一种抗猪博卡病的混合冻干粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗猪博卡病的混合冻干粉及其制备方法，该混合冻干粉包括以下重量份数的组分：抗猪博卡病卵黄抗体94?97份、抗猪博卡病转移因子1?2份、防腐剂0.01?0.02份、灭活剂0.2?0.3份、砸0.05?0.1份、维生素⑶.5?1份、聚乙烯吡咯烷酮1?2份、甘氨酸0.5?1份。本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉，将抗猪博卡病卵黄抗体与抗猪博卡病转移因子进行复配，并辅以多种辅料，各组分相互配合，协调作用，可以显著提高其防治猪博卡病的效果，具有针对性强、常温下保存时间长、抗体效价高、生物活性良好的优点，是一种具有广泛应用前景的强效生物制剂。
【专利说明】一种抗猪博卡病的混合冻干粉及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药【技术领域】，具体涉及一种抗猪博卡病的混合冻干粉，同时还涉及 一种抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法。
【背景技术】
[0002] 生猪养殖在我国养殖业中占有较重的份额，仅河南省2009年产出的猪肉就达 410. 32万吨，由此可知，我国每年对于猪肉的需求量非常大。但是，随着猪肉需求的逐年递 增及养殖规模的扩大，生猪养殖过程中也出现越来越多的问题，其中猪博卡病是一种急性 传染性疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] 猪博卡病毒（Bocavirus)隶属于细小病毒科细小病毒亚科的博卡病毒属，这种 DNA病毒是我国最近两年发现的，具有局部高发性、高死率、高传染性等临床流行特征，主要 是针对于仔猪，在仔猪断奶后易引发多系统衰竭综合征、传染性胃肠炎、流行性腹泻等病混 合感染，造成高死亡率。
[0004] 目前防治猪博卡病的方法较多，主要是使用西药、接种免疫、中草药等进行防治。 其中，西药使用的泛滥给猪肉类食品带来了极大的安全隐患，药物残留已经成为影响猪肉 产品安全的主要因素之一。接种免疫早期效果较好，但是需要多次接种，操作麻烦，成本较 高，容易造成应激反应；而且疫苗对于保藏条件要求较高，需要在2-8°C条件下冷藏，室温 条件下一段时间则失去效果。中草药饲料添加剂也是目前的研究方向之一，但是由于中草 药的种类较多，相同的中药材对不同的禽畜疾病的作用差异很大，且中草药对疾病的免疫 效果极其有限，因此应用也具有一定的局限性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种抗猪博卡病的混合冻干粉，解决现有技术防治猪博卡病 存在的操作不便、药剂不易保存、效果较差的问题。
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法。
[0007] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗猪博卡病的混合冻干粉， 包括以下重量份数的组分：抗猪博卡病卵黄抗体94?97份、抗猪博卡病转移因子1?2份、 防腐剂0. 01?0. 02份、灭活剂0. 2?0. 3份、硒0. 05?0. 1份、维生素 C0. 5?1份、聚乙 烯吡咯烷酮1?2份、甘氨酸0. 5?1份。
[0008] 所述灭活剂为甲醛。
[0009] 所述防腐剂为硫柳汞。
[0010] 一种上述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：
[0011] a.采用猪博卡病毒标准株制备疫苗，免疫健康鸡群获得高免蛋，将高免蛋经过消 毒、酸化处理、离心处理得到含有抗猪博卡病卵黄抗体的上清液；
[0012] b.将含有抗猪博卡病卵黄抗体的上清液与抗猪博卡病转移因子、防腐剂、灭活剂、 硒、维生素 C、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸混合，再冻干即得。
[0013] 优选的，抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：
[0014] 1)取猪博卡病毒标准株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋 鸡群进行免疫，一共免疫三次，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1 :256 时，收集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；
[0015] 2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得 到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入酸化水溶液，混匀、静置沉淀，取上清液备用；
[0016] 3)在步骤2)所得上清液中加入钠盐使钠盐体积占总体积的0. 8%，离心分离，得含 有抗猪博卡病卵黄抗体的上清液；
[0017] 4)取步骤3)所得的含有94?97重量份的抗猪博卡病卵黄抗体的上清液，加入 1?2重量份抗猪博卡病转移因子，过滤，留滤液备用；
[0018] 5)将步骤4)所得滤液浓缩至2. 5ml/500羽份，加入防腐剂0. 01?0. 02重量份、 灭活剂〇. 2?0. 3重量份、硒0. 05?0. 1重量份、维生素 C0. 5?1重量份、聚乙烯批咯烧 酮1?2重量份、甘氨酸0. 5?1重量份进行混合，先-20°C预冷，再在-80°C条件下冻干， 即得。
[0019] 步骤2)中所述酸化水溶液的pH为4. 9?5. 2 ;酸化水溶液的加入量为卵黄抗体 溶液体积的8倍。所述酸化水溶液可为盐酸化水溶液。
[0020] 步骤3)中所述钠盐为NaCl与NaS04的质量比为4:1的混合物。
