一种检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，cmv)是雀麦花叶病毒科(bromoviridae)、黄瓜花叶病毒属(cucumovirus)的典型成员，在世界范围内均有分布。其寄主范围广泛，可侵染52科174属的775种植物。自然侵染寄主有黄瓜、烟草、心叶烟、菜豆、苋色藜、昆诺藜和豇豆等，可通过种子、鳞茎、块茎及苗木等无性繁殖材料实现远距离传播。但是，从百合植株上获得的cmv株系均不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色藜、普通烟、心叶烟等6科10种指示植物。

目前cmv传统的诊断方法主要有：病毒分离及用免疫学方法诊断抗原。包括常规的rt-pcr、elisa技术和基因芯片技术。

但是，在pcr检测中有一些关键性限制因素，易导致假阳性或假阴性结果出现；elisa检测是由于抗原抗体反应的专一性使其具有有限性；目前普遍看好的基因芯片技术因其需要昂贵的芯片制作系统，操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高而难以推广应用。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种核酸扩增技术，由notomi在2000年提出。它是由于4种引物与靶基因上的6个不同部位完全匹配，才能进行扩增因此能获得比pcr更高的特异性；lamp一般能检测到比pcr至少低10倍的拷贝数，尤其是对于低浓度的病毒数量或无症状的病毒携带者的检测比pcr的效果更好；lamp是恒温扩增反应比pcr反应速度更快，而且成本低，易推广。它只需一个简单的恒温器，不需要昂贵的pcr仪，对操作人员的分子生物学技能要求不高。产物检测便捷：lamp反应可合成10⁹数量级的dna，同时产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白色沉淀来可视化定性判断lamp反应结果。此外，还可进行凝胶电泳，浊度仪根据产物浑浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析，还可以直接肉眼检测或者在反应体系中加入荧光染料，观察变色情况。

该方法成本低廉，操作简单，只需台水浴锅、pcr仪就可在基层推广，lamp技术因其快速、高效、特异性好、灵敏度高和经济等优点，已广泛应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测领域，具有广阔的发展应用空间。

然而，黄瓜花叶病毒是rna单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用lamp技术检测浸染百合的黄瓜花叶病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

目前，lamp技术还未被应用于侵染百合的黄瓜花叶病毒的检测。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物、试剂盒及检测方法，该引物特异性强，与常见侵染百合的其它7种病毒无交叉，灵敏度高，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，建立的黄瓜花叶病毒的lamp诊断方法，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

一种用于检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组，其包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，从5’端到3’端，具体序列如下：

f3:5'-ccacccaacctttgtagg-3'；

b3:5'-cggcaaaggattaactcga-3'；

fip:5'-gtctatttttggtggctttagggtttttgagtgaacgctgtaaacct-3'；

bip:5'-cgtgggtcttattatggtaaaaggtttttatttgaatgcgcgaaaca-3'。

本发明提供一种包含所述lamp引物组的黄瓜花叶病毒的lamp检测试剂盒。

进一步，所述lamp检测试剂盒包含lamp反应体系，该lamp反应体系包括：内引物fip、内引物bip、外引物f3、外引物b3、10×buffer、mg²⁺、dntps、甜菜碱和bstdna聚合酶，其中，内引物与外引物的浓度之比的范围为8-16：1。

进一步，所述的lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip0.8-1.6μm，内引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.2μm，外引物b30.1-0.2μm，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜碱0.6-1m，bstdna聚合酶0.26-0.38u/μl，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1。

优选地，所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip1.2-1.6μm，内引物bip1.2-1.6μm，外引物f30.12-0.2μm，外引物b30.12-0.2μm，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.25-0.3mm，甜菜碱0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1。

更优选地，所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：fip1.6μm，bip1.6μm，f30.2μm，b30.2μm，10×buffer2.5μl，mg²⁺1.5mm，dntps0.3mm，甜菜碱0.6m，bst酶0.38u/μl。

一种黄瓜花叶病毒的lamp快速检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品rna，将总rna的50ng-5μg用全式基因逆转录试剂盒进行逆转录，获得cdna；

2)配制lamp反应体系；

以ddh2o为阴性对照，以包含黄瓜花叶病毒目的序列的质粒为阳性对照，配制lamp反应体系；

所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip0.8-1.6μm，内引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.2μm，外引物b30.1-0.2μm，10×buffer，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜碱0.6-1m，bstdna聚合酶0.26-0.38u/μl，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1；

