专利名称：一种发卡结构介导的测定5′端侧翼未知序列的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，是一种涉及限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、发卡结构(Hairpin Structure)连接禾口巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩增等技术，基于已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列测定其5'端 侧翼未知DNA序列的方法。
背景技术：
随着基因工程技术及互联网的发展，越来越多的基因序列被公布并可为广大科研 工作者所利用，但是报道的基因中有相当一部分只获得了部分DNA序列。当我们不了解某 个基因完整的DNA序列时，就无法对该基因进行结构和功能的深入研究。在分子生物学及 微生物育种研究中，经常需要克隆已知DNA序列的侧翼区域，如分离基因的调控区、获得基 因的排布信息、分析转基因的插入位点、构建图位克隆中的重叠群等。目前根据已知DNA序 列鉴定其两端未知序列的方法极其有限，从而使这项工作变得繁重和棘手。随机测序法是 通过大量地随机测定DNA序列并借助计算机进行排序的方法来获取目的DNA序列。该方法 存在很大的偶然性，通常会耗费很大的人力和物力。3'-和5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情况下获取目的基因完整的 mRNA序列。RACE法只能获取目的基因的可转录序列部分，而不能确定其上下游调控元件序 列。另外，该方法步骤较繁琐，mRNA又极其不稳定，反转录还特别容易受到丰度低和高级结 构的影响，因此效果也不是很理想。而利用同位素或生物素标记探针对基因组或DNA文库 进行杂交筛选的方法，则更是费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确、发卡结构 介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5'端侧翼未知DNA序列。本发明的技术方案①选用限制性内切酶单酶切基因组DNA ；②将纯化的酶切产 物与发卡结构进行连接；③选定发卡结构上的一段特异性序列作为5'端引物、两条靠近 未知序列端的已知DNA序列上的特异性序列作为3'端引物；④以发卡结构连接物为模板， 用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。具体步骤如下(1)引物及发卡结构的设计基于已知DNA序列设计两条3'端特异性引物，命 名为 Primer-Rl 和 Primer_R2 (18_22bp) ；Primer-R2 的 3'端距待测序列要保留 30bp 以 上长度，比Primer-Rl接近待测定的未知序列(见图1和图3)；设计一条易形成发卡结 构的寡聚核苷酸序列，命名为HS0(41bp)；基于HSO设计一条5'端特异性引物，命名为 HSO-F(18bp)。HSO 5' -NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG-3'或 5' -CTACTGGCA TGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN-3'，HSO-F :ATCCGCCCATGCCAGTAG-3，，
其中NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤(2)选用的限制 性内切酶的特性而定。(2)限制 性内切酶的选择分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从 Primer-Rl到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶。本发明可供选择常用的产生 5'末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、 Xba I和Xho I等，产生3'末端突出四个碱基的有Aat IKPst I ,Sac I和Sph I等，产生 5'末端突出两个碱基的有Cla I ,Msp I和Nde I等。(3)发卡结构的制备对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94°C热变性，随后缓慢降 温至25°C并保持一定时间，即可形成发卡结构。(4)PCR模板的构建采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化 的酶切产物与步骤(3)获得的发卡结构连接，即可作为PCR模板。(5)巢式PCR扩增以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO-F和Primer-Rl 为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO-F和Primer-R2为引物 进行第二轮PCR扩增。将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢 式PCR原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。本发明与现行的方法相比，具有如下的优点(1)操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进 行繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。(2)应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，发卡结构介导的PCR扩增可应用 于各种不同基因的5'端侧翼未知序列的测定。(3)操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，而且可供选择的 限制性内切酶较多。(4)引物特异性强。本发明通过利用发卡结构介导的PCR方法，把随机引物的扩增 转变成特异性引物的扩增，大幅度提高了 PCR扩增的特异性和效率。(5)结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段， 具有简捷、准确和实用性强等特点。(6)未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取 未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而影响。(7)成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，所以无需昂贵的仪器和试剂
