黄瓜绿斑驳花叶病毒弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用的制作方法

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)弱毒株系的筛选及其在交叉保护中的应用。

背景技术：

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，主要侵染西瓜、黄瓜、甜瓜、葫芦等多种葫芦科作物，给这些作物上的安全生产造成巨大损失。由于生产上缺乏免疫或高抗CGMMV的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而CGMMV的防治非常困难。

交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。限制交叉保护广泛应用的关键因素是可用的弱毒株系太少。目前，关于CGMMV株系划分的研究较多，但是关于CGMMV弱毒株系中的研究很少。本发明通过定点突变技术，获得了两个新的致病力显著降低的CGMMV弱毒株系，攻毒实验证明，弱毒株系CP89A和Rd1069A可以有效控制CGMMV强毒株系的侵染。

技术实现要素：

本发明提供了一种CGMMV弱毒株系的筛选及应用，以CGMMV的侵染性克隆为基础，通过定点突变技术在CGMMV的基因中定点引入突变，明确了调控CGMMV致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的CGMMV弱毒突变体。通过测定弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果，获得了能有效保护植株免受CGMMV强毒株系侵染的弱毒株系。

本发明实施的具体技术方案是：

a.突变体的获得：以自主构建的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆为基础，针对其衣壳蛋白(CP)的第89位、114位氨基酸和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的第68位、869位和1069位氨基酸设计突变引物，利用QuickChange^TM定点突变试剂盒在这些位点引入突变。

b.弱毒株系的筛选：通过农杆菌浸润法将a中获得的突变体接种到寄主植物本氏烟，观察这些突变体所致症状的变化，筛选致病力明显降低的突变体。

c.交叉保护效果测定：在接种弱毒株系后10天接种CGMMV强毒株系，观察弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

1)获得了两个致病力明显降低的CGMMV弱毒株系。

2)弱毒株系CP89A和Rd1069A可有效保护植株免受CGMMV强毒株系的侵染。

附图说明

图1为CGMMV强毒株系和突变体接种后第10天的症状；

图2接种10天时CGMMV强毒株系和突变体RNA在烟草中的积累水平；

图3接种10天时CGMMV强毒株系和突变体衣壳蛋白(CP)在烟草中的积累水平；

图4间隔期为10天，弱毒株系在挑战接种后10天对烟草植株的保护效果；

图5为交叉保护实验中烟草植株内CGMMV基因组RNA的积累水平；

图6为交叉保护实验中烟草植株内CGMMV蛋白的积累水平。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分别CGMMV CP第89位的D和第114位的R突变为A；将RdRp第68位的E、第869位的K和第1069位的E突变为A，加粗的字母代表突变的核苷酸。CP与ef1α两对引物用于荧光定量PCR检测病毒基因积累水平，其中EF1α为植物内参基因。

实施例1：定点突变

以黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆pCaCGMMV为模板，利用PCR对五个位点分别进行突变，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。

PCR反应体系如下：

反应结束，在PCR产物中加入0.5μL Dpn I(20U/μL)，37℃处理2h，加入125μL无水乙醇和5μL 3mol/L的醋酸钠(pH＝5.2)混匀，-20℃沉淀过夜。13000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后置于室温自然干燥，加入10μL ddH₂O水回溶，转化大肠杆菌stbl3，突变质粒经测序验证。

实施例2：病毒接种

将pCaCGMMV或突变质粒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从本氏烟(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

实施例3：症状观察及病毒浓度检测

观察接种植物的症状，用荧光定量PCR及ELISA检测病毒基因及蛋白积累水平。在接种后第10天，野生型病毒及突变体CP114A、Rd68A、Rd869A在本氏烟(Nicotiana benthamiana)系统叶上引起明显的花叶和斑驳等症状，而衣壳蛋白第89位与复制酶RdRp第1069位突变体在本氏烟上几乎不表现症状(图1)。发明人将这些弱毒突变体分别命名为CP89A和Rd1069A(其中，CP89A的CP基因核苷酸序列见Seq ID No.15，其CP氨基酸序列见Seq ID No.17；Rd1069A的RdRp基因核苷酸序列见Seq ID No.16，其RdRp氨基酸序列见Seq ID No.18)。荧光定量PCR检测结果表明，以上两个突变体(株系)在烟草叶片中的RNA表达水平明显低于野生型病毒与其他突变体,病毒积累水平约为野生型病毒的10％(图2)。ELISA检测结果表明，以上两个株系在烟草叶片中的病毒积累量明显低于野生型病毒与其他突变体(图3)。