3)进行lamp扩增反应

lamp扩增反应的程序为：55-63℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)lamp扩增反应结束后，向扩增产物中加入sybrgreeni染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有黄瓜花叶病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含黄瓜花叶病毒。

进一步，在所述的lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip1.2-1.6μm，内引物bip1.2-1.6μm，外引物f30.12-0.2μm，外引物b30.12-0.2μm，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.25-0.3mm，甜菜碱0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1。

将本发明所述的lamp引物用于黄瓜花叶病毒的rt-lamp检测中。

进一步，所述rt-lamp检测的反应体系中，以黄瓜花叶病毒rna为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物fip1.3-1.7μm，内引物bip1.3-1.7μm，外引物f30.1-0.3μm，外引物b30.1-0.3μm，10×buffer，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.2-0.3mm，甜菜碱0.4-0.6m，bst酶0.6-0.8u/μl，dtt0.15-0.2mm，逆转录酶3-4u/μl，待测样品rna20ng-5μg，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。

本发明的lamp或rt-lamp反应体系中，10×buffer的添加遵循本领域中的常规添加原则，通常为反应总体积的十分之一。

本发明根据黄瓜花叶病毒(cmv)cp基因序列(genbank登录号为aj006988.1)，在选择保守区域时避开所有的突变位点，使引物具有高特异性，设计筛选出2对引物，其为内引物fip、bip和外引物f3、b3。

利用本发明的fip、bip、f3和b3引物，在恒温条件下，经过高活性链置换酶bst酶的作用，dna不断循环扩增，主要可分2个阶段，启动阶段和循环扩增阶段，lamp扩增原理参见图1和图2。

在启动阶段，引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，释放单链。如图1所示，双链dna模板在等温(60-65℃)的条件下，内部引物fip退火，fip中的f2序列跟模板链上flc位点结合，在具有链置换活性的dna聚合酶作用下启动核酸的合成。外部引物f3与模板f3c区域结合并延伸，置换出完整的fip连接的互补单链，并置换释放一条单链dna；单链dna一端自动形成环的结构，可作为bip引物的模板，bip启动链的合成，随后b3引物退火，同模板链杂交，引导链置换反应产生一条双链dna和一条两端成环的单链dna，形成一个哑铃环的结构；此后，3’端自动引导dna的合成，快速形成一种茎环的结构，该结构作为lamp反应中循环反应的起始结构，进入lamp反应的循环扩增阶段。

第2阶段是扩增循环阶段，主要由内部引物fip和bip作用，如图2所示：以茎环状结构为模板，引物fip退火，与茎环的f2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3’末端的b1区段为起点，以自身为模板，进行dna合成延伸以及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的dna，bip引物上的b2区域与其杂交，启动新一轮扩增，且产物dna长度增加一倍。扩增的最后产物是具有不同个数的茎环结构、不同茎长度的茎结构dna和带有许多环的类似花椰菜结构dna的混合物，且产物dna为扩增靶序列的交替反向重复序列，因此lamp电泳条带为一系列不同大小的梯状条带。

本发明对lamp反应温度和体系进行了详尽、可靠的研究。由于反应中bstdna聚合酶的最佳反应温度为60℃左右，温度过高或过低都会对酶的活性产生较大影响，本发明对黄瓜花叶病毒的lamp反应温度在55℃-65℃之间进行了筛选，确定合适的退火温度范围为：55-63℃，在该温度范围内，lamp反应效率和产物产量较高。

本发明对lamp反应体系中的引物和dntps，甜菜碱(betaine)，bst酶，模板的量分别进行了优化筛选，不同的引物比例的扩增效率不同，本发明最终确定的内引物与外引物比例范围为8-16：1，在该引物比例范围内，可以使用凝胶电泳法检测出明显的阳性梯状条带。根据四因素三水平优化方案对dntps、betaine、bst酶，模板四个因素的添加量进行优化，最终确定各物质的终浓度范围为：dntps0.25-0.3mm，甜菜碱0.6-0.8m，bstdna聚合酶0.32-0.38u/μl，在该浓度范围内，能获得良好的反应效率和产物产量。

利用本发明的lamp引物组，可以直接采用样品中提取的总rna进行环介导逆转录等温实验rt-lamp，利用逆转录酶revertraace(toyobo)和bst酶，将lamp和逆转录实验相结合，极大地缩短了反应时间，以rna作为模板，减少了将rna逆转录成cdna的步骤，既减少了逆转录的中间过程和人为操作带来的误差，又克服了以往lamp易出现的假阳性结果。

