本发明涉及生物
技术领域：
中，具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用。
背景技术：
：α-半乳糖苷酶又称蜜二糖酶，能够水解蜜二糖、棉籽糖、水苏糖等寡糖的末端半乳糖残基。α-半乳糖苷酶来源于植物和细菌、真菌、放线菌、酵母菌等多种微生物。不同来源的α-半乳糖苷酶在基因结构、分子量大小、等电点、催化活性等方面有很大的差异。α-半乳糖苷酶是一种糖蛋白，分子量介于30-400kDa之间，蛋白质和糖基通过共价键连接，其中糖基主要有6-8个甘露糖和乙酰葡萄糖胺单糖组成。该酶的应用领域主要包括以下几个方面：1、在食品行业中的应用。豆类是人们营养的主要蛋白质来源，但由于豆类产品中普遍存在α-半乳糖苷类寡糖的抗营养因子，而人的消化道中又不能产生降解这类寡糖的α-半乳糖苷酶。这类寡糖经过大肠微生物发酵，容易产生胀气，影响营养物质的消化和吸收。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以用来水解甜菜中的棉籽糖，降低糖蜜粘度，促进蔗糖结晶，提高蔗糖的产量和质量。2、在饲料工业中的应用。在单胃动物饲料中，豆粕和杂粕的中半乳糖苷类寡糖含量很高，被后肠道微生物发酵后，产生胀气、腹泻、厌食等，从而影响营养物质的消化和吸收，进而影响动物生产性能。有研究表明，在肉鸡玉米-豆粕型日粮中添加α-半乳糖苷酶，可以显著提高肉仔鸡生长性能、能量和养分表观代谢率及消化酶的活性。3、在医疗领域中的应用。α-半乳糖苷酶在医疗领域主要用于治疗法布里病、血型转换和制备环糊精衍生物。B型血与O型血的唯一差别在于红细胞表明糖链最外端多出一个以α-1,3糖苷键连接的半乳糖基，可将这个糖基用α-半乳糖苷酶切掉，实现B型血转变成O型血。此外，α-半乳糖苷酶在造纸业中也有一定的应用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其相关生物材料。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质，其名称为galC，galC是如下A1)-A7)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92-817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87-817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87-831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；A6)将A1)-A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A7)在A1)-A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1的第92-817位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签。所述标签可为表1所示标签，但不限于表1中的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。GhNAC79可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。GhNAC79的编码基因可通过将序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本发明还提供了与galC相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：B1)编码galC的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：1)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；2)序列表中序列4的第43-2223位所示的cDNA分子或DNA分子；3)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；4)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；5)在1)或2)或3)或4)的核苷酸序列的5′或3′端添加标签的编码序列得到的编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；6)与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；7)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码galC的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的galC的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码galC且具有galC功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码galC的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有编码galC的核酸分子的表达盒(galC基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达galC的DNA，该DNA不但可包括启动galC基因转录的启动子，还可包括终止galC基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的载体构建含有所述galC基因表达盒的重组载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pPICZαA质粒。B3)所述重组载体可含有序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的用于编码galC的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pPICZαA-galC或pPICZαA-galC-Y。所述pPICZαA-galC为将pPICZαA质粒的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子得到的重组质粒。所述pPICZαA-galC能表达序列1所示的蛋白质。所述pPICZαA-galC-Y为将pPICZαA质粒的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA分子得到的重组质粒。所述pPICZαA-galC-Y能表达序列5所示蛋白质。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为毕赤酵母，如毕赤酵母x-33。上述生物材料中，所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入所述微生物得到的表达galC的重组微生物。所述重组微生物具体可为将所述pPICZαA-galC或所述pPICZαA-galC-Y导入所述微生物得到的重组微生物。在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为将所述pPICZαA-galC或所述pPICZαA-galC-Y导入毕赤酵母x-33中得到的重组酵母x-33-pPICZαA-galC或x-33-pPICZαA-galC-Y。