实施例4：交叉保护效果测定

选取5周左右的本氏烟，接种弱毒株系CP89A和Rd1069A(保护接种)。保护接种后10天接种强毒株系。每个处理接种3棵本氏烟，重复3次。

在接种强毒株系后的第10天调查发病情况，发现只接种强毒株系的本氏烟植株表现严重的花叶症状，发病率为100％；而预先接种CP89A和Rd1069A植株发病率为8.3％和0(图4)，说明在间隔期为10天时，两个弱毒突变体的保护效果分别为91.7％和100％。

荧光定量PCR检测结果表明，间隔期为10天的处理中，弱毒突变体保护的烟草中病毒RNA的积累水平明显低于未进行交叉保护的烟草(图5)。同时发现突变体保护的本氏烟攻毒后病毒粒子的浓度极低，以至于Western blot无法检测(图6)。

以上结果表明，弱毒株系CP89A和Rd1069A对强毒株系具有较好的交叉保护效果，可有效保护植物免受CGMMV强毒株系的侵染。

<110>山东农业大学

<120>黄瓜绿斑驳花叶弱毒株系的筛选及在交叉保护中的应用

<160>24

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

acggctacgc gtaatagggt cattgaggtt gtaga 35

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

attacgcgta gccgtggagc tgagaagcga aa 32

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctgtgaaggc tactgatgac gcgtctacag cc 32

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcagtagcct tcacagcgtt aagcgactca gcag 34

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tccggcgttt tcgattagct ttaccgccac c 31

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgaaaacgcc ggatacgcat cagttacaag cct 33

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggagcgaccg ccgagattat agcgagggtc aat 33

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ggcggtcgct ccacaacccg gcactcc 27

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gtgcatgcaa ttcaaggaga aacctttgag gagacg 36

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cttgaattgc atgcacagta ttcacatcat tgtacccac 39

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cagactcaag cgggaaga 18

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aagccctatc gtaaacatca 20

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tggtgtcctc aagcctggta t 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