与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：

本发明的黄瓜花叶病毒lamp引物特异性强，与常见侵染百合的7种病毒，具体包括百合无症病毒样品、蚕豆萎蔫病毒样品、百合x病毒样品、百合斑驳病毒样品、南芥菜花叶病毒样品、苹果茎沟病毒样品、水仙花叶病毒样品，经过测试，不会产生交叉感染。

本发明的lamp检测方法特异性好，灵敏度高，在黄瓜花叶病毒的诊断中，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

将本发明的lamp引物组和反应体系制成lamp试剂盒，在试剂盒中设置阴性对照以证明反应体系未被黄瓜花叶病毒目的序列污染，设置阳性对照以对比测定结果的正确性，进行cmv的lamp可视化快速检测，操作简捷，向产物中加入荧光染料，依据颜色变化进行结果判定，实现反应结果的可视化、易判定、易于推广应用。

本发明可用于环介导逆转录等温扩增(rt-lamp)，直接检验百合样品总rna，减少实验假阴性或假阳性实验结果发生，在保证实验结果准确性的同时，更加经济节约，高效，非常易于临床推广。

附图说明

图1为本发明中lamp扩增中第1扩增阶段示意图。

图2为本发明中lamp扩增中第2扩增阶段示意图。

图3为本发明实施例2中lamp扩增结果可视化结果示意图。

图4为本发明实施例2中lamp扩增结果电泳检测示意图。

图5为对比例的lamp扩增示意图。

图6为本发明实施例4中lamp灵敏度电泳结果示意图。

图7为本发明实施例4中pcr灵敏度电泳结果示意图。

图8为本发明实施例4中lamp灵敏度可视化结果示意图。

图9为本发明实施例5中lamp特异性电泳示意图。

图10为本发明实施例5中lamp特异性可视化结果示意图。

图11为本发明实施例6中rt-lamp电泳结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1一种用于检测百合中黄瓜花叶病毒的lamp引物组的获得

根据genbank中查找到cmv的coatproteingene(cp)序列(genbank登录号为aj006988.1)进行引物设计，设计原理如下：

由于lamp主要依靠链置换而成，所以靶序列长度应小于300bp，若大于500bp将很难扩增，本发明根据靶基因的6个区域3’端的f3c、f2c、f1c以及5’端的b1、b2、b3，设计了4条特异性引物fip、bip、f3和b3。

fip引物为上游内部引物(forwardinnerprimer)，由tttt序列链接f2区和f1c区域组成，f2区与靶基因3’端的f2c区域互补，f1c区与靶基因5’端的flc区域序列相同。bip引物为下游内部引物(backwardinnerprimer)，由tttt序列连接b1c和b2区域组成，b2区与靶基因3’端的b2c区域互补，blc域与靶基因5’端的blc区域序列相同f3引物为上游外部引物(forwardouterprimer)，由f3区组成，并与靶基因的f3c区域互补。b3引物为下游外部引物(backwardouterprimer)，由b3区域组成，和靶基因的b3c区域互补。

具体序列如下：

f3:5'-ccacccaacctttgtagg-3'；

b3:5'-cggcaaaggattaactcga-3'；

fip:5'-gtctatttttggtggctttagggtttttgagtgaacgctgtaaacct-3'；

bip:5'-cgtgggtcttattatggtaaaaggtttttatttgaatgcgcgaaaca-3'。

实施例2黄瓜花叶病毒的lamp检测方法

1)使用总rna提取试剂盒(上海博满生物科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取感染黄瓜花叶病毒的百合植株样品总rna。

2)将提取的50ng-5μg的总rna使用全式基因逆转录试剂盒，进行

逆转录，获得cdna；

3)配制lamp反应体系

设置阴性对照(ddh2o)体系和阳性对照(包含黄瓜花叶病毒目的序列的质粒)体系，设置阴性对照以证明反应体系未被黄瓜花叶病毒目的序列污染，设置阳性对照以对比测定结果的正确性。

为防止实验出现假阳性结果，配制lamp反应体系和两个对照体系时，进行分区操作。

配制反应体系时，不添加模板，先将ddh2o、dntps、10×buffer、fip、bip、f3、b3和甜菜碱配制好，分成三组，分别加入阴性对照(ddh2o)、待测样品cdna模板和阳性对照(包含黄瓜花叶病毒目的序列的质粒)，加入阴性对照的成为阴性对照体系，加入待测样品的成为反应体系，加入阳性对照的成为阳性对照体系，将各体系的混合物涡旋混匀、瞬离，在95℃水浴锅中加热5min，再冰浴5min后，再加入bst酶，其中，bst酶需与dna模板和阳性对照质粒隔离放置。