[0021] 步骤3)中所述离心分离的转速为15000rpm，时间为20min。
[0022] 步骤4)中所述过滤是先用0. 45 μ m的滤膜进行过滤，截留分子量大于200KD的大 分子，再将滤液用〇. 22 μ m的滤膜过滤。
[0023] 所述抗猪博卡病转移因子，是由以下方法制备的：
[0024] 1)用猪博卡病病毒抗原对猪脾脏进行免疫后，去其表面筋、脂肪，再用灭菌后的生 理盐水冲洗；
[0025] 2)将冲洗后的猪脾脏破碎后，加入2倍体积的预冷后的PBS缓冲液，用组织匀浆仪 将其匀质，得匀浆液；
[0026] 3)将匀浆液用超声破碎仪处理5?lOmin后，调节pH为5. 5,在5000?6000rpm 转速下离心30min，收集上清液；
[0027] 4)将步骤3)所得上清液用微滤膜过滤，截留分子量为7000道尔顿以上的物质，将 所得滤液用除菌滤膜过滤，即得抗猪博卡病转移因子原液，在4°C条件下保存备用。
[0028] 卵黄抗体是一种免疫球蛋白，由于机体受到外界抗原的刺激而产生的一种应激产 物，可以和相应抗原结合，消除病因。本发明将猪博卡病的疫苗免疫接种健康的鸡群，可以 使获得的鸡蛋蛋黄中产生有效的抗猪博卡病卵黄抗体，同时减少了毒株返祖的可能性。
[0029] 转移因子携带有致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，能够将特异性免疫信息呈递给 受体淋巴细胞，使受体无活性的淋巴细胞转变为特异性致敏淋巴细胞，从而激发受体细胞 介导的免疫反应。
[0030] 本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉中，抗猪博卡病卵黄抗体是一种免疫球蛋白， 对猪博卡病有很好的防治效果；抗猪博卡病转移因子本身是一种特异抗病毒因子，将两者 结合使用，可极大地提高预防和治疗猪博卡病的效果。
[0031] 本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉，将抗猪博卡病卵黄抗体与抗猪博卡病转移因 子进行复配，并辅以防腐剂、灭活剂、硒、维生素 C、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酸制备混合冻干 粉，各组分相互配合，协调作用，可以显著提高其防治猪博卡病的效果，具有针对性强、常温 下保存时间长、抗体效价高、生物活性良好的优点，是一种具有广泛应用前景的强效生物制 齐IJ ;经动物试验证明，本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉，对猪博卡病的防治效果要明显优 于抗猪博卡病卵黄抗体、抗猪博卡病转移因子中任意一种单独使用的情况。
[0032] 本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉，使用时，可作为饲料添加剂按质量分数2%? 3%混入饲料中；发病时采用肌注方式给药，每100ml注射液中含有混合冻干粉2g，注射液的 使用量为每次〇. 1?〇. 2ml/kg体重；首次用药加倍，治疗效果更好。
[0033] 本发明的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，将抗猪博卡病卵黄抗体、抗猪博 卡病转移因子和多种辅料进行复配，并通过调整辅料的成分、控制其用量，进一步延长了卵 黄抗体的保存时间，保证了卵黄抗体在常温下较长时间内的活性，降低了冻干粉制剂的保 存和运输成本，使用方便，具有广泛的应用前景；制备方法工艺简单，操作方便，极大的降低 了生产成本，适合大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0035] 本发明的【具体实施方式】中，所用猪博卡病毒为国家标准毒株。
[0036] 本发明的【具体实施方式】中，所用抗猪博卡病转移因子，是由以下方法制备的： [0037] 1)用猪博卡病病毒标准抗原(市售）对猪脾脏进行免疫后，去其表面筋、脂肪，再用 灭菌后的生理盐水冲洗；
[0038] 2)将冲洗后的猪脾脏破碎后，加入2倍体积的预冷后的PBS缓冲液，用组织匀浆仪 将其匀质，得匀浆液；
[0039] 3)将匀浆液用超声破碎仪处理5?lOmin后，调节pH为5. 5,在5000?6000rpm 转速下离心30min，收集上清液；
[0040] 4)将步骤3)所得上清液用微滤膜过滤，截留分子量为7000道尔顿以上的物质，将 所得滤液用除菌滤膜过滤，即得抗猪博卡病转移因子原液，在4°C条件下保存备用。
[0041] 实施例1
[0042] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪博卡病卵 黄抗体94份、抗猪博卡病转移因子2份、硫柳汞0. 02份、甲醛0. 2份、硒0. 05份、维生素 C1 份、聚乙烯吡咯烷酮2份、甘氨酸0. 5份。
[0043] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：
[0044] 1)取猪博卡病毒标准毒株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产 蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1. 5ml，第二次、第三次 免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1 :256时，收集高免 蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；
[0045] 2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得 到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5. 0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵 黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；