acgcttgaga tccttaaccg c 21

<210>15

<211>486

<212>DNA

<213>黄瓜绿斑驳病毒衣壳蛋白（Coat Ptotein）基因

<400>15

1 atggcttaca atccgatcac acctagcaaa cttattgcgt ttagtgcttc ttatgttccc

61 gtcaggactt tacttaattt tctagttgct tcacaaggta ccgctttcca gactcaagcg

121 ggaagagatt ctttccgcga gtccctgtct gcgttaccct cgtctgtcgt agatattaat

181 tctagattcc cagatgcggg tttttacgct ttcctcaacg gtcctgtgtt gaggcctatc

241 ttcgtttcgc ttctcagctc cacggatacg cgtaataggg tcattgaggt tgtagatcct

301 agcaatccta cgactgctga gtcgcttaac gctgtaaagc gtactgatga cgcgtctacg

361 gccgctaggg ctgagataga taatttaata gagtctattt ctaagggttt tgatgtttac

421 aatagggctt catttgaagc cgcgttttcg gtagtctggt cagaggctac cacctcgaaa

481 gcttag

<210>16

<211>4947

<212>DNA

<213>黄瓜绿斑驳病毒聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）基因

<400>16

1 atggcaaaca ttaatgaaca aatcaacaac caacgtgacg ccgcggctag cgggagaaac

61 aatctcgtta gccaattggc gtcaaaaagg gtgtatgacg aggctgttcg ctcgttggat

121 catcaagaca gacgcccgaa aatgaacttt tctcgtgtgg tcagcacaga gcacaccagg

181 cttgtaactg atgcgtatcc ggagttttcg attagcttta ccgccaccaa gaactctgta

241 cactcccttg cgggtggtct gaggcttctt gaattggaat atatgatgat gcaagtgccc

301 tacggctcac cttgttatga catcggcggt aactatacgc agcacttgtt caaaggtaga

361 tcatatgtgc attgctgcaa tccgtgccta gatcttaaag atgttgcgag gaatgtgatg

421 tacaacgata tgatcacgca acatgtacag aggcacaagg gatctggcgg gtgcagacct

481 cttccaactt tccagataga tgcattcagg aggtacgata gttctccctg tgcggtcacc

541 tgttcagacg ttttccaaga gtgttcctat gattttggga gtggtaggga taatcatgcg

601 gtctcgttgc attcaatcta cgatatccct tattcttcga tcggacctgc tcttcatagg

661 aaaaatgtgc gagtttgtta tgcagccttt catttctcgg aggcactgct tttaggttcg

721 cctgtaggta atttaaatag tattggggct cagtttaggg tcgatggtga tgatgtgcat

781 tttcttttta gtgaagagtc tactttgcat tatactcata gtttagaaaa tatcaagtta

841 atcgtgatgc gtacttattt tcctgctgat gataggtttg tatatattaa ggagttcatg

901 gttaagcgtg tggatacttt tttctttagg ttggttaggg cagacacaca catgcttcat

961 aaatctgtgg ggcactattc gaaatcgaag tctgagtact tcgcgctgaa tacccctccg

1021 atcttccaag ataaagccac gttttctgtg tggtttcctg aagcgaagcg caaggtgttg

1081 atacccaagt ttgaactttc gagattcctt tctgggaatg tgaaaatctc taggatgctt

1141 gtcgatgctg atttcgtcca taccattatt aatcacatta gcacgtatga taacaaggcc

1201 ttagtgtgga aaaatgttca gtcctttgtg gaatccatac gttcaagagt aattgtaaac

1261 ggagtttccg tgaaatctga gtggaatgta ccggttgatc agctcactga tatctcgttc

1321 tcgatattcc ttctcgtgaa ggttaggaag gtacagatcg agttaatgtc tgataaagtt

1381 gtaatcgagg cgaggggttt gcttcggagg ttcgcagaca gtcttaaatc tgccgtagaa

1441 ggactaggtg attgcgtcta tgatgctcta gttcaaaccg gctggtttga cacctctagc

1501 gacgaactga aagtattgct acctgaaccg tttatgacct tttcggatta tcttgaaggg

1561 atgtacgagg cagatgcaaa gatcgagaga gagagtgtct ctgagttgct cgcttccggt

1621 gatgatttgt tcaagaaaat cgatgagata agaaacaatt acagtggagt cgaatttgat

1681 gtagagaaat tccaagaatt ttgcaaggaa ctgaatgtta atcctatgct aattggccac