25μl的lamp反应体系中包括：ddh2o5.1μl，浓度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的fip3.5μl，浓度10μm的引物bip3.5μl，浓度10μm的引物f30.3μl，浓度10μm的引物b30.3μl，浓度5m的甜菜碱5μl，逆转录所得cdna1μl，8u/μl的bst酶0.8μl。

4)进行lamp扩增反应

配制好反应体系后进行lamp扩增反应，反应程序为：60℃59min，80℃3min；

5)鉴定扩增结果

步骤3)lamp扩增反应结束后，向扩增产物中加入2μlsybrgreeni染料，观察颜色变化：显色绿色的样品为阳性，含有黄瓜花叶病毒；显色橘色的样品为阴性，不含黄瓜花叶病毒，结果参见图3。

或者取lamp扩增产物5μl在goldview染色的2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察，出现特征性梯状条带的样品为阳性，含有黄瓜花叶病毒；无条带出现的样品为阴性，不含黄瓜花叶病毒，结果参见图4。

由图3-4可以看出，电泳结果和显色结果表明黄瓜花叶病毒(cmv)和阳性对照质粒(p)均显示为阳性结果，阴性对照(n)均表现为阴性结果。而且黄瓜花叶病毒的lamp可视化快速检测与电泳结果一致。

对比例

除lamp反应体系与本实施例不同外，其余操作及反应条件与实施例2相同。

其中，所用的lamp反应体系为：ddh2o1.3μl，浓度2.5mm的1×dntps4.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的fip1.0μl，浓度10μm的引物bip1.0μl，浓度10μm的引物f34μl，浓度10μm的引物b34μl，浓度5m的甜菜碱5μl，逆转录所得cdna模板1μl，8u/μl的bst酶1.2μl。

所扩增的产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果参见图5，其中，泳道cmv为使用本对比例反应体系来检测黄瓜花叶病毒。

结果表明，利用对比例的反应体系，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，梯状条带在紫外光下几乎不能识别，反应效率很低。

实施例3黄瓜花叶病毒的lamp检测试剂盒组装

1、包装规格：200次

2、试剂盒成分如表1：

表1

*：内含buffer、dntpsmix和甜菜碱。

3、运输及保存方法：

低温运输，避光保存。短期使用放至4℃避光保存，长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

4、使用注意事项：

1)全部的物品，凡是接触过病毒材料的，为不将实验室污染和对检测人员造成影响都需要被合理处理。

2)把整个实验分区进行操作，严禁器材和试剂倒流，以免污染。

3)显色剂低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。

4)注意不要让试剂盒中的各个成分受到污染，可进行分装使用。

5)操作过程中，移液、取样，定时等全部过程必须精确。严格遵守操作说明可以获得最好的结果。

实施例4灵敏度验证

本实施例将经测序验证过cmv的质粒，按照拷贝数进行稀释实验，按照cmv质粒10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10¹拷贝分别进行lamp和pcr检测。

lamp反应体系：ddh2o5.3μl，浓度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的fip4.0μl，浓度10μm的引物bip4.0μl，浓度10μm的引物f30.5μl，浓度10μm的引物b30.5μl，浓度5m的甜菜碱3μl，8u/μl的bst酶1.2μl，逆转录所得cdna模板1μl。

pcr反应体系：ddh2o17μl，浓度2.5mm的1×dntps2.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的引物f31.0μl，浓度10μm的引物b31.0μl，浓度逆转录所得cdna1μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.5μl。

pcr反应程序为：95℃预变性10min，进入pcr反应循环：95℃变性60s，51℃退火40s，72℃延伸35s，共进行35个循环，72℃总延伸7min。

lamp反应程序和结果显示方法参见实施例2，pcr结果采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测，目的片段长为183bp，检测结果如图6-8所示，其中，1为cmv质粒10⁷拷贝，2为cmv质粒10⁶拷贝，3为cmv质粒10⁵拷贝，4为cmv质粒10⁴拷贝，5为cmv质粒10³拷贝，6为cmv质粒10²拷贝，7为cmv质粒10¹拷贝，n为阴性对照。

图6-7结果表明，本发明的lamp可以检验出10¹而pcr只能检验出10³拷贝，说明本发明lamp检测法能够检测出的最低浓度比pcr检测低2个数量级，这证明本发明中lamp方法具有极高的灵敏度。

