一种t-发卡结构介导的测定dna侧翼未知序列的方法
【专利摘要】本发明是一种利用限制性内切酶、T-发卡结构(HSO-T)和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列扩增其5′或3′端侧翼未知序列的方法。该方法设计一条HSO-T的寡聚核苷酸序列；用单一限制性内切酶酶切基因组DNA并经rTaq或Ex?Taq修饰；HSO-T接头与修饰后基因组连接；根据HSO-T序列合成引物THSO-F，根据已知DNA序列合成2条下游引物或2条上游引物；以连接物为模板，引物THSO-F和2条下游引物进行巢式PCR扩增获得5′端未知序列；同理，引物HSO-F和2条上游引物进行巢式PCR获得3′端未知序列。该技术操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确等优点，具有广阔应的用前景。
【专利说明】一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，是一种涉及限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)酶切、T-发卡结构(T-Hairpin Structure)连接和巢式 PCR(NestPolymerase Chain Reaction)扩增等技术,基于已知DNA序列测定其侧翼未知DNA序列的方法。
【背景技术】 [0002]在当今的“基因大战”中，新基因的发现与克隆已成为研究的热点，侧翼未知序列的扩增在分子生物学研究中占有举足轻重的地位，是结构基因组研究以及功能基因组研究的基础，可应用于启动子克隆、获得基因的排布信息、确定T-DNA插入位点、染色体定位、图位克隆、基因表达调控研究、人工染色体PAC、YAC和BAC片段搭接等。目前已有的测定侧翼未知序列的方法如随机测序法、3'-和5' -RACE法以及基因组文库进行杂交筛选等，往往工程浩大，费时费力，应用局限或特异性不高。近几年，基于PCR技术克隆侧翼未知序列的方法格外引人注目，该方法包括一类是依赖连接介导的PCR法，如T-1nker PCR法等，操作过程相对复杂，且扩增长度较短，非特异扩增的风险较大；另一类是不需要酶切连接的PCR法，如Tail-PCR法等，也存在一定缺陷，比如新Alu-PCR扩增区域包含较短的Alu重复序列时，往往得不到目的产物。由本研究发明两种基于PCR的测定DNA侧翼未知序列技术，操作简便、高效准确等优点，但仍存在一些不足。一种T载体介导PCR测定侧翼未知序列方法，其连接不受限制性内切酶的限制，通用性强，但以PUCm-T为接头连接效率低，且购买PUCm-T价格较贵；另一种以发卡结构介导PCR测定侧翼未知序列，小分子核苷酸链构建的接头结构稳定，大幅度提高了 PCR扩增的特异性和效率，但该方法受限制性内切酶的限制，连接位点单一，限制其应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确的T-发卡结构介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5'或3'端侧翼未知DNA序列。
[0004]本发明的技术方案:合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THS0-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3,端均被添加上碱基“A” ;将HSO-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5'端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3'端侧翼未知序列:
[0005](I) T-发卡结构及PCR引物的合成:根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3'端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T (42bp);基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F (20bp)；[0006]HSO-T:5, -GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT~3/
[0007]THSO-F: 5' -ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3'
[0008](2)上下游引物的合成:基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5'端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pr1-Rl和Pr1-R2，Pr1-R2距离已知DNA序列5'端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3'端侧翼未知序列的上游引物，命名为Pr1-Fl和Pr1-F2, Pri_F2距离3'端30bp以上；
[0009](3)限制性内切酶的选择:分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5'端粘性末端的内切酶有 EcoR I, HindIII, Bgl I1、Sal 1、BamH 1、Nco 1、Xba 1、Xho 1、Cla 1、Msp I 和Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3'端粘性末端的酶有Aat
I1、Bmt 1、Pst 1、Sac I 和 Sph I 等;
[0010](4)基因组DNA的酶切:采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物；
