甲基对硫磷降解酶突变体及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及甲基对硫磷降解酶的突变体，进一步涉及编码甲基对硫磷降解酶突变体的基因，属于甲基对硫磷降解酶突变体的构建及其应用领域。

背景技术：

随着人类对生活要求的提高和工业生产的日益发展，许多人工合成且难以被天然微生物迅速降解的化合物进入自然界中。其中，在国内外大量生产并大面积用做杀虫剂的有机磷农药可以破坏乙酰胆碱酯酶的活性，从而引发一系列神经中毒症状，甚至死亡。因此，随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，有机磷农药对于环境的污染和生态平衡的破坏越来越受到人们的关注，如何有效的去除有机磷农药残留、降低其毒性成为世界各国研究人员普遍关注并努力攻克的热点问题。

有机磷降解酶(Organophosphorus hydrolase，EC3.1.8.1)是一种可以水解磷酯键的酶。一方面，它可以断裂有机磷农药的磷酯键使其脱毒；另一方面，由于不同种类有机磷农药的区别大都是取代基不同，所以一种有机磷降解酶往往可水解多种有机磷农药。其中，甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase，MPH)的最适底物是甲基对硫磷，酶分子结构解析和进化树分析结果表明它属于β内酰胺酶家族(PFAM accession no.PF00753)。

甲基对硫磷水解酶大都是在中国发现和分离得到的，测定了水解活性和酶学性质的只有4个，其中来源于Pseudomonas sp.WBC-3、Plesiomonas sp.M6和Ochrobactrum sp.M231的甲基对硫磷水解酶(MPH)氨基酸序列相似性很高，约为98％，它们在酶学性质上表现出的共同特点是催化甲基对硫磷的效率高，碱性条件利于催化，热稳定性较差。只有从Pseudomonas pseudoalcaligenes分离出的OPHC2具有较好的热稳定性，但是与上述几个MPH的氨基酸序列最高相似性仅有58.5％，催化甲基对硫磷的能力也相对较差。

研究人员对于MPH的异源表达进行了多方面的探索，但目前的研究结果显示MPH的表达水平还不足以满足工业化生产的需求。针对酶蛋白表达水平优化方面，研究者应用蛋白质工程等相关技术进行了多种设计方案的探索和研究。常用的策略主要包括理性设计策略，定向进化策略。定向进化技术就是在实验室中人为创造特殊的进化条件，模拟自然界进化机制(如突变、重组)使基因发生大量突变，然后定向选择出所需性质的蛋白质，这种技术的应用不仅可以在短时间内完成了自然界几百年才能完成的事情，而且还不需要了解蛋白质的空间结构和功能，适合一切蛋白质的改造，大大扩宽了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。现在普遍为大家使用的定向进化技术为：易错PCR(error-prone PCR)，DNA改组(DNA shuffling)，寡核苷酸突变(oligonucleotide-directed mutagenesis)，增加平截杂合酶制造法(incemental truncation for the creation of hybridenzymes，ITCHY)，交错延伸(stagger extension process，StEP)和随机引物体外重组法(RPR)，其中前三种是最为广泛应用。

DNA shuffling技术介绍：(称DNA改组技术，DNA体外随机拼接或称为有性PCR)，1994年由Stemmer等首次提出，该法是对一组基因群体(进化上相关的DNA序列或曾筛选出的性能改进序列)进行重组创造新基因的方法。因为该法在DNA片段组装过程中也可能引入点突变，所以它对从单一序列指导进化蛋白质也是有效的。这种方法产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白多种特性的共进化。正是由于该技术包括了DNA重新组装的过程，使它与以往的诱变技术有了很大不同。此法的一般过程为：将单基因或一组不同来源的基因DNA或一组来自同一基因的具有不同突变部位的突变体DNA，用DNA酶I进行随机切割，获得较小的DNA片段混合体。以此混合体在不加引物的情况下直接进行PCR，DNA酶I切割的DNA片段通过相互间的同源性进行随机互补并以此为引物，经PCR扩增，获得DNA分子的复制，由此获得大量DNA不同区域间的随机重新组合的新DNA突变体；完成这一PCR随机扩增后，再加入特定引物进行最后的PCR扩增，便可获得全长基因的PCR产物。将PCR产物在一定寄主细胞中表达并筛选出希望获得的突变体，如此进行多次循环，直到筛选出理想突变体。