上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。为解决上述技术问题，本发明还提供了galC的制备方法，所述方法包括：培养含有galC的编码基因的表达盒的重组微生物，使galC的编码基因表达，得到表达galC的重组微生物培养物；纯化所述重组微生物培养物得到所述蛋白质。上述galC的制备方法中，所述galC的编码基因可为上述生物材料中B1)所述核酸分子。上述galC的制备方法中，所述含有galC的编码基因的表达盒可为上述生物材料中B2)所述表达盒。上述galC的制备方法中，所述重组微生物可为上述生物材料中所述重组微生物。上述galC的制备方法中，所述纯化所述重组微生物培养物可通过AKTAPure蛋白纯化系统或亲和层析进行。所述亲和层析可为镍柱亲和层析。所述纯化所述重组微生物培养物还可包括将为便于纯化的标签切除的步骤。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种α-半乳糖苷酶制剂，所述α-半乳糖苷酶制剂包含galC或所述生物材料。上述α-半乳糖苷酶制剂，可以galC或所述生物材料作为其活性成分，还可将galC或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。上述α-半乳糖苷酶制剂可为所述重组微生物的发酵产物。在本发明的一个实施例中，所述发酵产物为所述x-33-pPICZαA-galC的发酵产物，具体为所述x-33-pPICZαA-galC的发酵上清液。为解决上述技术问题，本发明还提供了含有α-半乳糖苷键物质的降解方法，所述方法包括以α-半乳糖苷键物质为底物用galC进行催化反应，完成所述α-半乳糖苷键物质的降解。上述方法中，所述用galC进行催化反应可用含有galC的物质进行催化反应。所述含有galC的物质可为上述重组微生物的发酵产物。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：X1、galC在作为α-半乳糖苷酶中的应用；X2、所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶中的应用；X3、galC或所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶产品中的应用；X4、galC或所述生物材料在降解含有α-半乳糖苷键物质中的应用；X5、galC或所述生物材料在促进动物对含有α-半乳糖苷键物质的消化和/或吸收中的应用；X6、galC或所述生物材料在促进动物饲料营养物质的消化和/或吸收中的应用；X7、galC或所述生物材料在制备蔗糖和/或半乳糖中的应用。本发明中，所述含有α-半乳糖苷键物质可为含有α-半乳糖苷键的寡糖或含有所述寡糖的物质，如豆浆。所述寡糖具体可为棉籽糖或水苏糖。本发明的galC具有α-半乳糖苷酶活性，含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵上清液的α-半乳糖苷酶活性可达660U/mL。galC的α-半乳糖苷酶酶活的最适为4.67，最适温度为50℃。实验证明，本发明的galC及含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α-半乳糖苷键的物质：利用含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵上清液水解豆浆，在酶解3小时时，棉籽糖和水苏糖的降解率均可达到100％。表明，本发明的galC及含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α-半乳糖苷键的物质，也可用于制备α-半乳糖苷酶制剂。附图说明图1为不同pH值条件下，α-半乳糖苷酶galC的相对催化活性。图2为不同温度条件下，α-半乳糖苷酶galC的相对催化活性。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的pPICZαA质粒为Invitrogen的产品。下述实施例中的毕赤酵母x-33为Invitrogen的产品。下述实施例中的BMGY培养基的溶剂为水，各组分及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)酵母提取物，2％(质量百分比浓度)蛋白胨，1.34％(质量百分比浓度)YNB，4×10-7g/mL生物素，1％(体积百分比浓度)甘油，100ml/L1M磷酸钾缓冲液(PH6.0)。下述实施例中的BMMY培养基的溶剂为水，各组分及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)酵母提取物，2％(质量百分比浓度)蛋白胨，1.34％(质量百分比浓度)YNB，4×10-7g/mL生物素，100ml/L1M磷酸钾缓冲液(PH6.0)。实施例1、α-半乳糖苷酶galC的制备本发明提供了一个来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)的α-半乳糖苷酶基因(galC基因)，galC基因的序列为序列表中序列2，其编码序列(CDS)为序列3(将序列3所示的DNA片段命名为galC编码基因)，序列3编码序列1的第92-817位所示的α-半乳糖苷酶(galC)，将序列3进行密码子的优化，得到编码galC的序列4的第43-2223位，将序列4的第43-2223位所示的galC编码基因记为galC-Y编码基因。1、重组质粒及重组菌的制备将pPICZαA质粒的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的galC编码基因，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pPICZαA-galC。pPICZαA-galC能表达序列1所示的galC融合α信号肽的蛋白质，将该蛋白质命名为galC融合蛋白1，galC融合蛋白1的表达由AOX1启动子启动。人工合成序列4所示的DNA分子，该DNA分子由在galC-Y编码基因的5′端添加His标签的编码序列得到。将pPICZαA质粒的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA分子，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pPICZαA-galC-Y。pPICZαA-galC-Y能表达序列5所示的galC融合His标签与α信号肽的融合蛋白质，将该融合蛋白质命名为galC融合蛋白2，galC融合蛋白2的表达由AOX1启动子启动。序列5的第106-831位为galC的序列。将重组质粒pPICZαA-galC用SacI酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化重组质粒pPICZαA-galC的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA-galC。x-33-pPICZαA-galC胞内表达galC融合蛋白1，galC融合蛋白1分泌至胞外时α信号肽被切除，得到序列1的第87-817位所示的galC融合蛋白，将该融合蛋白记为galC融合蛋白3。见Invitrogen公司pPICZ表达手册第11页SignalSequenceProcessing。