由于使用lamp技术检测黄瓜花叶病毒的灵敏度较高，采用良好的防污染措施可避免假阳性结果。

同时，由图8可以看出，黄瓜花叶病毒的lamp可视化快速检测与电泳结果一致，且呈一定的梯度变化。

实施例5特异性验证

百合在田间栽培过程中，常因病毒侵染，导致百合叶片过早脱落花芽和花早衰，寿命缩短等现象，严重影响其产量和品质的主要因素。在侵染百合的病毒中，除黄瓜花叶病毒外，还有百合斑驳病毒(lilymottlevirus，lmov)、百合无症病毒(lilysymptomlessvirus，lsv)等。据沈淑琳统计，侵染百合的病毒种类有14种，王继华统计有16种。本次为验证该试剂盒的特异性，专门选取常见侵染百合的病毒除黄瓜花叶病毒质粒和黄瓜花叶病毒cdna外，共7种病毒进行测试，具体包括百合无症病毒样品、蚕豆萎蔫病毒样品、百合x病毒样品、百合斑驳病毒样品、南芥菜花叶病毒样品、苹果茎沟病毒样品和水仙花叶病毒样品。

本实施例采用含lamp引物的试剂盒进行，反应体系为：ddh2o7μl，浓度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的fip3.0μl，浓度10μm的引物bip3.0μl，浓度10μm的引物f30.25μl，浓度10μm的引物b30.25μl，浓度5m的甜菜碱4μl，8u/μl的bst酶1μl，逆转录所得cdna模板1μl。

结果判定方法参见实施例2，电泳结果图9，显色结果图10，其中，c为cmvcdna，p为cmv质粒，n为阴性对照，1为百合无症病毒样品、2为蚕豆萎蔫病毒样品、3为百合x病毒样品、4为百合斑驳病毒样品、5为南芥菜花叶病毒样品、6为苹果茎沟病毒样品、7为水仙花叶病毒样品。

电泳结果图9和显色结果图10表明，黄瓜花叶病毒(cmv)和阳性对照质粒(p)均显示为阳性结果，阴性对照(n)和其他感染百合的病毒样品均表现为阴性结果。而且黄瓜花叶病毒的lamp可视化快速检测与电泳结果一致。因此本发明黄瓜花叶病毒的lamp可视化快速检测试剂盒的特异性好，不会与其他病毒产生交叉感染。同时说明加入荧光染料后，可视化结果与电泳结果一致。

实施例6利用cmv的lamp检测试剂盒进行rt-lamp检测

黄瓜花叶病毒cmv为rna病毒，在现有技术中进行常规pcr检测时，需要先提取总rna，再进行逆转录成cdna进行实验。

本发明直接采用样品中提取的总rna，进行环介导逆转录等温实验rt-lamp，将lamp和逆转录实验相结合，具体步骤如下：

全部反应体系共26.9μl包括：ddh2o0μl，浓度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，浓度10μm的fip4.0μl，浓度10μm的引物bip4.0μl，浓度10μm的引物f30.5μl，浓度10μm的引物b30.5μl，浓度5m的甜菜碱3μl，8u/μl的bst酶2.4μl，5mm的dtt1μl，待测样品rna50ng，浓度为100u/μl的revertraace(toyobo)1μl。

将所有反应体系于冰上加入pcr管后，涡旋，混匀，然后立即放入pcr仪。

rt-lamp反应程序：65℃59min，80℃3min。

产物用2％的琼脂糖凝胶进行检测，观察是否出现梯状条带，若是出现梯状条带则证明rt-lamp实验成功，结果参见图11，其中，rna表示黄瓜花叶病毒cmvrna经过rt-lamp所得产物，n为阴性对照。

由图11可见，黄瓜花叶病毒cmv的rna经过rt-lamp反应后显示为阳性。由此说明本发明中rt-lamp方法检测黄瓜花叶病毒特异性良好。

由于黄瓜花叶病毒本身属于易降解的rna病毒，易受到空气或者是实验器具上rna酶的作用，所以在提取和逆转录过程中要时时刻刻小心rna酶的污染，给实验增加了很多繁琐的步骤，如使用的移液器等器具需用depc-h2o处理，枪头要多次灭菌等等，即使再小心，也易出现假阴性结果。

而本发明则可极大的减轻这些繁琐的步骤，直接采用样品中提取的总rna进行环介导逆转录等温实验rt-lamp，将lamp和逆转录实验相结合，利用逆转录酶revertraace(toyobo)和bst酶，极大地缩短了反应时间，以rna作为模板，既减少了逆转录的中间过程和人为操作带来的误差，又克服了以往lamp易出现的假阳性结果。