本发明人一直致力于有机磷降解酶方面的研究工作，从农药污染的土壤中分离得到一些高效降解有机磷农药的细菌，并且分离得到两个编码甲基对硫磷水解酶的基因：来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的OPHC2(GenBank登录号：Accession No.CAE53631)和来源于苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)的MPH-Och(GenBank登录号：Accession No.ACC63894)。其中MPH-Och与已报道的来源于Pseudomonas sp.WBC-3的MPH相似性很高，达到98.2％，酶学性质也基本相同。比较MPH-Och与OPHC2发现，这两个酶蛋白氨基酸序列相似性为58.1％。

本发明人应用毕赤酵母表达系统实现了OPHC2的高效表达，3L发酵罐可OPHC2的分泌表达量达到5.5g/L。MPH-Och在常温下对甲基对硫磷的催化效率明显优于OPHC2，它的比活性是4.3U/mg，约是OPHC2的3倍。但是，该基因在毕赤酵母系统中只表达在细胞内，不能有效地分泌，对后续的蛋白质分离纯化造成了极大的困难以及成本提升。

技术实现要素：

本发明的第一个技术问题是提供一种提供编码甲基对硫磷降解酶突变体的基因，该突变体基因能够在毕赤酵母系统中有效地分泌；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述突变体基因所编码的甲基对硫磷降解酶；

本发明的第三个技术问题是提供所述的甲基对硫磷降解酶突变体在降解有机磷中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

本发明公开了编码甲基对硫磷降解酶突变体编码基因；优选的，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。甲基对硫磷降解酶突变体基因的5’端含ophc2基因5’端的207个核苷酸，此后为mph的核酸序列，即突变酶的N端含OPHC2 N端的69个氨基酸。

本发明进一步公开了一种甲基对硫磷降解酶突变体；优选的，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还进一步公开了甲基对硫磷降解酶突变体编码基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。

本发明所述甲基对硫磷降解酶突变体的制备方法包括：

1、DNA Shuffling获得突变基因；

2、构建大肠杆菌突变体库；

3、酵母突变体库的建立；

4、甲基对硫磷降解酶活性测定筛选有益突变酶；

5、突变酶的序列测定及分析。

本发明所述的甲基对硫磷降解酶突变体及其编码基因、重组表达载体和宿主细胞在降解有机磷中具有广泛的应用前景。

本发明技术方案具有以下有益效果：

本发明甲基对硫磷降解酶突变体的在酵母中表达时其分泌到上清液中的酶活性与在细胞内酶活性比值与MPH相比显著提高，并且随着诱导时间的增加逐渐增加，当发酵到96h的时候，胞外活性与胞内活性的比值可以到达2.89。对培养上清样品进行SDS-PAGE电泳分析。发现突变体菌株有明显的目的条带，说明突变酶与野生型MPH相比在酵母上清液中分泌能力显著增加。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1为毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养胞外与胞内酶活比值图；

图2为毕赤酵母重组菌株摇瓶诱导培养上清SDS-PAGE电泳；其中1：野生型MPH培养上清，2：突变体7号培养上清。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1甲基对硫磷降解酶突变体的制备

1.实验材料

1.1菌株及质粒

质粒pET30a(+)-ophc2，pET30a(+)-mph、菌株E.coli BL21、E.coli Top10和菌株Pichia pastors GS115由实验室保存，质粒pPIC9购自Invitrogen公司，载体pGM-T购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2试剂

质粒提取、胶回收试剂盒购自Axygen公司，Taq polymeras购自天根生化科技(北京)有限公司，T₄-连接酶、限制性内切酶购自NEB公司，重组酶、Fast Pfu购自全式金生物技术有限公司，蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)购自英国Oxford公司，YNB购自北京经科宏达生物技术有限公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3试验仪器

恒温摇床(太仓市科技器材厂)、PCR仪(美国Bio-Rad公司)、恒温箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)、连接仪(卡尤迪生物科技有限公司)、恒温金属浴(金银杏生物技术有限公司)、漩涡振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、真空冷冻干燥器(德国Christ公司)、高压蒸汽灭菌锅(日本SANYO公司)、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、立式高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、电热恒温水浴锅(上海一恒仪器有限公司)、电击转化仪(美国Bio-Rad公司)、酶标仪(芬兰Thermo公司)、蛋白质电泳仪(北京六一仪器厂)、莱驰MM400研磨仪(德国Retsch公司)。

2、实验方法

2.1 DNA Shuffling获得突变基因

以实验室保存的质粒pET30a(+)-ophc2质粒为模板，以ophc2-up-BamHI(ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG)和ophc2-down-XhoI(ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)为引物扩增获得全长的ophc2基因；同时，以pET30a(+)-mph质粒为模板，mph-up-BamHI(ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC)和mph-down-XhoI(ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)为引物，扩增获得全长的mph基因。扩增产物经回收试剂盒回收，最终回收产物的浓度应达到30ng/μl。回收的产物用Dnase I进行酶切消化，50μl体系：2U/mL DNaseI；约800ng回收DNA(ophc2和mph各400ng)；25℃酶切30min，75℃处理10min灭活Dnase I。酶切后的50-100bp的小片段DNA以低熔点胶法进行回收，回收片段进行无引物PCR。