[0011](5)酶切产物的修饰:基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5'端粘性末端、3'端粘性末端和平末端；针对5'端粘性末端，利用rTaq或Ex Taq DNA聚合酶具有不依赖于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3/端添加上碱基“A”;针对平末端，直接利用该两种酶在3'端添加上碱基“A”;针对3'端粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3' —5'核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，在3'端添加上碱基“A”；
[0012](6) HSO-T接头与酶切修饰产物的连接=HSO-T经变性、退火形成HSO-T接头，将其与经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板；
[0013](7)目的DNA片段的PCR扩增:以步骤(6)的连接物为模板，THSO-F和Pr1-Rl作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO-F和Pri_R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5'端侧翼未知序列；
[0014]同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pr1-Fl和THSO-F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pr1-F2和THSO-F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3'端侧翼未知序列。
[0015]THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列操作流程如图1所示(以Xba I酶切为例)。
[0016]本发明的有益效果:
[0017](I)操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。
[0018](2)引物特异性强。本发明通过利用寡聚核苷酸的T-发卡结构介导的PCR方法，把随机引物的扩增转变成特异性引物的扩增，大幅度提高了 PCR扩增的特异性和效率。HSO-T接头是一个反向重复序列，故只需一条引物THSO-F即可用于5'端或3'端侧翼未知DNA序列。
[0019](3)应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，T-发卡结构介导的PCR扩增可应用于各种不同基因的5'端或3'端侧翼未知DNA序列的测定。
[0020](4)操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，且在3'端碱基“T”的设计，基因组DNA酶切不受限制性内切酶的限制。
[0021](5)结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段，具有简捷、准确和实用性强等特点。
[0022](6)未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而受到影响，并可应用于染色体步移获得更长的DNA序列。
[0023](7)成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，HSO-T接头和THSO-F具有通用性，无需昂贵的仪器和试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1:THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列示意图
[0025]图2:宇佐美曲霉EOOl环氧化物水解酶基因(Auseh2)5'端侧翼的测序结果
[0026]图3:宇佐美曲霉EOOl环氧化物水解酶基因(Auseh2)3'端侧翼的测序结果
【具体实施方式】
[0027]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制 本发明的范围。
[0028]实施例1
[0029]宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的5'端侧翼未知DNA序列的测定:
[0030](I) HSO-T 接头的构建:HS0-T(100iimol / L) 2 y L，ddH208 y L，充分混匀；用卩0?基因扩增仪94°C变性3min，缓慢降温(1°C / s)至25°C后恒温退火30min。
[0031](2)基因组DNA酶切产物的制备:选用Xba I对宇佐美曲霉基因组DNA进行酶切。构建如下酶切体系:10XM Bufferl ii L，Xba 10.5u L,0.1M BSAl y L,基因组 DNA5 y L，ddH202.5 u L ;37°C 反应 4h。
[0032](3)酶切基因组修饰:酶切产物 20 U L, 10XPCR Buffer2.5 U L, dNTP0.5 U L, rTaq或Ex Taq0.25 u L, ddH201.75 u L ;使用PCR基因扩增仪在72°C反应10min ;修饰后酶切产物命名为Auseh2-DM。
[0033](4) Auseh2-DM 与 HSO-T 接头的连接=IOXT4DNA Ligase Bufferl U L,HS0-T3u L,Auseh2-DM5 u L, T4DNA Ligasel u L ;16°C反应4h或过夜，即可作为PCR扩增的模板。
