一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒和检测方法与流程

本发明具体涉及一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：

博卡病毒（Bocavirus）是细小病毒科细小病毒亚科的一个属，为单股线状无囊膜的DNA病毒，基因组大小在5.4kb左右。20世纪60年代初首次在牛群发现。近年来，随着病毒宏基因组及高通量测序技术的快速发展，人博卡病毒、猪博卡病毒、犬博卡病毒、黑猩猩博卡病毒、海狮博卡病毒等被前后被发现。然而，在遗传学上，它们之间的遗传进化关系较远，基因组同源性低于60%。此外，也未发现博卡病毒存在跨种传播的事实。

目前的研究表明，犬博卡病毒（Canine Bocavirus，CBoV）与犬的腹泻和呼吸道疾病发生有一定的相关性。在北美、欧洲、南韩等地区报道的病例较多，在我国，除了香港外，大陆地区很少有犬博卡病毒的病例报道。现有文献表明，犬博卡病毒体外分离培养难度较大，而且，犬博卡病毒基因型多，有犬博卡病毒1型（CBoV1）、犬博卡病毒2型（CBoV2）和犬博卡病毒3型（CBoV3），基因型间同源性较低。所以研发犬博卡病毒PCR通用检测试剂盒对该病的快速确诊有着重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，组建犬博卡病毒通用性检测试剂盒以及检测方法。该试剂盒为犬博卡病毒诊断提供了一种快速检测方法，填补了国内犬博卡病毒诊断方法的空白，为犬博卡病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

本发明所采取的技术方案是：

一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：

CBoV-F: AARAGRAARCTYTATTTTGC（SEQ ID NO:1）；

CBoV-R: TGCCAGTCTTGWGGHGARAA（SEQ ID NO:2）。

一种犬博卡病毒的通用型PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。

一种犬博卡病毒的通用型PCR检测方法，包括下列步骤：

1)从样品中提取病毒核酸；

2)以核酸为模板，用上述引物对CBoV-F和CBoV-R进行PCR扩增反应获得扩增产物；

3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

优选的，步骤2）中PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μl，DNA模板 3μL，引物CBoV-F 0.5μL，引物CBoV-R 0.5μL，总体积为25µL。

优选的，步骤2）中PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃终延伸10min。

本发明的有益效果是：

本发明的犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒以及检测方法，不仅仅用于宠物犬的疾病诊断和检测，还可以应用于野生犬、肉用犬、实验犬等的检测。

本发明所制备的犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。

本发明PCR检测方法为犬博卡病毒的诊断提供一种快速检测方法，填补国内犬博卡病毒诊断方法的空白，为犬博卡病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

附图说明

图1是犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒特异性试验结果；泳道M：DNA Marker 2000；泳道1：犬瘟热病毒；泳道2：犬细小病毒；泳道3：犬传染性肝炎病毒；泳道4：犬副流感病毒；泳道5：猫瘟热病毒；泳道6：犬博卡病毒。

图2是犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒敏感性试验结果；其中泳道M：DNA Marker 2000；泳道1-11分别为阳性质粒的10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍倍比稀释结果。

具体实施方式

材料和方法：

犬博卡病毒阳性重组质粒，犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV），猫瘟热病毒（FDV）细胞分离上清液等由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，犬博卡病毒阳性毒株由香港大学刘嘉佩教授馈赠。

主要试剂：

DNA提取试剂盒、PCR试剂购自北京天根公司，DNA Marker 2000购自Takara公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 PCR引物设计

根据犬博卡病毒1型、2型和3型基因序列设计出扩增犬博卡病毒保守基因序列的引物对CBoV-F和CBoV-R，其碱基序列如下所示。

CBoV-F: AARAGRAARCTYTATTTTGC（SEQ ID NO:1）；

CBoV-R: TGCCAGTCTTGWGGHGARAA（SEQ ID NO:2）。

实施例2 病毒DNA提取及PCR分析

1）DNA 的提取

按照DNA提取试剂盒说明书进行病毒DNA提取。

2）犬博卡病毒PCR检测试剂盒

以犬博卡病毒（犬博卡病毒2型）DNA为PCR的模板，建立犬博卡病毒PCR检测试剂盒。PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μl，DNA模板 3μL，引物CBoV-F 0.5μL，引物CBoV-R 0.5μL，总体积为25µL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃终延伸10min。

结果观察：取10μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。如果出现长度为400bp左右的目标条带，则判定为犬博卡病毒。

实施例3 特异性试验

以实施例2中优化好的通用型PCR试剂盒涉及的反应体系及条件，对犬博卡病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒，猫瘟热病毒等进行PCR扩增，来检测该试剂盒的特异性。结果见图1。

图1凝胶电泳结果显示，只有犬博卡病毒阳性重组质粒出现预期大小（400bp左右）的扩增目的条带，而犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒，猫瘟热病毒等未呈现条带，表明该试剂盒具有较好的特异性。

实施例4 敏感性试验

选取犬博卡病毒阳性重组质粒为模板（浓度为480.62ng/μL)，进行倍比稀释（分别为10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍稀释），来测定该方法的敏感性。结果见图2。

图2结果显示：泳道6的结果为最高的稀释倍数10⁵，即优化后的试剂盒敏感性为4.8062pg/μL。

实施例5 临床样品检测

从广州周边地区采集临床犬粪便样本425份，进行PCR检测。

经检测，425份临床样本中有1份犬博卡病毒阳性样本，进一步经核酸测序，确定该样本感染犬博卡病毒2型（CBoV2）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒和检测方法

<130> CBoV2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

aaragraarc tytattttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

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