将重组质粒pPICZαA-galC-Y用SacI酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化重组质粒pPICZαA-galC-Y的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA-galC-Y。x-33-pPICZαA-galC-Y胞内表达galC融合蛋白2，galC融合蛋白2分泌至胞外时α信号肽被切除，得到序列5的第87-831位所示的galC融合His标签的融合蛋白，将该融合蛋白记为galC融合蛋白4。将pPICZαA质粒用SacI酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化pPICZαA质粒的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA，作为空载体对照。2、galC融合蛋白的表达纯化与酶活测定2.1galC融合蛋白的表达纯化将步骤1的x-33-pPICZαA-galC接种于含20mLBMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃、280rpm震荡培养至OD600为4，然后离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600约为1.0，得到菌体悬液，向该菌体悬液中加入甲醇，得到诱导菌液，该诱导菌液中甲醇的浓度为0.5％(V/V)。将诱导菌液在30℃、280rpm下震荡培养，每24h向培养液中添加一次甲醇，每次添加甲醇后，培养液中甲醇的浓度均为0.5％(V/V)，连续培养96小时后，得到发酵液，将发酵液12,000rpm离心10min，弃沉淀，得到x-33-pPICZαA-galC发酵上清液。按照上述发酵方法，将x-33-pPICZαA-galC替换为x-33-pPICZαA-galC-Y，其他步骤均不变，得到x-33-pPICZαA-galC-Y发酵上清液。按照上述发酵方法，将x-33-pPICZαA-galC替换为x-33-pPICZαA，其他步骤均不变，得到空载体发酵上清液。将x-33-pPICZαA-galC发酵上清液按照如下方法进行纯化得到galC融合蛋白3：在冰水浴中，向10mLx-33-pPICZαA-galC发酵上清液中加入硫酸铵使其饱和度为75％沉淀蛋白质，12000rpm离心30min，收集沉淀。将沉淀溶于1mL0.1MPB溶液中，得到溶液1。用AKTAPure蛋白纯化系统纯化溶液1：所用柱子填料为Bio-Rad公司的UNOsphereQ；所用洗脱液为NaCl浓度为0-1M的NaCl溶液(NaCl溶液的溶质均为NaCl，溶剂均为20mMTris-HCl)，按照NaCl浓度由低到高的顺序进行梯度洗脱；整个纯化过程在4℃层析柜中进行。收集紫外检测器显示有蛋白峰的开始收集，得到对应于不同蛋白峰的流出液；将各流出液进行12％SDS-PAGE电泳分析，在100kDa处有单一蛋白条带的流出液即为含有galC融合蛋白3的流出液)，将该流出液记为galC纯化后的galC溶液，采用BSA法(Bio-Rad公司试剂盒)测定蛋白浓度，galC溶液中的蛋白浓度为0.35mg/mL。将x-33-pPICZαA-galC-Y发酵上清液利用饱和硫酸铵水溶液进行沉淀，将沉淀溶于25mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液中后，利用25mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液透析除盐，得到透析液。利用Ni柱亲和层析的方法纯化透析液，利用100mM咪唑水溶液洗脱，收集流出液，利用12％SDS-PAGE电泳分析不同体积流出液中的蛋白质，将仅含有目的蛋白的流出液记为galC-Y溶液，测定galC-Y溶液中的蛋白浓度，galC-Y溶液中galC融合蛋白4的浓度为28.5μg/mL。将galC溶液、galC-Y溶液与空载体发酵上清液进行聚丙烯酰胺电泳，电泳结果显示，空载体发酵上清液中不含有目的蛋白，galC溶液与galC-Y溶液均含有单一条带的目的蛋白，galC溶液中目的蛋白galC融合蛋白3的大小为100kDa，galC-Y溶液中目的蛋白galC融合蛋白4的大小为100kDa。2.2galC融合蛋白酶活测定以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖为底物，检测galC溶液中galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活。α-半乳糖苷酶酶活定义为：在pH4.66、50℃条件下，每分钟内底物降解释放1μmol对硝基酚所需的酶量为一个酶活单位(U)。1)对硝基酚标准曲线的绘制：准确称取对硝基苯酚1.3912g，用0.5MNa2CO3水溶液定容至1L，配成0.01M的母液。取1mL母液用0.5MNa2CO3水溶液定容至100mL，配成0.1mM的对硝基苯酚工作液。分别吸取对硝基苯酚工作液0、1、2、4、8、12、16、20mL，用0.5MNa2CO3水溶液定容至50mL，配成浓度分别为0、0.002、0.004、0.008、0.016、0.024、0.032和0.04mM的标准梯度溶液。405nm波长下测定各标准梯度溶液的吸光值。以吸光值为横坐标，对硝基苯酚浓度为纵坐标，绘制标准曲线。2)酶活测定将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶于200mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH4.66)缓冲液(该缓冲液为由0.1M柠檬酸水溶液和0.2M磷酸氢二钠水溶液制备的pH为4.66的缓冲液)，得到对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖浓度为10mM的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液。将步骤2的galC溶液利用超滤管进行超滤，将galC所处液体环境替换为200mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH4.66)缓冲液，得到pH4.66的galC溶液，作为酶液。分别将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液与pH4.66的galC溶液于50℃预热10min，然后再各吸取溶液1ml充分混合，于50℃恒温水浴10min，得到混合液；向混合液中加入8ml碳酸钠水溶液(碳酸钠的浓度为0.5M)，振荡混匀，终止反应。以蒸馏水调零，测定吸光度OD405值。通过与对硝基酚标准曲线对照，计算酶解反应产生的对硝基酚的量。按照上述方法，将步骤1的galC溶液替换为空载体发酵上清液，作为对照。按照上述方法，将步骤1的galC溶液替换为galC-Y溶液，测定galC-Y溶液中galC融合蛋白4的α-半乳糖苷酶酶活。实验结果表明，空载体发酵上清液没有α-半乳糖苷酶酶活，在pH4.66、50℃条件下galC溶液中galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活为30U/mL，galC-Y溶液中galC融合蛋白4的α-半乳糖苷酶酶活为73U/mL。利用肠激酶充分酶切galC-Y溶液中的蛋白质，得到酶切反应液；将酶切反应液过Ni柱，收集流出液，得到含有序列1的第92-817位所示galC的溶液，将该溶液命名为galC溶液1。