专利名称：一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒和方法。
技术背景
大鲵在全球的分布主要是日本、北美和我国，在大鲵资源保护与产业发展方面，虽 然日本大鲵与美国隐鳃鲵在资源保护上不同程度的有所重视，我国在大鲵驯驯养繁殖术研 究和开发利用等方面已经处于国际领先地位，人工养殖大鲵不仅成为生态环境保护的手 段，而且已经成为一部分地区的特色养殖产业。人工养殖大鲵具有重大的生态价值和经济 价值。
我国大鲵主要分布于长江、黄河及珠江中上游支流的山涧溪流中。野生大鲵原产 地自然分布主要集中在我国的五个省，包括陕西、湖北、湖南、贵州和四等。目前全国范围内 均不同程度的开展了大鲵驯养繁殖工作，随着养殖规模的不断扩大，各种传染性疾病不断 爆发和流行，已严重制约了大鲵养殖的可持续发展。从2009年到2010年，根据不完全的统 计，全国因虹彩病毒病死亡的大鲵数量达到10万条以上，经济损失严重，同时也危害着野 生大鲵群的健康繁衍。利用电子显微镜和PCR等方法从死亡大鲵体内的肝脏、脾脏和肾脏 检测虹彩病毒是可行的的方法，但是很难应用于实际生产中。
已经有报道的均是从死亡的或生病大鲵的肝脏和脾脏进行检测，这种检测方法仅 仅对已发病或死亡的大鲵进行检测是有效的，对未表现临床症状或者健康的大鲵群仍然采 用这种方法则造成大鲵个体伤害，完全不适用于健康大鲵群的监控。到目前为止，还没有一 种对大鲵个体无伤害的检测方法。如何快捷方便确诊大鲵群中是否存在虹彩病毒，并应用 于未带毒大鲵选择与引种，减少病毒在大鲵群中传播，对大鲵养殖和保护具有重要意义。
病毒DNA的提取方法和PCR技术是目前广泛应用于科学研究和实际检测的成熟手 段。针对大鲵蜕皮中虹彩病毒基因组的简单而有效地提取方法，并以此DNA为模板PCR检 测大鲵虹彩病毒带毒情况还没有报道。发明内容
本发明所要解决的技术问题是本发明所要解决的技术问题是针对现有技术不足 提供一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒和方法。
本发明采用以下技术方案
1.非损伤活体大鲵样品获取方法
通过随机获得大鲵群中新鲜蜕皮，而不伤害大鲵群的任何一个个体，克服了从大 鲵的内脏组织才能获取样品的问题。只需将得到的蜕皮样本冻存于-20°C即可较长时期保 存或直接用于检测，这种方法我们在研究中首次使用，效果很好(见附图及说明)。这种获 取样品的方法可以对引种大鲵群带毒情况检测，避免将带有病毒的大鲵引入养殖场；同时 利用这种无伤害获取的样品跟踪监测大鲵群在养殖过程中虹彩病毒的感染情况，以便及时采取相应措施，减少损失。
2.提取样本中的虹彩病毒DNA检测试剂盒和检测方法
根据大鲵蜕皮的特点我们优化了从蜕皮中提取病毒基因组DNA的方法。通过设计 相应的试剂盒，并利用试剂盒进行标准步骤的检测，更加有利于在实际生产中应用。
试剂盒包括DNA提取试剂组合和PCR扩增试剂组合；提取样本中的病毒DNA试剂 组合
A液，蜕皮样本裂解液，1管，主要含有PBS ；1% triton-100 ；
B 液，1 管，200ug/ml 蛋白酶 K ；
C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/异戊醇，比例为25 24 1 ；
D 液，1 管，3mol/l 乙酸钠；
E液，1管，含有无水乙醇；
F液，1管，含有75%的乙醇；
G管，1管，含有灭菌超纯水；
PCR扩增PCR扩增试剂组合
H液，1管，含有PCR扩增反应液，包括去离子水，dNTP底物，含Mg2+的2X缓冲液； Taq酶；引物(可根据引物对数量增加管数并根据引物不同标记)；
I液，1管，阳性对照样品；
J液，1管，阴性对照品；
K 液，1 管，DNA marker II
上述试剂包装带有泡沫板的盒内。各小管放置在泡沫板的小孔中。100个无菌 1. 5ml的离心管和50个PCR管分别放置在两个塑料袋中，每个试剂盒可以一次检测至少10 个样品。
3用本发明上述试剂盒检测大鲵蜕皮中虹彩病毒。按以下具体步骤进行
1)养殖在同一池中的大鲵群，随机用眼科镊子和剪刀取蜕皮3-5片，尽量去除水 分，保存在2μ 1的离心管中，同时用取样剪刀剪10-20次，混勻，标记好后，保存在-20°C备 用。一定要注意每一个养殖池取样器械不能交叉使用。
2)蜕皮样本0. Ig新的1.5ml离心管中，加入A液500 μ 1，反复冻溶3次，加入B 液20μ 1，55°C水浴1. Oh后，4000rpm离心lOmin，去蜕皮碎片；
3)取上清500 μ 1于新的1. 5ml离心管中，加入等体积(500 μ 1) C液抽提，混合均 勻，室温放置5min, 12000rpm离心5min ；
4)取上清于新的1. 5ml离心管中，加1/10体积D液，3倍体积E液，置_20°C 30min 沉淀DNA，13，OOOrpm离心lOmin，小心倒掉上清液；