[0034](5)已知序列下游引物的合成:基于已知的Auseh2基因序列，合成两条扩增已知DNA序列5丨端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为EH-Rl和EH-R2，其中EH-R2距离已知DNA序列5'端30bp以上:
[0035]EH-Rl:5' -TGAGGGAAGCTGTTGATG-3'
[0036]EH-R2:5' -CTCCTCGATTTGCTCGTCTGA-3'
[0037](6)Auseh2 的 5'端DNA序列扩增:10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L, THSO-PCR模板 2 ii L, THS0-F0.5u L, EH-R10.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min,30 个循环(94 °C, 30s ；51 °C,30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,经第一轮 PCR 扩增产物命名为 5 ' -Auseh2-0ut ； 10 X PCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5u L,5 ' -Auseh2_0ut2 u L,THSO-F0.5u L, EH-R20.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min, 30 个循环(94 °C, 30s ；51 °C, 30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,经第二轮 PCR 扩增产物命名为5' -Auseh2-1n。
[0038](7)5' -Auseh2_In的克隆和测序:将5' -Auseh2_In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤分别进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，Auseh2基因5'端DNA未知序列的测结果如图2所示。
[0039]实施例2
[0040]宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001Auseh2基因的3'端侧翼未知DNA序列的测定:
[0041](I)HSO-T接头与基因组DNA酶切产物的制备及连接方法同实施例1。
[0042](2)已知序列上游引物的合成:基于已知的Auseh2基因序列，合成两条扩增已知DNA序列3丨端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为EH-Fl和EH-F2，其中EH-F2距离已知DNA序列3'端30bp以上:
[0043]EH-Fl:5' -TCATGATGCTTGCAAAGCC-3'
[0044]EH-F2:5' -GGAGAGAAGTTCCTCGAT-3'
[0045](3)Auseh2 的 3'端DNA序列扩增:10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L, THSO-PCR模板 2 ii L, THSO-F0.5u L, EH-F10.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min,30 个循环(94 °C, 30s ；51 °C,30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,经第一轮 PCR 扩增产物命名为 3 ' -Auseh2-0ut ； 10 X PCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5u L,3 ' -Auseh2_0ut2 u L,THS0-F0.5u L, EH-F20.5u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L ；94 °C 5min, 30 个循环(94 °C, 30s ；51 °C, 30s ;72 °C，lmin20s)，72 °C IOmin,经第二轮 PCR 扩增产物命名为3' -Auseh2-1n。
[0046](4)3' -Auseh2_In的克隆和测序:将3' -Auseh2_In按照割胶回收试剂盒说明书上的操作步骤分别进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，Auseh2基因3'端DNA未知序列的测结果如图3所示。
【权利要求】
1.一种T-发卡结构介导的测定DNA侧翼未知序列的方法,其特征在于:合成一条极易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列(HSO-T)，经变性、退火可形成稳定的HSO-T接头；基于发卡结构序列，合成特异性引物THS0-F，再根据已知的DNA序列，合成两条特异性下游引物和两条上游引物；选择单一限制性内切酶酶切基因组DNA，根据酶切产物末端的类型，选择rTaq或Ex Taq进行修饰，修饰后其3'端均被添加上碱基“A”;将HS0-T接头与经Taq处理的酶切产物进行连接；以连接物为模板，采用THSO-F和两条下游引物进行巢式PCR扩增，获得已知DNA序列5，端侧翼未知序列；同理，采用THSO-F和两条上游引物进行巢式PCR扩增，获得3'端侧翼未知序列: (1)T-发卡结构及PCR引物的合成:根据原核生物回文结构的原理，合成一条极易形成发卡结构的、3'端含有“T”的寡聚核苷酸序列，命名为HSO-T (42bp);基于HSO-T序列，合成一条特异性PCR引物，命名为THSO-F (20bp)；
HSO-T: 5' -GACTACTGGCATGGGCGGATTACTCGCCCATGCCAGTAGTCT-3'