按照上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法将步骤1的galC溶液替换为galC溶液1，测定galC溶液1中galC的α-半乳糖苷酶酶活及其比活力，结果显示，galC的比活力为150.9U/mg。3、galC在5L发酵罐中的酶活测定将步骤1的x-33-pPICZαA-galC接种于装有200mLBMGY培养基的3L摇瓶中，在30℃、280rpm下震荡培养过夜，得到OD600约为3.0的种子液。然后配制2LBMGY培养基，装入5L自动控制发酵罐中，在121℃下灭菌后，冷却至室温，接种上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5.5，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％。经测定，接入种子液24h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入流加50％(V/V)甘油水溶液阶段，流速为60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入甲醇流加阶段(将加入甲醇时记为诱导第0h)，流速为12mL/h，同时控制溶氧为20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，停止添加甲醇，直至溶氧回升)。3h后，将甲醇流速调到24mL/h，再过2h，将流速调到30mL/h，并保持到发酵最后，得到发酵液，将发酵液离心得到发酵上清液。按照步骤2中2.2中2)的酶活测定方法，将galC溶液替换为上述发酵上清液，其他步骤不变，测定酶活。酶活分析结果表明，诱导到第120h的发酵上清液α-半乳糖苷酶酶活力达到660U/mL。4、galC活性最适pH按照如下方法测定α-半乳糖苷酶galC在pH为2、3、4、4.34、4.67、5、5.34、5.67、6、7和8下的相对催化活性，具体步骤如下：将步骤2的galC溶液利用超滤管进行超滤，将galC融合蛋白3所处液体环境分别替换为不同pH的缓冲溶液，得到不同pH的galC溶液，作为酶液；利用不同pH的缓冲溶液制备10mM的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液，作为底物溶液。所用不同pH的缓冲溶液的pH分别为2、3、4、4.34、4.67、5、5.34、5.67、6、7和8，各pH的缓冲溶液均为由0.1M柠檬酸水溶液和0.2M磷酸氢二钠水溶液制备的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。取0.4mL底物溶液和0.4mL酶液于50℃水浴反应10min，加入3.2mL0.5M碳酸钠水溶液终止反应，于405nm处进行吸光度测定，根据相应的对硝基酚标准曲线确定galC的最适pH。结果如图1所示。结果显示，galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活最适pH为4.67。5、α-半乳糖苷酶galC活性最佳温度按照如下方法测定galC融合蛋白在温度为10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下的相对催化活性，具体步骤如下：各取步骤4的pH为4.67的底物溶液与pH为4.67的酶液0.4mL混合后，分别于10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下水浴反应10min，加入3.2mL0.5M碳酸钠水溶液终止反应，于405nm处进行吸光度测定，根据相应的对硝基酚标准曲线确定galC的最适温度。结果如图2所示。结果显示，galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活最适温度为50℃。实施例2、α-半乳糖苷酶galC可以降解豆浆中寡糖1、豆浆的制备称取100g黄豆，用自来水室温浸泡过夜后放入豆浆机中打碎出浆，即得到豆浆，豆浆总体积为1L，将豆浆8000rpm离心10min后取上清进行酶解实验。2、galC可以降解豆浆中寡糖实验设置三个处理组和三个对照组，每组两个平行实验。三个处理分别为加酶量5U/ml、10U/ml、15U/ml，即处理1、处理2和处理3。具体操作步骤如下：处理1、处理2和处理3的操作步骤如下：调整实施例1步骤3的发酵上清液的浓度后与豆浆上清等体积混合，得到混合液，处理1的混合液中galC的酶量为5U/ml，处理2的混合液中galC的酶量为10U/ml，处理3的混合液中galC的酶量为15U/ml。将各混合液25℃水浴条件下进行酶解反应3h，80℃加热5min将酶灭活，离心取上清液作为待测液，分别得到处理1待测液、处理2待测液和处理3待测液。三个对照组(对照1、对照2和对照3)的处理方式如下：对照组1-3均将豆浆上清和与豆浆上清等pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液等体积混合后25℃水浴条件下孵育3h、80℃孵育5min，分别得到对照1待测液、对照2待测液和对照3待测液。将各待测液及未进行酶解的豆浆分别用水稀释500倍后用0.1μm滤膜过滤后进行离子色谱分析，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析各待测液与豆浆，测定α-半乳糖苷酶产物半乳糖与蔗糖以及α-半乳糖苷酶底物棉籽糖与水苏糖的含量，计算降解率，降解率＝(C0-C)/C0×100％，C——实验组稀释液中棉籽糖或水苏糖离子色谱积分峰面积C0——对照组稀释液中棉籽糖或水苏糖离子色谱积分峰面积所用标准品为：水苏糖：(水苏糖，95％)，北京百灵威科技有限公司No.578189棉籽糖：D-(+)-Raffnosepentahydrate，德国Dr.EhrenstorferGmbH公司货号：C16806000离子色谱分析条件如下：离子色谱仪：DIONEXICS-3000分析柱：CarboPacPA10(250mm×4mm)；保护柱：CarboPacPA10(50mm×4mm)淋洗液条件：A相(NaOH溶液250mm)，B相(纯水)梯度洗脱条件如下：时间A相(％，体积百分比)B相(％，体积百分比)0-14min(包括14min)7.592.514-22min(包括22min)802022-30min7.592.5流速1.0mL/min；检测器：ED3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，四电位波形检测；进样量：25μL；柱温：30℃。按照上述方法，将酶解反应时间由3h替换为2h，其他不变，检测豆浆中寡糖的降解率。表2、不同浓度的酶处理豆浆2h和3h，豆浆中寡糖的降解率(％)结果如表2所示。结果显示，在酶解时间为3小时时，棉籽糖和水苏糖的降解率均可达到100％。