1741 gttatcgaag ctattttttc gcagaaggct ggggtaacag taacaggttt gggcacgctc

1801 tctcctgaga tgggcgcttc tgttgcgtta tccagtacct ctgtagatac atgtgaagat

1861 atggatgtaa ctgaagatat ggaggatata gtgttgatgg cggacaaggg tcattcttac

1921 atgtcccctg aaatggcgag atgggctgat gttaaatatg gcaacaacaa aggagctcta

1981 gtcgagtaca aagtcggaac ctcgatgact ttacctgcca cctgggcaga gaaaggtaag

2041 gctgttttac cgttgtcggg gatctgtgtg aggaaacccc aattttcgaa gccgattgat

2101 gaggaagatg acttgaggtt atcaaacatg aatttcttta aggtgagcga tctaaagttg

2161 aagaagacta tcactccagt cgtttacact gggaccattc gagagaggca aatgaagaat

2221 tatattgatt acttatcggc ctctcttggt tccacgctgg gtaatctgga gaggatcgtg

2281 cggagtgatt ggaatggtac tgaggagagt atgcaaacgt tcgggttgta tgactgcgaa

2341 aagtgcaagt ggttattgtt gccagccgag aagaagcacg catgggccgt ggttctggca

2401 agtgatgata ccactcgcat aatcttcctt tcatatgacg aatctggttc tcctataatt

2461 gataagaaaa attggaagcg atttgctgtc tgttccgaga ccaaagtcta tagtgtaatt

2521 cgtagtttag aggttctaaa taaggaagca atagtcgacc ccggggttca cataacatta

2581 gttgacggag tgccgggttg tggaaagacc gccgagatta tagcgagggt caattggaaa

2641 actgatctag tattgactcc cgggagggag gcggctgcta tgattaggcg gagagcctgc

2701 gccctgcaca agtcacctgt ggcaaccagt gacaacgtca gaactttcga ctcttttgtg

2761 atgaataaga aaatcttcaa gtttgacgct gtctatgttg acgagggtct gatggtccat

2821 acgggattac ttaattttgc gttaaagatc tcaggttgta aaaaggcctt cgtctttggt

2881 gatgctaagc aaatcccgtt tataaacaga gtcatgaatt ttgattatcc taaagagtta

2941 agaactttaa tagtcgataa tgtagagcgt aggtatgtca cccataggtg tcctagagat

3001 gtcactagtt ttcttagtac tatctataaa gccgctgtcg ctactactag tccggttgta

3061 cattctgtga gggcaattaa agtgtcaggg gccggtattc tgaggcctga gttgacaaag

3121 atcagaggaa agataataac gtttactcaa tctgataagc agtctttgat caagagtggg

3181 cacaatgatg tgaatactgt gcatgaaatt cagggagaaa cctttgagga gacggcagtt

3241 gtgcgtgcca ccccgactcc aataggtttg attgcccgtg attcaccaca cgtactagtg

3301 gccttaacta ggcacactaa ggcaatggtg tattatactg ttgtattcga tgcagttaca

3361 agtataatag cggatgtgga aaaggtcgat cagtcgatct tgaccatgtt tgctaccact

3421 gtgcctacca aatagcaatt aatgcagaac tcgctgtatg tccatcgtaa tattttcctc

3481 cctgtaagta aaacggggtt ttatacagac atgcaggagt tctacgatag atgccttcct

3541 gggaattcct tcgtactgaa tgatttcgat gccgtaacca tgcggttgag ggacaacgaa

3601 tttaacttac aaccttgtag gctaaccttg agtaatttag atccggtacc cgctttaatt

3661 aagaatgaag cgcagaattt tctgatcccc gttttgcgta cggcctgtga aaagccgcgc

3721 attccgggtc ttcttgagaa tcttgtagct atgataaaga ggaatatgaa tactcctgat

3781 ttagctggga ccgtagatat aactaacatg tcgatttcta tagtagataa cttcttttct

3841 tcttttgtta gggacgaggt tttacttgat cacttagatt gtgttagggc tagttccatt

3901 caaagttttt ctgattggtt ttcgtgtcag ccaacctcag cggttggcca gttagctaat

3961 ttcaatttca tagatttgcc tgcctttgat acttatatgc atatgattaa gaggcaaccc

4021 aagagtcggt tagatacttc gattcagtct gaatatccgg ccttgcaaac tattgtttat