THSO-F: 5' -ACTCGCCCATGCCAGTAGTC-3' (2)上下游引物的合成:基于已知的DNA序列，合成两条扩增已知DNA序列5'端侧翼未知序列的特异性下游引物，命名为Pr1-Rl和Pr1-R2，Pri_R2距离已知DNA序列5'端30bp以上；同理，基于已知的DNA序列，合成两条扩增3'端侧翼未知序列的上游引物，命名为 Pr1-Fl 和 Pr1-F2, Pri_F2 距离 3'端 30bp 以上； (3)限制性内切酶的选择:分析已知DNA序列中限制性内切酶的酶切位点，选择在已知DNA序列中没有酶切位点的限制性内切酶；本发明可供选择的、产生5'粘性末端的内切酶有 EcoR I, HindIII, Bgl I1、Sal 1、BamH 1、Nco 1、Xba 1、Xho 1、Cla 1、Msp I 和 Nde I等，产生平末端的酶有EcoR V、Sna B和Sca I等，产生3'粘性末端的酶有Aat I1.Bmt 1、Pst 1、Sac I 和 Sph I 等； (4)基因组DNA的酶切:采用步骤(3)选择的单一限制性内切酶对基因组DNA进行完全酶切，纯化酶切产物； (5)酶切产物的修饰:基因组DNA经限制性内切酶酶切后，其酶切产物两端有3种形式，分别为5'粘性末端、3'粘性末端和平末端；针对5'粘性末端，利用rTaq或Ex TaqDNA聚合酶具有不依赖于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，将粘性末端补齐，并在3'端添加上碱基“A”;针对平末端，直接利用该两种酶在3'端添加上碱基“A”;针对3'粘性末端，利用Ex Taq DNA聚合酶具有3' —5'核苷酸外切活性，将粘性末端切齐，再利用该酶均具有不依赖于模板的5' —3'核苷酸聚合活性，在3'端添加上碱基“A”； (6)HSO-T接头与酶切修饰产物的连接=HSO-T经变性、退火形成HSO-T接头，将其与经Taq处理的基因组酶切片段进行连接，即可作为PCR扩增的模板； (7)目的DNA片段的PCR扩增:以步骤(6)的连接物为模板，THSO-F和Pr1-Rl作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，THSO-F和Pri_R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR (巢式PCR)产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；根据巢式PCR原理验证扩增产物是否为目的DNA片段，从而获得已知DNA序列5'端侧翼未知序列； 同理，以步骤(6)的连接物为模板，Pr1-Fl和THSO-F作为上下游引物进行第一轮PCR扩增；再以该轮PCR产物为模板，Pr1-F2和THSO-F为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，从而获得已知DNA序列3'端侧翼未知序列。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下:
(1)HSO-T接头的构建:HSO-T (IOOiimol / L)2u L, ddH208 y L，混匀；使用 PCR 基因扩增仪94°C变性3min，缓慢降温(I。。/ s)至25°C后，恒温退火30min ； (2)基因组DNA的酶切:酶切反应体系和条件为:10XBufferliiL，限制性内切酶.0.5u L，基因组DNA5 u L, ddH202.5 y L ;30或37°C反应4h ;其中IOXBuffer的类型和酶切温度需与所选内切酶相匹配； (3)酶切产物的修饰:酶切产物20ii L，10XPCR Buffer2.L，dNTP0.L，rTaq 或 ExTaq0.25 u L, ddH201.75 u L ;使用 PCR 基因扩增仪 72°C反应10min ； (4)酶切修饰产物与HSO-T接头的连接:酶切修饰产物5iiL，HSO-T接头3iiL，IOXLigase bufferl u L, T4DNA Ligasel u L ;16°C反应 4h 或过夜，即可作为 PCR 扩增的模板； (5)已知DNA序列5'端侧翼未知序列的PCR扩增:10 X PCR Buffer2.5 u L,dNTPl.5u L,连接物 2 ii L，THS0-F0.5 u L, Pr1-Rl0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶.0.25u L ;第一轮 PCR 扩增产物命名 为 5' -1st-Out ； 10XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L,.5' -lst-0ut2 u L, THS0-F0.5 u L, Pr1-R2 0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L,第二轮PCR扩增产物命名为5, -2nd-1n ； (6)已知DNA序列V端侧翼未知序列的PCR扩增:10X PCR Buffer2.5 u L,dNTPl.5u L,连接物 2 ii L，THS0-F0.5 u L, Pr1-Fl0.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶.0.25u L ;第一轮 PCR 扩增产物命名为 3' -1st-Out ； 10 XPCR Buffer2.5 u L, dNTPl.5 u L,.3' -lst-0ut2 u L, THS0-F0.5 u L, Pr1-F20.5 u L, ddH2017.75 u L, rTaq 酶 0.25 y L,第二轮PCR扩增产物命名为3' -2nd-1n。
【文档编号】C12Q1/68GK103627808SQ201310666359
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】邬敏辰, 汪俊卿, 胡蝶, 朱利娟, 李剑芳 申请人:江南大学