使 用成本；
[0034] 5、鱼皮是鱼类加工副产品且含有丰富的胶原蛋白，难以被消化和降解，本发明用 鱼皮为原料，利用酶解的方法制备胶原蛋白肽，不仅提高了鱼副产品的附加值，而且具有很 好的环境效益和社会效益。
【附图说明】
[0035] 图1、鱼皮底物残留量与酶解时间、酶用量关系的曲线图；
[0036] 图2、MALDI-T0F图谱分析鱼皮胶原蛋白肽分子量（600-3000)分布情况；
[0037] 图3、MALDI-T0F图谱分析鱼皮胶原蛋白肽分子量（300-1000)分布情况；
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0039] 实施例中所述深海嗜冷菌（Pseudoalteromonassp. )SM9913菌株购自中国典型培 养物保藏中心，地址：中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号CCTCCN0:M2010223。
[0040] 鱼皮购自大鱼岛集团，人工海水为购自青岛渔业市场海盐按照产品说明书进行配 制获得，麸皮、豆柏、玉米粉购自山东省农