5)向上述离心管中加入500μ 1 F液，13，OOOrpm离心5min小心弃上清，重复一 遍；
6)于室温晾干后加入30 μ 1 G液溶解；即为待测模板DNA溶液。
7)取样品数量+2个PCR管，标记号码(根据测定的样品进行标记)，分别加入 19 μ 1的H液，并分别取第6步的液体(待测模板DNA溶液)、I液和J液1 μ 1加入到对应 标记号的PCR管中，混均后，5000rpm离心30sec，置于PCR仪上。
按以下条件进行扩增
95°C变性 5min — 95°C，30sec ；
58°C,30sec ；
72°C，30sec(30 个循环)—72°C，IOmin — 4°C保存。
8)反应结束后，向各PCR中加入4 μ 1的溴酚蓝混均，配制1 %的琼脂糖凝胶，分 别向加样孔中加入15μ 1的混合液，向另一孔中加入8μ 1的DNA marker II，120V电泳 20mino
9)结果判定电泳结束后，在紫外灯下观察，对比阳性和阴性对照，样品若在相同的 分子量处有条带表明该对应的大鲵群感染虹彩病毒，否则未感染。
本发明首次利用大鲵的新鲜蜕皮作为检测病料样品，解决了必须杀死大鲵个体才 能获取检测样品的不足；优化后，设计了简单而有效地提取大鲵蜕皮样品中的病毒基因的 试剂盒；针对虹彩病毒2个保守基因的2对PCR引物和聚合酶链式反应体系和条件；设立了 阳性和阴性对照品控制检测结果的可靠性。利用本发明的试剂盒和标准检测方法，更加适 应于在大鲵养殖生产的实际中应用。
图1为电泳照片。M =DNA Marker ； 1泳道阳性对照；2泳道阴性对照；3_12泳道 分别为十个不同样品；Sl 引物Sl ；S2 引物S2。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
一个大鲵虹彩病毒检测试剂盒试制
(规格按一个试剂盒检测10个样品)
A液，蜕皮样本裂解液，1管12ml，主要含有PBS ；1% triton-100
B 液，1 管 400ul，200ug/ml 蛋白酶 K ；
C液，1管，模板抽提液，1管12ml，含有酚/氯仿/异戊醇，比例为25 24 1 ；
D 液，1 管 2ml,3mol/l 乙酸钠；
E液，1管20ml，含有无水乙醇；
F液，1管40ml，含有75%的乙醇；
G管，1管1ml，含有灭菌超纯水；
H液，Sl管300 μ 1，含有PCR扩增反应液(20 μ 1体系)，包括去离子水，dNTP底物， 含 Mg2+ 的 1 X 缓冲液；Taq 酶；引物 Sl (5，-CCCCTCCCATTCTTCTTCTCC-3，禾口
5，-GGCGTTGGTCAGTCTACCGTAAT-3，)。
S2管300 μ 1，含有PCR扩增反应液(20 μ 1体系)，包括去离子水，dNTP 底物，含 Mg2+ 的 IX 缓冲液；Taq 酶；弓丨物 S2(5，-GGGCTAATGTATTGAAGACGC-3，和 5，-TTGTAAACTTGGAGTGGAGGG-3，)，
I液，1管3 μ 1阳性对照样品；内含有虹彩病毒DNA模板
J液，1管3 μ 1阴性对照品，内含有牛基因组DNA混合液
K 液，1 管 30 μ 1，DNA marker II
上述试剂包装带有泡沫板的硬纸盒内(长X宽X高=15X15X 15cm3)。各小管 放置在泡沫板的小孔中。100个无菌1. 5ml的离心管和30个PCR管分别放置在两个塑料袋中。
每个试剂盒可以一次检测至少10个样品。
实施例2:
用本发明上述试剂盒检测10个大鲵群虹彩病毒带毒情况
1.按本发明的要求，获得不同10个大鲵群蜕皮各5片，分别在2μ 1的离心管中用 取样剪刀剪10-20次，混勻。
2.蜕皮样本0. Ig编好号的(3-12号)新的1. 5ml离心管中，加入A液500 μ 1，反 复冻溶3次，加入B液20μ 1，55°C水浴l.Oh后，4000rpm离心lOmin，去蜕皮碎片。
3.取上清500 μ 1于新的1. 5ml离心管中(对应上步编号)，加入等体积(500 μ 1) C液抽提，混合均勻，室温放置5min，12000rpm离心5min ；
4.取上清于新的1. 5ml离心管中(对应上步编号)，加1/10体积D液，3倍体积E 液，置-200C 30min沉淀DNA, 13，OOOrpm离心IOmin,小心倒掉上清液；
5.向上述离心管中加入500 μ 1 F液，13，OOOrpm离心5min小心弃上清，重复一 遍；
6.于室温晾干后加入30 μ 1 G液溶解；即为待测模板DNA溶液。
7.取2+样品数量的PCR管，标记好(根据测定的样品进行标记)，分别加入19 μ 1 的H液，并分别取第6步的液体(待测模板DNA溶液)、I液和J液1 μ 1加入到对应标记号 的PCR管中，混均后5000rpm离心30秒，置于PCR仪上。