50μl PCR反应体系如下：

PCR程序为：94℃5min；94℃30sec；45℃30sec；72℃1.5min；45个循环72℃10min。

再以上述无引物PCR产物为模板，加入引物(ophc2-up-SnaBI GACC TACGTAGCCGCACCGGCACAACAGAAG和mph-down-NotI ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTTGGGTTAACGA CGG，)进行有引物PCR。PCR程序为：94℃5min，1个循环，94℃30SeC 50℃30sec 72℃1min，30个循环，72℃10min。将900bp左右的PCR产物以回收试剂盒回收。

2.2构建大肠杆菌突变体库

将回收的PCR产物和pPIC9载体分别进行SnaBI/NotI双酶切，回收酶切后的片段，加入T₄连接酶进行连接，连接体系如下：突变基因6μL，pPIC92μL，10×T₄DNA Ligase Buffer 1μL，T₄DNA Ligase 1μL，16℃连接过夜。连接产物热击转化入大肠杆菌克隆菌株Top10。转化后平板中长出的单克隆菌株经37℃、200rpm震荡培养10-12h，转化所得菌株经过质粒提取，酶切鉴定，确定菌株的阳性率为62.5％。

2.3酵母突变体库的建立

提取大肠突变体库的混合质粒，保证质粒的量达到5-10μg。利用Bgl II，37℃酶切5h后将质粒DNA线性化，取8μg线性化后的DNA与100μL酵母GS115感受态细胞混匀，转入预冷的0.2cm电击杯(BioRad)底部，电击仪设置：电压2.5kV，电容25μF，电阻400Ω，点击结束后，立即在电击杯中加入1mL 4℃预冷的1mol/L山梨醇，混合均匀后，取200μL涂布MD平板，吹干后，倒置在30℃恒温培养箱中，培养2-3天可得到约500个转化子。

2.4甲基对硫磷降解酶活性测定筛选有益突变酶

转化子初步筛选：

(1)挑取MD平板上长出的菌落，按编号依次挑到新的MD板上；

(2)按MD平板上对应的编号依次挑到48孔深孔培养板中(每孔中含500μL BMGY)，3层砂布(长超出5孔宽超出1孔)封口，盖上盖子，用皮筋捆紧，28℃，200rpm摇床震荡培养48h；

(3)取出纱布，盖上盖子，用封口膜封住。将深孔培养板4000rpm离心10min，弃上清，再加入400μL BMMY诱导培养基，更换新纱布，28℃，200rpm摇床震荡培养48h；

(4)4000rpm离心10min，将上清转移至96孔培养板中，进行有机磷农药降解酶活性分析，从中筛选出具有酶活性的阳性重组子。

甲基对硫磷水解酶酶活性测定方法：取100μL酶液加入含有5μL10mg/mL甲基对硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液的体系中，37℃保温10min，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na2CO3溶液显色，410nm测定光吸收值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。

一个酶活性单位(U)定义为：在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需的酶量。

2.5突变酶的序列测定及分析

采用热碱法破碎7号毕赤酵母重组菌株，即挑取毕赤酵母菌落于试管中，微波炉加热10min，加入NaOH溶液40uL，于热水中煮沸10min后，取12000rpm/min离心后的上清作为PCR模板，用通用引物5’AOX和3’AOX进行PCR。

PCR程序为：94℃5min；94℃40s；55℃40s；72℃30s；29个循环；72℃10min。

3、实验结果

3.1产生甲基对硫磷降解酶有益突变菌株筛选

通过筛选500个转化子，从中获得30个酶活性较好的阳性转化子进入复筛。

挑取初筛中30株酶活性较高的毕赤酵母菌株在摇瓶水平上进行跟踪诱导表达，同时接种野生型MPH酵母表达菌株为对照。

首先，在45mL BMGY中培养48h，然后，5000rpm离心5min，弃去上清，置换成15mL BMMY诱导培养基，从诱导后第24h开始取样，每隔24h取样一次，并补加甲醇至终浓度为0.5％。每次取出1mL的样品，1，2000rpm离心5min，上清吸出备用，菌体用0.9％(m/v)的生理盐水清洗两次，然后用与吸出时相同体积的Tris-HCl(50mmol/L，pH 8.0)缓冲液重悬。分别测定培养上清中的甲基对硫磷水解酶酶活性与菌体细胞中的甲基对硫磷水解酶酶活。