品.ο
图1 粘性末端的5'端侧翼未知DNA序列克隆示意图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因组DNA经产生3‘粘性末端的限制性 内切酶Pst I酶切，纯化后与发卡结构连接构建PCR模板。图2:宇佐美曲霉EOOl第10家族木聚糖酶基因(xynlOA)5'端侧翼的测序结果图3:5'粘性末端的5'端侧翼未知DNA序列克隆示意图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因组DNA经产生5‘粘性末端的限制性 内切酶Msp I酶切，纯化后与发卡接头连接构建PCR模板。
图4 宇佐美曲霉EOOl第11家族木聚糖酶基因(xynllA)5'端侧翼的测序结果
具体实施例方式以下结合具体实施 例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 xynlOA启动子序列的测定。(I)DNA酶切产物的制备选用Pst I对宇佐美曲霉基因组DNA进行单酶切。构建 如下酶切体系10 X H Buffer 2μ 1, Pst I 2 μ 1，基因组DNA 10 μ 1，无菌水6 μ 1 ；将上述 体系在37°C水浴中反应4h。酶切纯化产物(20 μ 1)命名为xynlOAP。(2)发卡结构的制备=HSO(IOOym0VL) 2 μ 1，无菌水8 μ 1，充分混勻；94°C变性 3min，缓慢降温(1°C /s)至25°C后恒温退火30min。(3)xynlOAP 与发卡结构的连接10XT4 DNA Ligase Buffer Iul，HSO 3μ 1, xynlOAP 5μ 1，T4 DNA Ligase 1 μ 1 ； 16°C连接过夜。(4) xynlOA 启动子第一轮 PCR 扩增10 X PCR Buffer 2. 5 μ 1，dNTP 1. 5 μ 1， HSO 连接物 2 μ 1，HSO-F 0. 5 μ 1，XynlOA-Rl 0. 5 μ 1，无菌水 17. 75 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1 ； 94 °C 5min，30 个循环(94°C 30s，56°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 xynlOAP-Out ο(5) xynlOA 启动子第二轮 PCR 扩增10 X PCR Buffer 2· 5 μ 1，dNTP 1· 5 μ 1， xynlOAP-Out 0· 5 μ 1，HSO-F 0· 5 μ 1，Xynl0A-R20. 5 μ 1，无菌水 19. 25 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1 ； 94 0C 5min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 xynlOAP-In。(6) xynlOAP-In的克隆和测序将xynlOAP-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操 作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图2所示。实施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 xynllA启动子序列的测定。(I)DNA酶切产物的制备选用Msp I对宇佐美曲霉基因组DNA进行酶切。构建如 下酶切体系10XT Buffer 2 μ l，Msp I 2 μ 1,0. 1% BSA 2 μ 1，基因组DNA 10 μ 1，无菌水 4μ 1 ；将该体系在37°C水浴中反应4h。酶切纯化产物(20 μ 1)命名为xynllAP。(2)发卡接头的制备=HSO(IOOym0VL) 2 μ 1，无菌水8 μ 1，充分混勻；94°C变性 3min，缓慢降温(1°C /s)至25°C后恒温退火30min。(3)xynllAP 与发卡结构的连接10XT4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1, HSO 3μ 1, xynllAP 5μ1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1 ;16°C连接过夜。(4)xynllA 启动子第一轮 PCR 扩增10XPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1, HSO 连接物 2 μ 1，HSO-F 0. 5 μ 1，XynllA-Rl 0. 5 μ 1，无菌水 17. 75 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1 ; 94 0C 5min，30 个循环(94°C 30s，56°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 xynlIAP-Out ο(5) xynl IA 启动子第二轮 PCR 扩增10X PCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1, xynl IAP-Out 0· 5 μ 1，HSO-F 0· 5 μ 1，Xynl 1A-R20. 5 μ 1，无菌水 19. 25 μ 1，Taq 酶 0· 25 μ 1 ；94 °C 5min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 xynlIAP-In0 (6) xynlIAP-In的克隆和测 序将xynllAP-In按照割胶回收试剂盒说明书上的操 作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图4所示。
权利要求