4081 caccctaaag tggtaaatgc ggtttttggt ccggttttca agtatttgac caccaagttt

4141 cttagtatgg tagatagttc taagtttttc ttttacacta ggaaaaaacc agaagatctg

4201 caggaatttt tctcagatct ctcttcccat tctgattatg agattcttga gcttgatgtt

4261 tctaaatatg acaagtcgca atccgatttc catttctctg ttgagatggc aatttgggaa

4321 aaattggggc tggacgatat tttggcttgg atgtggtcta tgggtcacaa aagaactata

4381 ctgcaagatt tccaagccgg gataaagacg ctcatttact atcaacggaa gtctggtgat

4441 gtaactactt ttataggtaa tacctttatt atcgcagcgt gtgtagctag tatgttgccg

4501 ttagataagt gttttaaagc tagtttttgt ggtgatgatt cgctgatcta ccttcctaag

4561 ggcttagagt atcctgatat acaggctact gccaaccttg tttggaattt tgaggcgaaa

4621 cttttccgaa agaagtatgg ttacttctgc gggaagtata taattcatca tgccaatggc

4681 tgtattgttt accctgaccc tttaaagtta attagtaaat taggtaataa gagtcttgta

4741 gggtatgagc atgttgagga gtttcgtata tctctcctcg acgttgctca tagtttgttt

4801 aatggtgctt atttccattt actcgacgat gcaatccacg aattatttcc taatgctggg

4861 ggttgcagtt ttgtaattaa ttgtttgtgt aagtatttga gtgataagcg ccttttccgt

4921 agtctttaca tagatgtctc taagtaa

<210>17

<211>161

<212>PRT

<213>黄瓜绿斑驳病毒衣壳蛋白（Coat Ptotein）

<400>17

1 METAlaTyrAsnProIleThrProSerLysLeuIleAlaPheSerAlaSerTyrValPro

21 ValArgThrLeuLeuAsnPheLeuValAlaSerGlnGlyThrAlaPheGlnThrGlnAla

41 GlyArgAspSerPheArgGluSerLeuSerAlaLeuProSerSerValValAspIleAsn

61 SerArgPheProAspAlaGlyPheTyrAlaPheLeuAsnGlyProValLeuArgProIle

81 PheValSerLeuLeuSerSerThrAspThrArgAsnArgValIleGluValValAspPro

101 SerAsnProThrThrAlaGluSerLeuAsnAlaValLysArgThrAspAspAlaSerThr

121 AlaAlaArgAlaGluIleAspAsnLeuIleGluSerIleSerLysGlyPheAspValTyr

141 AsnArgAlaSerPheGluAlaAlaPheSerValValTrpSerGluAlaThrThrSerLys

161 Ala

<210>18

<211>1647

<212>PRT

<213>黄瓜绿斑驳病毒聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）

<400>18

1 METAlaAsnIleAsnGluGlnIleAsnAsnGlnArgAspAlaAlaAlaSerGlyArgAsn

21 AsnLeuValSerGlnLeuAlaSerLysArgValTyrAspGluAlaValArgSerLeuAsp

41 HisGlnAspArgArgProLysMETAsnPheSerArgValValSerThrGluHisThrArg

61 LeuValThrAspAlaTyrProGluPheSerIleSerPheThrAlaThrLysAsnSerVal

81 HisSerLeuAlaGlyGlyLeuArgLeuLeuGluLeuGluTyrMETMETMETGlnValPro

101 TyrGlySerProCysTyrAspIleGlyGlyAsnTyrThrGlnHisLeuPheLysGlyArg

121 SerTyrValHisCysCysAsnProCysLeuAspLeuLysAspValAlaArgAsnValMET

141 TyrAsnAspMETIleThrGlnHisValGlnArgHisLysGlySerGlyGlyCysArgPro

161 LeuProThrPheGlnIleAspAlaPheArgArgTyrAspSerSerProCysAlaValThr

181 CysSerAspValPheGlnGluCysSerTyrAspPheGlySerGlyArgAspAsnHisAla

201 ValSerLeuHisSerIleTyrAspIleProTyrSerSerIleGlyProAlaLeuHisArg

221 LysAsnValArgValCysTyrAlaAlaPheHisPheSerGluAlaLeuLeuLeuGlySer

241 ProValGlyAsnLeuAsnSerIleGlyAlaGlnPheArgValAspGlyAspAspValHis

261 PheLeuPheSerGluGluSerThrLeuHisTyrThrHisSerLeuGluAsnIleLysLeu

281 IleValMETArgThrTyrPheProAlaAspAspArgPheValTyrIleLysGluPheMET

301 ValLysArgValAspThrPhePhePheArgLeuValArgAlaAspThrHisMETLeuHis