通过比较发现，7号突变酶在酵母中表达时其分泌到上清液中的酶活性与在细胞内酶活性比值与MPH相比显著提高(图1)，并且随着诱导时间的增加逐渐增加，当发酵到96h的时候，7号的胞外活性与胞内活性的比值可以到达2.89。同时，我们对培养上清样品进行SDS-PAGE电泳分析(图2)。发现7号菌株有明显的目的条带，这些结果均说明突变酶与野生型MPH相比在酵母上清液中分泌能力显著增加。

3.2突变酶基因碱基序列分析

PCR产物在作物遗传育种国家重点实验室进行测序，测序结果分析显示：7号突变体基因的5’端含ophc2基因5’端的207个核苷酸，此后为mph的核酸序列，即7号突变酶的N端含OPHC2 N端的69个氨基酸。7号突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的甲基对硫磷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京森根比亚生物工程技术有限公司

<120> 甲基对硫磷降解酶突变体及其编码基因和应用

<130> BJ-3010-150604A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

gccgcaccgg cacaacagaa gacccaggta ccgggctact accgtatggc actcggtgac 60

ttcgaagtca ccgctctgta tgacggctac gtcgacctgc ctgccagcct gctcaagggc 120

atcgatgaca aggacctgca atcgctgctg gctcgcatgt tcgtggcgtc ggagaaaggc 180

gtgcagactg cggtcaacgc ctacctggtc aacactggtt ccaagttggt tttggtcgac 240

actggtgctg ccggtttgtt cggaccaacc ttgggtagac ttgctgccaa cttgaaggcc 300

gctggttacc aaccagagca agttgacgag atttacatca ctcacatgca tcctgaccac 360

gttggaggtt tgatggttgg tgagcaattg gctttcccaa acgctgtcgt tagagctgac 420

caaaaggagg ccgatttctg gctttctcaa accaacttgg acaaggctcc tgacgattct 480

aaaggtttct tcaagggtgc catggcttcc cttaacccat acgttaaggc cggtaagttc 540

aagcctttct cgggtaacac tgacttggtt cctggtatta aagctttggc ctcccacgga 600

cacaccgctg gtcacactac ctacgttgtt gaatctcaag gtcaaaagct tgccttgttg 660

ggtgacttga tcttggtcgc tgctgttcaa ttcgacgatc catccgttac tagccaattg 720

gactctgact ccaagtctgc tgccgttgag agaaagaaag ctttcgctga tgccgctaag 780

ggaggttacc ttatcgctgc tgcccacttg tccttcccag gtattggtca catcagagct 840

gaaggtaagg gataccgttt cgttcctgtc aactactccg tcgttaaccc aaagtaa 897

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met

1 5 10 15

Ala Leu Gly Asp Phe Glu Val Thr Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Val Asp

20 25 30

Leu Pro Ala Ser Leu Leu Lys Gly Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Ala Arg Met Phe Val Ala Ser Glu Lys Gly Val Gln Thr Ala

50 55 60

Val Asn Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Ser Lys Leu Val Leu Val Asp

65 70 75 80

Thr Gly Ala Ala Gly Leu Phe Gly Pro Thr Leu Gly Arg Leu Ala Ala

85 90 95

Asn Leu Lys Ala Ala Gly Tyr Gln Pro Glu Gln Val Asp Glu Ile Tyr

100 105 110

Ile Thr His Met His Pro Asp His Val Gly Gly Leu Met Val Gly Glu

115 120 125

Gln Leu Ala Phe Pro Asn Ala Val Val Arg Ala Asp Gln Lys Glu Ala

130 135 140

Asp Phe Trp Leu Ser Gln Thr Asn Leu Asp Lys Ala Pro Asp Asp Ser

145 150 155 160

Lys Gly Phe Phe Lys Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Pro Tyr Val Lys

165 170 175

Ala Gly Lys Phe Lys Pro Phe Ser Gly Asn Thr Asp Leu Val Pro Gly

180 185 190

Ile Lys Ala Leu Ala Ser His Gly His Thr Ala Gly His Thr Thr Tyr

195 200 205

Val Val Glu Ser Gln Gly Gln Lys Leu Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ile

210 215 220

Leu Val Ala Ala Val Gln Phe Asp Asp Pro Ser Val Thr Ser Gln Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Ser Lys Ser Ala Ala Val Glu Arg Lys Lys Ala Phe Ala

245 250 255

Asp Ala Ala Lys Gly Gly Tyr Leu Ile Ala Ala Ala His Leu Ser Phe

260 265 270

Pro Gly Ile Gly His Ile Arg Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Phe Val

275 280 285

Pro Val Asn Tyr Ser Val Val Asn Pro Lys

290 295