[0046] 3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与NaS04按质量比为4:1的比例混合形成 的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0. 8%，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪 博卡病卵黄抗体的上清液；
[0047] 4)取步骤3)所得的含有94重量份的抗猪博卡病卵黄抗体的上清液，加入2重量 份抗猪博卡病转移因子，用〇. 45 μ m的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物 质，再将滤液经〇. 22 μ m滤膜过滤，留滤液备用；
[0048] 5)将步骤4)所得滤液浓缩至2. 5ml/500羽份，加入硫柳汞0. 02重量份、甲醛0. 2 重量份、硒〇. 05重量份、维生素 C1重量份、聚乙烯吡咯烷酮2重量份、甘氨酸0. 5重量份进 行混合，先-20°C预冷，再在-80°C条件下冻干，即得。
[0049] 实施例2
[0050] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪博卡病卵 黄抗体95份、抗猪博卡病转移因子1. 5份、硫柳汞0. 01份、甲醛0. 3份、硒0. 1份、维生素 C0. 5份、聚乙烯吡咯烷酮1. 5份、甘氨酸1份。
[0051] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：
[0052] 1)取猪博卡病毒标准毒株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产 蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1. 5ml，第二次、第三次 免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1 :256时，收集高免 蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；
[0053] 2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得 到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5. 0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵 黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；
[0054] 3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与NaS04按质量比为4:1的比例混合形成 的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0. 8%，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪 博卡病卵黄抗体的上清液；
[0055] 4)取步骤3)所得的含有95重量份的抗猪博卡病卵黄抗体的上清液，加入1. 5重 量份抗猪博卡病转移因子，用〇. 45 μ m的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物 质，再将滤液经〇. 22 μ m滤膜过滤，留滤液备用；
[0056] 5)将步骤4)所得滤液浓缩至2. 5ml/500羽份，加入硫柳汞0. 01重量份、甲醛0. 3 重量份、硒〇. 1重量份、维生素 C0. 5重量份、聚乙烯吡咯烷酮1. 5重量份、甘氨酸1重量份 进行混合，先-20°C预冷，再在-80°C条件下冻干，即得。
[0057] 实施例3
[0058] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉，包括以下重量份数的组分：抗猪博卡病卵 黄抗体97份、抗猪博卡病转移因子1份、硫柳汞0. 01份、甲醛0. 25份、硒0. 08份、维生素 C1份、聚乙烯吡咯烷酮1份、甘氨酸0. 5份。
[0059] 本实施例的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，包括下列步骤：
[0060] 1)取猪博卡病毒标准毒株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产 蛋鸡群进行免疫，一共免疫三次，第一次免疫健康鸡群接种灭活疫苗1. 5ml，第二次、第三次 免疫接种加量1倍，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1 :256时，收集高免 蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；
[0061] 2)将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得 到卵黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入pH为5. 0的酸化水溶液，酸化水溶液加入量为卵 黄抗体溶液体积的8倍，混匀、静置沉淀，取上清液备用；
[0062] 3)在步骤2)所得上清液中加入由NaCl与NaS04按质量比为4:1的比例混合形成 的混合钠盐，使混合钠盐体积占总体积的0. 8%，以15000rpm的转速离心20min，得含有抗猪 博卡病卵黄抗体的上清液；
[0063] 4)取步骤3)所得的含有97重量份的抗猪博卡病卵黄抗体的上清液，加入1重量 份抗猪博卡病转移因子，用〇. 45 μ m的滤膜进行过滤，截流分子量大于200KD的大分子物 质，再将滤液经〇. 22 μ m滤膜过滤，留滤液备用；