1.一种发卡结构介导的PCR扩增已知DNA序列5'端侧翼未知序列的方法，其特征在 于选用限制性内切酶单酶切基因组DNA ；将纯化的酶切产物与发卡结构进行连接；利用引 物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5'端引物以及两条靠近未知序列端的 已知DNA序列上的互补序列作为3'端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进 行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5'端侧翼的未知序列；(1)引物及发卡结构的设计依据已知DNA序列设计两条3'端特异性引物，命名为 Primer-Rl和Primer_R2 (18_22bp) ；Primer-R2的3'端距待测序列要保留30bp以上长度， 它比ft~imer-Rl接近待测定的未知序列；设计一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列，命 名为HS(K41bp)；基于HSO设计一条5'端特异性引物，命名为HSO-F(ISbp)；HSO 5' -NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG-3'或 5 ‘ -CTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN-3‘，HSO-F 5‘ -ATCCGCCCATGCCAGTAG-3’，其中NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤( 选用的限制性内 切酶的特性而定；(2)限制性内切酶的选择分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从 Primer-Rl到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶；本发明可供选择常用的产生 5'末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、 Xba I和Xho I等；产生3'末端突出四个碱基的有Aat II, Pst K Sac I和Sph I等；产 生5'末端突出两个碱基的有Cla I ,Msp I和Nde I等；(3)发卡结构的形成对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94°C热变性3min，随后缓慢 降温至25°C并保持30min，即可形成发卡结构；G)PCR模板的构建采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化的酶 切产物与步骤(3)形成的发卡结构进行连接，即可作为PCR模板；(5)巢式PCR扩增以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO-F和ft~imer-Rl为引 物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO-F和ft~imer-R2为引物进行 第二轮PCR扩增；将两轮PCR (巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR 原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下(1)按如下的体系和条件单酶切宇佐美曲霉EOOl基因组DNA(以I^stI为例) IOXHBuffer 2μ 1, Pst I 2 μ 1，基因组DNA 10 μ 1，无菌水6 μ 1 ；将该体系在37°C水浴中 反应4h ；纯化回收酶切产物并溶于20 μ 1无菌水中；酶切纯化产物命名为xynlOAP ；(2)按如下体系和条件形成发卡结构=HSO(IOOym0VL)2 μ 1，去离子水8 μ 1，混勻； 94°C热变性3min，随后缓慢降温(1°C /s)至25°C后恒温退火30min ；(3)按如下的体系和条件连接xynlOAP与发卡结构HS0:10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，HSO 3 μ 1，xynlOAP 5μ 1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1 ； 16°C连接过夜；(4)按如下的体系和条件进行第一轮PCR扩增10XPCRBuffer 2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1，步骤(3)连接产物 2 μ 1，HSO-F 0· 5 μ 1，XynlOA-RlO. 5 μ 1，无菌水 17. 75 μ 1, Taq 酶 0. 25μ 1 ;94°C 5min，30 个循环(94°C 30s, 56 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin;首轮 PCR 扩增产物命名为xynlOAP-Out ；按如下的体系和条件进行第二轮PCR扩增10XPCR Buffer2. 5 μ 1, dNTP 1. 5μ 1, xynlOAP-Out 0. 5μ 1, HSO-F 0· 5 μ 1，XynlOA_R2 0· 5 μ 1，无菌水 19. 25μ 1，Taq 酶 0. 25μ 1 ;94°C 5min，30 个循(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ；第二轮PCR扩增产物命名为xynlOAP-In。
全文摘要
本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、发卡结构连接和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列测定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过合成一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列；选用单一限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化后与发卡结构连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、引物特异性强、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。
文档编号C12Q1/68GK102140503SQ20101055090
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者吴静, 唐存多, 张慧敏, 李剑芳, 汪俊卿, 邬敏辰, 高金湖 申请人:江南大学