321 LysSerValGlyHisTyrSerLysSerLysSerGluTyrPheAlaLeuAsnThrProPro

341 IlePheGlnAspLysAlaThrPheSerValTrpPheProGluAlaLysArgLysValLeu

361 IleProLysPheGluLeuSerArgPheLeuSerGlyAsnValLysIleSerArgMETLeu

381 ValAspAlaAspPheValHisThrIleIleAsnHisIleSerThrTyrAspAsnLysAla

401 LeuValTrpLysAsnValGlnSerPheValGluSerIleArgSerArgValIleValAsn

421 GlyValSerValLysSerGluTrpAsnValProValAspGlnLeuThrAspIleSerPhe

441 SerIlePheLeuLeuValLysValArgLysValGlnIleGluLeuMETSerAspLysVal

461 ValIleGluAlaArgGlyLeuLeuArgArgPheAlaAspSerLeuLysSerAlaValGlu

481 GlyLeuGlyAspCysValTyrAspAlaLeuValGlnThrGlyTrpPheAspThrSerSer

501 AspGluLeuLysValLeuLeuProGluProPheMETThrPheSerAspTyrLeuGluGly

521 METTyrGluAlaAspAlaLysIleGluArgGluSerValSerGluLeuLeuAlaSerGly

541 AspAspLeuPheLysLysIleAspGluIleArgAsnAsnTyrSerGlyValGluPheAsp

561 ValGluLysPheGlnGluPheCysLysGluLeuAsnValAsnProMETLeuIleGlyHis

581 ValIleGluAlaIlePheSerGlnLysAlaGlyValThrValThrGlyLeuGlyThrLeu

601 SerProGluMETGlyAlaSerValAlaLeuSerSerThrSerValAspThrCysGluAsp

621 METAspValThrGluAspMETGluAspIleValLeuMETAlaAspLysGlyHisSerTyr

641 METSerProGluMETAlaArgTrpAlaAspValLysTyrGlyAsnAsnLysGlyAlaLeu

661 ValGluTyrLysValGlyThrSerMETThrLeuProAlaThrTrpAlaGluLysGlyLys

681 AlaValLeuProLeuSerGlyIleCysValArgLysProGlnPheSerLysProIleAsp

701 GluGluAspAspLeuArgLeuSerAsnMETAsnPhePheLysValSerAspLeuLysLeu

721 LysLysThrIleThrProValValTyrThrGlyThrIleArgGluArgGlnMETLysAsn

741 TyrIleAspTyrLeuSerAlaSerLeuGlySerThrLeuGlyAsnLeuGluArgIleVal

761 ArgSerAspTrpAsnGlyThrGluGluSerMETGlnThrPheGlyLeuTyrAspCysGlu

781 LysCysLysTrpLeuLeuLeuProAlaGluLysLysHisAlaTrpAlaValValLeuAla

801 SerAspAspThrThrArgIleIlePheLeuSerTyrAspGluSerGlySerProIleIle

821 AspLysLysAsnTrpLysArgPheAlaValCysSerGluThrLysValTyrSerValIle

841 ArgSerLeuGluValLeuAsnLysGluAlaIleValAspProGlyValHisIleThrLeu

861 ValAspGlyValProGlyCysGlyLysThrAlaGluIleIleAlaArgValAsnTrpLys

881 ThrAspLeuValLeuThrProGlyArgGluAlaAlaAlaMETIleArgArgArgAlaCys

901 AlaLeuHisLysSerProValAlaThrSerAspAsnValArgThrPheAspSerPheVal

921 METAsnLysLysIlePheLysPheAspAlaValTyrValAspGluGlyLeuMETValHis

941 ThrGlyLeuLeuAsnPheAlaLeuLysIleSerGlyCysLysLysAlaPheValPheGly

961 AspAlaLysGlnIleProPheIleAsnArgValMETAsnPheAspTyrProLysGluLeu

981 ArgThrLeuIleValAspAsnValGluArgArgTyrValThrHisArgCysProArgAsp

1001 ValThrSerPheLeuSerThrIleTyrLysAlaAlaValAlaThrThrSerProValVal

1021 HisSerValArgAlaIleLysValSerGlyAlaGlyIleLeuArgProGluLeuThrLys

1041 IleArgGlyLysIleIleThrPheThrGlnSerAspLysGlnSerLeuIleLysSerGly

1061 HisAsnAspValAsnThrValHisGluIleGlnGlyGluThrPheGluGluThrAlaVal

1081 ValArgAlaThrProThrProIleGlyLeuIleAlaArgAspSerProHisValLeuVal

1101 AlaLeuThrArgHisThrLysAlaMETValTyrTyrThrValValPheAspAlaValThr

1121 SerIleIleAlaAspValGluLysValAspGlnSerIleLeuThrMETPheAlaThrThr

1141 ValProThrLys***GlnLeuMETGlnAsnSerLeuTyrValHisArgAsnIlePheLeu

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