[0064] 5)将步骤4)所得滤液浓缩至2. 5ml/500羽份，加入硫柳汞0. 01重量份、甲醛0. 25 重量份、硒〇. 08重量份、维生素 C1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1重量份、甘氨酸0. 5重量份进 行混合，先-20°C预冷，再在-80°C条件下冻干，即得。
[0065] 实验例1
[0066] 本实验例对实施例1?3所得混合冻干粉进行性能检测，结果如表1、2所示。
[0067] 常温效价检测实验方法：将实施例1?3所得混合冻干粉制剂保存在37°C培养箱 中，保存24个月，分别在1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂 扩散(AGP)法，测定每个时间点所取样品的卵黄抗体效价变化。
[0068] 表1实施例1?3所得混合冻干粉常温效价检测实验结果(项目：PRRS)
[0069]
【权利要求】
1. 一种抗猪博卡病的混合冻干粉，其特征在于：包括以下重量份数的组分：抗猪博卡 病卵黄抗体94?97份、抗猪博卡病转移因子1?2份、防腐剂0. 01?0. 02份、灭活剂 0. 2?0. 3份、硒0. 05?0. 1份、维生素 C0. 5?1份、聚乙烯吡咯烷酮1?2份、甘氨酸 0· 5?1份。
2. 根据权利要求1所述的抗猪博卡病的混合冻干粉，其特征在于：所述灭活剂为甲醛。
3. 根据权利要求1所述的抗猪博卡病的混合冻干粉，其特征在于：所述防腐剂为硫柳 汞。
4. 一种如权利要求1所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：包括 下列步骤： a. 采用猪博卡病毒标准株制备疫苗，免疫健康鸡群获得高免蛋，将高免蛋经过消毒、酸 化处理、离心处理得到含有抗猪博卡病卵黄抗体的上清液； b. 将含有抗猪博卡病卵黄抗体的上清液与抗猪博卡病转移因子、防腐剂、灭活剂、硒、 维生素 C、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸混合，再冻干即得。
5. 根据权利要求4所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：包括下 列步骤： 1) 取猪博卡病毒标准株进行增殖，将其灭活制备成疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群 进行免疫，一共免疫三次，第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1 :256时，收 集高免蛋，将收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用； 2) 将步骤1)所得高免蛋分离得到高免蛋卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌，得到卵 黄抗体溶液，在卵黄抗体溶液中加入酸化水溶液，混匀、静置沉淀，取上清液备用； 3) 在步骤2)所得上清液中加入钠盐使钠盐体积占总体积的0. 8%，离心分离，得含有抗 猪博卡病卵黄抗体的上清液； 4) 取步骤3)所得的含有94?97重量份的抗猪博卡病卵黄抗体的上清液，加入1?2 重量份抗猪博卡病转移因子，过滤，留滤液备用； 5) 将步骤4)所得滤液浓缩至2. 5ml/500羽份，加入防腐剂0. 01?0. 02重量份、灭活 剂0. 2?0. 3重量份、硒0. 05?0. 1重量份、维生素 C0. 5?1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1? 2重量份、甘氨酸0. 5?1重量份进行混合，先-20°C预冷，再在-80°C条件下冻干，即得。
6. 根据权利要求5所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤2) 中所述酸化水溶液的pH为4. 9?5. 2 ;酸化水溶液的加入量为卵黄抗体溶液体积的8倍。
7. 根据权利要求5所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤3) 中所述钠盐为NaCl与NaS04的质量比为4:1的混合物。
8. 根据权利要求5所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤3) 中所述离心分离的转速为15000rpm，时间为20min。
9. 根据权利要求5所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤4) 中所述过滤是先用〇. 45 μ m的滤膜进行过滤，截留分子量大于200KD的大分子，再将滤液用 0. 22 μ m的滤膜过滤。
10. 根据权利要求4或5所述的抗猪博卡病的混合冻干粉的制备方法，其特征在于：所 述抗猪博卡病转移因子，是由以下方法制备的： 1)用猪博卡病病毒抗原对猪脾脏进行免疫后，去其表面筋、脂肪，再用灭菌后的生理盐 水冲洗； 2) 将冲洗后的猪脾脏破碎后，加入2倍体积的预冷后的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其 匀质，得匀浆液； 3) 将匀浆液用超声破碎仪处理5?lOmin后，调节pH为5. 5,在5000?6000rpm转速 下离心30min,收集上清液； 4) 将步骤3)所得上清液用微滤膜过滤，截留分子量为7000道尔顿以上的物质，将所得 滤液用除菌滤膜过滤，即得抗猪博卡病转移因子原液，在4°C条件下保存备用。
【文档编号】A61K9/19GK104208680SQ201310463389
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】郭俊清, 徐进, 李建正 申请人:郑州后羿制药有限公司