按以下条件进行扩增95"C 变性 5min — 95 °C，30sec ；58 "C，30sec ；72 °C， 30sec(30 个循环)—72°C，10min — 4°C保存。
8.反应结束后，向各PCR中加入4μ 1的溴酚蓝混均，配制的琼脂糖凝胶，分别 向琼脂糖凝胶加样孔中按顺序加入15 μ 1的PCR反应液，另外一孔加8 μ 1的DNAmarker II， 120V 电泳 20min。
9.电泳结束后，在紫外灯下观察，对比阳性和阴性对照，样品若在引物Sl :681bp 和引物S2 :568bp的分子量处有条带，表明该对应的大鲵群感染虹彩病毒，否则未感染，结 果见附图1，经过对10个大鲵蜕皮样品的检测显示，6，8，9号样品对应的大鲵群没有虹彩病 毒感染，而3，4，5，7，10，11，12号样品对应的大鲵群已经感染了虹彩病毒；设立阳性对照(1 泳道)和阴性对照O泳道)说明本发明的方法和检测体系是可靠的。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒，其特征在于，包括DNA提取 试剂组合和PCR扩增试剂组合，所述DNA提取试剂组合包括A液，蜕皮样本裂解液，1管，含有PBS triton-100 ； B液，1管，200μβ/πι1蛋白酶K;C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/异戊醇，比例为25 24 1 ； D液，1管，3mol/l乙酸钠； E液，1管，含有无水乙醇； F液，1管，含有75%的乙醇； G管，1管，含有灭菌超纯水； 所述PCR扩增试剂组合包括H液，含有PCR扩增反应液，包括去离子水，dNTP底物，含Mg2+的IX缓冲液；Taq酶；引 物；管数量由引物对数量决定； I液，1管，阳性对照样品； J液，1管，阴性对照品； K 液，1 管，DNA marker II。
2.根据权利要求1所述的试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤1)大鲵群蜕皮样本采集；2)取大鲵群蜕皮样本0.Ig于新的1. 5ml离心管中，加入所述A液500 μ 1，反复冻融3 次，加入所述B液20μ 1，55°C水浴l.Oh后，4000rpm离心lOmin，去蜕皮碎片；3)取上清500μ 1于新的1. 5ml离心管中，加入等体积所述C液抽提，混合均勻，室温放 置 5min, 12000rpm 离心 5min ；4)取上清于新的1.5ml离心管中，加1/10体积所述D液，3倍体积所述E液，置_20°C 30min沉淀DNA，13000rpm离心lOmin，小心倒掉上清液；5)向步骤4)所述离心管中加入500μ 1所述F液，13000rpm离心5min小心弃上清，重 复一遍；6)于室温晾干后加入30μ 1所述G液溶解；即为待测模板DNA溶液；7)取样品数量+2个PCR管，标记号码，分别加入19μ 1的所述H液，并分别取第6)步 的模板DNA溶液、所述I液和所述J液1 μ 1加入到对应标记号的PCR管中，混均后5000rpm 离心30秒，置于PCR仪上；按以下条件进行扩增95°C变性 5min — 95°C,30sec ； 58°C,30sec ；72°C，30sec, 30 个循环—72°C，IOmin — 4°C保存；8)反应结束后，向各PCR中加入4μ1的溴酚蓝混均，配制的琼脂糖凝胶，分别向加 样孔中加入15 μ 1的混合液，向另一加样孔中加8 μ 1的DNA marker II，120V电泳20min ；9)结果判定。
全文摘要
本发明公开了一种利用蜕皮检测大鲵群虹彩病毒带毒情况的试剂盒和检测的方法。试剂盒包括A液，蜕皮样本裂解液，1管，含有PBS；1％triton-100；B液，1管，200μg/ml蛋白酶K；C液，1管，模板抽提液，1管，含有酚/氯仿/异戊醇，比例为25∶24∶1；D液，1管，3mol/l乙酸钠等；本发明利用大鲵的新鲜蜕皮作为检测病料样品，解决了必须杀死大鲵个体才能获取检测样品的不足；根据大鲵蜕皮的特点我们优化了从蜕皮中提取病毒基因组DNA的方法，设计了简单而有效地提取大鲵蜕皮样品中的虹彩病毒基因的试剂盒，以及针对虹彩病毒2个保守基因的2对PCR引物和聚合酶链式反应条件；设立了阳性和阴性对照品。利用本发明的试剂盒并进行标准步骤的检测，更加可靠地掌握大鲵群虹彩病毒带毒情况，有利于在实际生产中应用。
文档编号C12Q1/68GK102031307SQ201010550620
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者安俊辉, 宋峰峰, 张晓明, 张驰, 杨长明, 胡沈荣, 董武子, 覃金洲, 邢福珊 申请人:汉中天成生物工程有限公司, 西北农林科技大学