<110>中国农业大学<120>具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>817<212>PRT<213>米曲霉（Aspergillusoryzae）<400>1MetArgPheProSerIlePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSer151015AlaLeuAlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThrAlaGln202530IleProAlaGluAlaValIleGlyTyrSerAspLeuGluGlyAspPhe354045AspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeu505560PheIleAsnThrThrIleAlaSerIleAlaAlaLysGluGluGlyVal65707580SerLeuGluLysArgGluAlaGluAlaGluPheMetAlaGlnGluThr859095SerSerAsnAsnAlaValValAlaAspGlyLysThrPheAlaLeuAsn100105110GlyGluAsnValSerTyrArgPheArgValAsnGluThrThrGlyAsp115120125LeuValSerAspHisPheGlyGlySerIleThrGlyAspLeuPhePro130135140GlyPheGlyAlaGluAlaLeuGlyGlyTrpValGlyLeuAlaGlyArg145150155160PheArgArgGluPheProAspHisGlyArgGlyAspPheArgIlePro165170175AlaValArgIleArgGlnGluAlaGlyTyrThrValThrAspLeuGln180185190TyrGlnSerTyrSerValIleProGlyLysProAlaLeuProGlyLeu195200205ProSerThrPheGlySerGluGluAspValThrThrLeuValValHis210215220LeuTyrAspAsnTyrSerSerIleAlaValAspLeuSerTyrSerIle225230235240PheProLysTyrAspAlaIleValArgSerAlaAsnValThrAsnLys245250255GlyThrGlnAsnIleThrValGluAlaLeuSerSerPheSerPheAsp260265270PheProTyrGluAspLeuGluMetIleSerLeuArgGlyAspTrpAla275280285ArgGluAlaHisArgGlnArgArgLysValGluTyrGlyLeuGlnGly290295300PheGlySerSerThrGlyPheSerSerHisLeuHisAsnProPheLeu305310315320AlaIleValHisProSerThrThrGluSerGlnGlyGluAlaTrpGly325330335PheAsnLeuValTyrThrGlySerPheSerValAspValGluLysGly340345350SerGlnGlyLeuThrArgAlaLeuLeuGlyPheAsnProSerGlnLeu355360365SerTrpGlnLeuGlyAlaGlyGluThrLeuThrSerProGluCysVal370375380SerValTyrSerSerAspGlyIleGlyGlyMetSerArgSerPheHis385390395400ArgLeuTyrArgAsnHisLeuIleLysSerLysPheAlaThrSerAsp405410415ArgProProLeuLeuAsnSerTrpGluGlyLeuTyrPheAspTyrAsn420425430GluSerThrIleTyrArgLeuAlaGluGluSerAlaAlaLeuGlyVal435440445LysLeuPheValMetAspAspGlyTrpPheGlyAspLysTyrProArg450455460ValSerAspAsnAlaGlyLeuGlyAspTrpValProAsnProAspArg465470475480PheProAspGlyLeuThrProLeuValGluAspValThrLysLeuLys485490495AlaGlyAsnSerSerThrAspLeuArgPheGlyLeuTrpValGluPro500505510GluMetAlaAsnProAsnSerThrLeuTyrHisGluHisProAspTrp515520525ValLeuHisAlaGlyGlnTyrProArgThrLeuGlnArgAsnGlnLeu530535540ValLeuAsnLeuAlaLeuProGluValGlnAspTyrIleIleAspGlu545550555560IleThrAsnIleLeuAsnSerSerAlaIleSerTyrValLysTrpAsp565570575PheAsnArgAlaMetHisGluThrProSerProSerAsnAspHisGlu580585590TyrIleLeuGlyMetTyrArgValPheAspThrLeuThrThrArgPhe595600605ProAspValLeuTrpGluGlyCysAlaSerGlyGlyGlyArgPheAsp610615620ProGlyValLeuGluTyrPheProGlnIleTrpThrSerAspAsnThr625630635640AspAlaLeuMetArgIleThrIleGlnLeuGlyThrSerLeuAlaTyr645650655ProProSerAlaMetGlyAlaHisLeuSerAlaValProAsnAlaGln660665670ThrGlyArgThrIleProValLysPheArgGlyHisValAlaMetMet675680685GlyGlySerPheGlyLeuGluLeuAspProAlaGluLeuGlnGluAsp690695700GluLysAlaGluValProGlyLeuIleAlaLeuAlaGluLysValAsn705710715720ProIleIleLeuThrGlyAspMetTrpArgLeuArgLeuProGluGlu725730735SerAsnTrpProAlaValLeuPheIleSerGluAspGlyAsnGlnAla740745750ValLeuPheTyrPheGlnLeuGlyProAsnValAsnHisAlaThrPro755760765TrpLeuArgLeuGlnGlyLeuAspProLysAlaThrTyrSerValAsp770775780GlyAsnGlySerTyrSerGlyAlaAlaLeuMetAsnMetGlyLeuGln785790795800TyrLysPheGluSerAspTyrAspSerLysValValPheLeuGlnLys805810815Gln<210>2<211>2319<212>DNA<213>米曲霉（Aspergillusoryzae）<400>2atggcgcaggaaacttcaagcaacaatggtaagtgaagccacataagctcgtccttgcta60gcactcttccaagcttcacttccaattgacactagtacagcagttgtcgcggacggcaaa120acctttgccctcaatggagagaatgtctcataccgcttccgagtgaacgagaccacgggc180gacctagtgtcagatcatttcggcggcagtatcactggcgatctcttcccaggatttggt240gccgaggcacttggcggctgggttggtttggctggccgttttcgccgtgagtttccagat300cacggccggggagattttcggattcccgccgttcggattcgtcaagaggcaggctacact360gtgactgatctgcagtatcagtcatactcggtgataccgggaaagcctgctttgcccggt420ctgccttcaacctttggcagtgaagaggatgtcacaactttggtggttcatctgtacgac480aactacagctccatcgctgtggatctgtcgtactcaatcttccctaaatatgacgccatt540gtgcgcagcgcgaacgttacgaacaagggtactcaaaatatcacagttgaggcactgtcc600agcttcagcttcgatttcccatacgaagatcttgaaatgattagcctcaggggcgactgg660gcgagagaagcccaccgtcagaggcgaaaggtggaatacggactccaagggtaagttgct720gttttataaaacccaagaagaaagcagcaaattaatgttccacccgtgatatacagcttc780ggaagtagcactggtttctcctctcacctgcacaacccctttcttgcgatagtgcatccc840tccactacggaatctcagggtgaggcctggggatttaaccttgtctacacaggctcgttc900tccgttgatgtcgagaagggctcccagggcctcactcgcgctctgctgggattcaatccc960agtcagctgtcttggcagctgggtgcgggcgagacacttacctcgccggaatgtgtttca1020gtctactcaagtgacggcatcggcggcatgtctcgttcattccatcgcctctaccgcaac1080cacctgatcaagagcaagttcgccacatcggatcgcccgccgctgctgaacagctgggag1140ggtctgtatttcgactacaatgagagcacaatctaccgcttggctgaggagtcggccgcc1200ttgggagtgaaactgttcgttatggacgacggttggttcggcgacaagtacccccgtgta1260tcggataacgccggtctgggtgactgggtgcccaacccggaccgctttcctgacggccta1320acccccctggtggaagatgtcacgaagctgaaggcaggaaactcctcaaccgacctccgc1380tttggcctctgggttgaaccagaaatggccaaccccaactcgaccctgtaccatgagcac1440cctgactgggtgcttcatgccggccaatacccacgcaccttgcaacgcaaccagctcgtg1500ctcaatcttgctttgcctgaggtacaggactatatcatcgatgagattaccaacattctc1560aacagctcggctatttcctatgtgaagtgggacttcaaccgggcgatgcacgagacaccc1620tcccccagcaacgaccacgaatacatcctgggcatgtaccgggtgttcgacaccctgacc1680acgcgcttccccgatgttctgtgggaaggttgtgcctctggtggtggacgtttcgaccca1740ggtgtactcgagtacttcccgcagatctggacctccgacaacaccgatgccctgatgcgc1800atcaccatccagctcggtacttcactggcataccctcccagcgccatgggtgcccatctc1860tcagcagtcccgaatgcccagactggacgtaccattcctgtcaaattccgtggccacgtc1920gccatgatgggcggatcattcggtctcgaactagaccccgccgagctgcaggaggatgag1980aaggccgaagtcccgggactgattgcccttgcagaaaaggttaacccgatcatcctgact2040ggcgatatgtggcgtctcaggcttcccgaggagtctaactggccggcggtgctattcatc2100tctgaggatggtaaccaagctgtcctcttctacttccagctcggccctaatgttaaccat2160gccactccctggctcaggctgcagggattggatcctaaggccacgtatagcgttgatgga2220aacggatcgtactctggtgcggcattgatgaacatgggactgcagtacaagtttgaatcg2280gattatgatagcaaggtggtgttcttgcagaagcagtga2319<210>3<211>2181<212>DNA<213>米曲霉（Aspergillusoryzae）<400>3atggcgcaggaaacttcaagcaacaatgcagttgtcgcggacggcaaaacctttgccctc60aatggagagaatgtctcataccgcttccgagtgaacgagaccacgggcgacctagtgtca120gatcatttcggcggcagtatcactggcgatctcttcccaggatttggtgccgaggcactt180ggcggctgggttggtttggctggccgttttcgccgtgagtttccagatcacggccgggga240gattttcggattcccgccgttcggattcgtcaagaggcaggctacactgtgactgatctg300cagtatcagtcatactcggtgataccgggaaagcctgctttgcccggtctgccttcaacc360tttggcagtgaagaggatgtcacaactttggtggttcatctgtacgacaactacagctcc420atcgctgtggatctgtcgtactcaatcttccctaaatatgacgccattgtgcgcagcgcg480aacgttacgaacaagggtactcaaaatatcacagttgaggcactgtccagcttcagcttc540gatttcccatacgaagatcttgaaatgattagcctcaggggcgactgggcgagagaagcc600caccgtcagaggcgaaaggtggaatacggactccaaggcttcggaagtagcactggtttc660tcctctcacctgcacaacccctttcttgcgatagtgcatccctccactacggaatctcag720ggtgaggcctggggatttaaccttgtctacacaggctcgttctccgttgatgtcgagaag780ggctcccagggcctcactcgcgctctgctgggattcaatcccagtcagctgtcttggcag840ctgggtgcgggcgagacacttacctcgccggaatgtgtttcagtctactcaagtgacggc900atcggcggcatgtctcgttcattccatcgcctctaccgcaaccacctgatcaagagcaag960ttcgccacatcggatcgcccgccgctgctgaacagctgggagggtctgtatttcgactac1020aatgagagcacaatctaccgcttggctgaggagtcggccgccttgggagtgaaactgttc1080gttatggacgacggttggttcggcgacaagtacccccgtgtatcggataacgccggtctg1140ggtgactgggtgcccaacccggaccgctttcctgacggcctaacccccctggtggaagat1200gtcacgaagctgaaggcaggaaactcctcaaccgacctccgctttggcctctgggttgaa1260ccagaaatggccaaccccaactcgaccctgtaccatgagcaccctgactgggtgcttcat1320gccggccaatacccacgcaccttgcaacgcaaccagctcgtgctcaatcttgctttgcct1380gaggtacaggactatatcatcgatgagattaccaacattctcaacagctcggctatttcc1440tatgtgaagtgggacttcaaccgggcgatgcacgagacaccctcccccagcaacgaccac1500gaatacatcctgggcatgtaccgggtgttcgacaccctgaccacgcgcttccccgatgtt1560ctgtgggaaggttgtgcctctggtggtggacgtttcgacccaggtgtactcgagtacttc1620ccgcagatctggacctccgacaacaccgatgccctgatgcgcatcaccatccagctcggt1680acttcactggcataccctcccagcgccatgggtgcccatctctcagcagtcccgaatgcc1740cagactggacgtaccattcctgtcaaattccgtggccacgtcgccatgatgggcggatca1800ttcggtctcgaactagaccccgccgagctgcaggaggatgagaaggccgaagtcccggga1860ctgattgcccttgcagaaaaggttaacccgatcatcctgactggcgatatgtggcgtctc1920aggcttcccgaggagtctaactggccggcggtgctattcatctctgaggatggtaaccaa1980gctgtcctcttctacttccagctcggccctaatgttaaccatgccactccctggctcagg2040ctgcagggattggatcctaaggccacgtatagcgttgatggaaacggatcgtactctggt2100gcggcattgatgaacatgggactgcagtacaagtttgaatcggattatgatagcaaggtg2160gtgttcttgcagaagcagtga2181<210>4<211>2223<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4catcatcaccaccaccacgactacaaagacgacgacgacaaaatggcccaagaaacctcc60tccaacaacgccgtcgtcgccgacggaaaaaccttcgcccttaacggtgaaaacgtctct120tacagattcagagtaaatgaaaccaccggtgatcttgtctctgatcactttggtggttct180attacaggtgatttgtttccaggtttcggtgctgaagctttgggtggttgggttggtttg240gctggtagatttagaagagagtttccagatcatggtagaggtgattttagaatccctgcc300gttagaattagacaggaggctggttacactgttactgatttgcagtatcaatcttactct360gttatacctggtaagccagctttgcctggtttgccatctacttttggttctgaagaagat420gttactacccttgttgttcatttgtacgataactattcttccattgctgttgatttgtct480tactctattttccctaagtacgatgctattgttagatcagctaatgttactaataagggt540acccaaaacattactgtcgaggctttgtcctccttttcttttgattttccatacgaagat600ctggagatgattagtttgagaggtgattgggccagagaagcccatagacaaagaagaaag660gtcgaatacggattgcaaggttttggttcttccaccggtttttcctcccatttgcataac720ccatttttggccattgttcatccatctactactgaatcccaaggtgaagcttggggtttt780aatttggtttacactggttctttttccgttgacgttgagaagggttctcagggtttgact840agagctttgttgggttttaatccttctcaattgtcttggcagttgggtgctggtgagact900ttgacttctccagagtgtgtttctgtttattcttctgacggtattggaggtatgtctcgt960tcttttcatagactgtacagaaatcatcttatcaagtctaagttcgctactagtgacaga1020ccaccattattgaactcttgggaaggtctttattttgattataacgaatccaccatctac1080agactggccgaagaatccgccgctttgggtgtcaagctgtttgttatggatgatggatgg1140tttggtgataagtaccctagagtttctgataacgctggtttgggtgattgggttcctaat1200ccagatagatttcctgatggtttgactcctttggttgaggatgttactaagttgaaggct1260ggtaactcctctactgatttgagatttggtttgtgggttgaaccagagatggctaacccc1320aactctactttgtaccatgaacacccagattgggttttgcatgccggtcagtacccaaga1380actttgcagagaaaccagttggtcttgaaccttgctttgccagaagttcaagattacatc1440attgatgagattaccaacattttgaactcttctgctatttcctacgttaagtgggatttt1500aacagagccatgcatgagactccatccccctctaacgaccatgaatacattttgggtatg1560tacagagtttttgatactttgactactagattcccagatgtcttgtgggaaggttgcgca1620tccggtggtggtagatttgatcctggtgttttggaatactttcctcagatttggacctcc1680gataacactgatgccttgatgagaataactattcaattgggtactagtttggcttaccca1740ccttctgctatgggtgctcatttgtctgctgttcctaacgctcaaaccggtagaactatt1800ccagttaagtttagaggtcatgttgctatgatgggtggttcttttggtttggaattggat1860cctgctgaattgcaagaagatgaaaaggctgaagtcccaggattgattgccttggctgaa1920aaggtcaacccaattattttgactggtgatatgtggagattgagactgccagaagaatct1980aactggccagctgtgttgtttatttctgaagatggtaaccaagccgttttgttttatttt2040cagctgggtcctaacgttaaccatgccaccccttggcttagacttcaaggattggatcca2100aaggctacttattctgttgatggtaacggttcttactccggtgctgctttgatgaacatg2160ggtttgcaatacaagtttgaatccgattacgattctaaggttgtttttttgcaaaagcaa2220taa2223<210>5<211>831<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>5MetArgPheProSerIlePheThrAlaValLeuPheAlaAlaSerSer151015AlaLeuAlaAlaProValAsnThrThrThrGluAspGluThrAlaGln202530IleProAlaGluAlaValIleGlyTyrSerAspLeuGluGlyAspPhe354045AspValAlaValLeuProPheSerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeu505560PheIleAsnThrThrIleAlaSerIleAlaAlaLysGluGluGlyVal65707580SerLeuGluLysArgGluAlaGluAlaGluPheHisHisHisHisHis859095HisAspTyrLysAspAspAspAspLysMetAlaGlnGluThrSerSer100105110AsnAsnAlaValValAlaAspGlyLysThrPheAlaLeuAsnGlyGlu115120125AsnValSerTyrArgPheArgValAsnGluThrThrGlyAspLeuVal130135140SerAspHisPheGlyGlySerIleThrGlyAspLeuPheProGlyPhe145150155160GlyAlaGluAlaLeuGlyGlyTrpValGlyLeuAlaGlyArgPheArg165170175ArgGluPheProAspHisGlyArgGlyAspPheArgIleProAlaVal180185190ArgIleArgGlnGluAlaGlyTyrThrValThrAspLeuGlnTyrGln195200205SerTyrSerValIleProGlyLysProAlaLeuProGlyLeuProSer210215220ThrPheGlySerGluGluAspValThrThrLeuValValHisLeuTyr225230235240AspAsnTyrSerSerIleAlaValAspLeuSerTyrSerIlePhePro245250255LysTyrAspAlaIleValArgSerAlaAsnValThrAsnLysGlyThr260265270GlnAsnIleThrValGluAlaLeuSerSerPheSerPheAspPhePro275280285TyrGluAspLeuGluMetIleSerLeuArgGlyAspTrpAlaArgGlu290295300AlaHisArgGlnArgArgLysValGluTyrGlyLeuGlnGlyPheGly305310315320SerSerThrGlyPheSerSerHisLeuHisAsnProPheLeuAlaIle325330335ValHisProSerThrThrGluSerGlnGlyGluAlaTrpGlyPheAsn340345350LeuValTyrThrGlySerPheSerValAspValGluLysGlySerGln355360365GlyLeuThrArgAlaLeuLeuGlyPheAsnProSerGlnLeuSerTrp370375380GlnLeuGlyAlaGlyGluThrLeuThrSerProGluCysValSerVal385390395400TyrSerSerAspGlyIleGlyGlyMetSerArgSerPheHisArgLeu405410415TyrArgAsnHisLeuIleLysSerLysPheAlaThrSerAspArgPro420425430ProLeuLeuAsnSerTrpGluGlyLeuTyrPheAspTyrAsnGluSer435440445ThrIleTyrArgLeuAlaGluGluSerAlaAlaLeuGlyValLysLeu450455460PheValMetAspAspGlyTrpPheGlyAspLysTyrProArgValSer465470475480AspAsnAlaGlyLeuGlyAspTrpValProAsnProAspArgPhePro485490495AspGlyLeuThrProLeuValGluAspValThrLysLeuLysAlaGly500505510AsnSerSerThrAspLeuArgPheGlyLeuTrpValGluProGluMet515520525AlaAsnProAsnSerThrLeuTyrHisGluHisProAspTrpValLeu530535540HisAlaGlyGlnTyrProArgThrLeuGlnArgAsnGlnLeuValLeu545550555560AsnLeuAlaLeuProGluValGlnAspTyrIleIleAspGluIleThr565570575AsnIleLeuAsnSerSerAlaIleSerTyrValLysTrpAspPheAsn580585590ArgAlaMetHisGluThrProSerProSerAsnAspHisGluTyrIle595600605LeuGlyMetTyrArgValPheAspThrLeuThrThrArgPheProAsp610615620ValLeuTrpGluGlyCysAlaSerGlyGlyGlyArgPheAspProGly625630635640ValLeuGluTyrPheProGlnIleTrpThrSerAspAsnThrAspAla645650655LeuMetArgIleThrIleGlnLeuGlyThrSerLeuAlaTyrProPro660665670SerAlaMetGlyAlaHisLeuSerAlaValProAsnAlaGlnThrGly675680685ArgThrIleProValLysPheArgGlyHisValAlaMetMetGlyGly690695700SerPheGlyLeuGluLeuAspProAlaGluLeuGlnGluAspGluLys705710715720AlaGluValProGlyLeuIleAlaLeuAlaGluLysValAsnProIle725730735IleLeuThrGlyAspMetTrpArgLeuArgLeuProGluGluSerAsn740745750TrpProAlaValLeuPheIleSerGluAspGlyAsnGlnAlaValLeu755760765PheTyrPheGlnLeuGlyProAsnValAsnHisAlaThrProTrpLeu770775780ArgLeuGlnGlyLeuAspProLysAlaThrTyrSerValAspGlyAsn785790795800GlySerTyrSerGlyAlaAlaLeuMetAsnMetGlyLeuGlnTyrLys805810815PheGluSerAspTyrAspSerLysValValPheLeuGlnLysGln820825830当前第1页1 2 3