专利名称：食品中三种致病菌的多重荧光定量pcr同时快速检测方法
技术领域：
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及应用多重荧光定量PCR法对食 品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的同时快速检测方法及其应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌是三种常见的食源性致病菌，也是我国食 品国家卫生标准中致病菌检测的三项强制指标。其中金黄色葡萄球菌是引起人类化脓性感 染最常见的致病菌；沙门氏菌作为人畜共患的的肠道致病菌，其导致的食物中毒数量一直 处于世界食物中毒病例前列；志贺氏菌通称痢疾杆菌，是引起人类细菌性痢疾的主要病原 菌。目前，国家标准中对上述致病菌的检测主要依靠传统的细菌培养、生化鉴定的方 法，步骤复杂、检测周期长，已不能完全适应大规模快速检测的需要。近年来，随着微生物分 子生物学的发展，PCR和实时荧光定量PCR技术为食品中致病菌的高通量快速检测开辟了 新的途径，相关的方法学研究国内外已有大量探索。然而，针对我国各类食品国标中均须 强制检验的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种致病菌，其同时检测的多重荧光定量 PCR方法尚未见报导。此外，目前国内对食品中致病菌的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性 内参(IPC)对反应体系进行监控。因此，建立以多重荧光定量PCR为基础的食品中金黄色 葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速同时检测方法将对食品安全的快速监管具有重要的 创新性实践意义。
发明内容
本发明需要解决的问题包括首先，探索食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺 氏菌三种目标致病菌的同时快速增菌策略，并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法； 然后，根据三种致病菌的保守基因分别设计引物和Taqman荧光探针，并自行设计、构建作 为阳性内参的重组DNA作为PCR反应的质控；最后，进行多重荧光定量PCR检测方法优化及 特异性、灵敏度考察，并应用此方法对大量食品盲样进行检测以验证其实用价值。本发明中，我们从金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌基因组中保守序列出发， 探索并完善了食品中这三种致病菌同时快速检测的多重Taqman荧光定量PCR检测方法，并 设计了阳性内参确保检测的可靠性。本发明弥补了这三种重要食源性致病菌同时快速检测 的技术空白，为食品中致病菌污染的控制探索了新的途径。本发明的技术方案包括1.通过使用不同配比的混合培养基对食品中的三种目 标致病菌进行共增菌，通过比较增菌效果确认最佳的培养基配比。2.比较多种细菌基因组 总DNA提取方法所提取的培养液中DNA的浓度与纯度，确认最佳的提取方法。3.设计并合 成多重荧光定量的引物与Taqman探针，设计并构建重组阳性内参DNA。4.针对提取的细菌 基因组总DNA进行多重荧光定量PCR检测，考察方法的特异性与灵敏度。5.对大量食品样 品进行盲样检测验证多重荧光定量PCR方法的实用性。
1.将三种目标致病菌各IX 101 cfu同时于不同配比的革兰氏阴性菌通用GN培 养基/7.5% NaCl肉汤混合培养基中快速扩增，并使用传统国标方法计数。由表1中可见， 当混合培养基体积比为2:1时，可于6小时内将三种致病菌同时扩增至106 cfu/ml ；当配比 小于2:1时，金黄色葡萄球菌的扩增占显著优势，沙门氏菌和志贺氏菌生长受到抑制；当配 比大于2:1则反之。因此，为适应同时定性检测的需要，确定GN培养基和7.5% NaCl肉汤 的体积比为2:1，37°C振摇培养6 h为食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌同时快 速增菌的最佳条件。表1.快速共增菌后的细菌计数(cfu/ml)
GN/7. 5%NaCl 肉汤(V/V)1:31:21:12:13:1沙门氏菌2. 1X1043. 9X1042. 9X1053. 3X1066. 2X107金黄色葡萄球菌4. 2X1086. 8X1073. 3X1077. 1X1069. 5X104志贺氏菌3. 8X1055. 5X1059. 1X1055. 2X1067. 6X107
2.分别使用Qiagen公司柱离心式细菌基因组快速提取试剂盒和溶菌酶-蛋白酶K法 手工提取细菌基因组DNA，测定浓度与纯度后表明，柱离心法提取后DNA浓度均达0. 5Pg/ML 以上，且0D260/0D280在1. 75-1. 85之间；而手工抽提后溶于同样体积的DNA浓度仅有约 0. 2Pg/ML左右，0D260/0D280在1. 85-1. 90之间。因此，使用Qiagen柱离心式细菌基因组 DNA快速提取试剂盒较溶菌酶_蛋白酶K法具有更高的提取效率，且DNA纯度更高。通过提 取10倍梯度稀释的细菌培养物中的基因组DNA证明，当细菌浓度在104-108之间时，使用进 口柱离心式试剂盒可使基因组DNA提取效率保持稳定，且对G+和G_菌无明显差异。因此， 本发明选择Qiagen柱离心式试剂盒为提取细菌的基因组DNA的最佳方法。
3.本发明分别根据沙门氏菌的复制原点C基因、金黄色葡萄球菌的Nuc基因、志 贺氏菌的IpaH基因设计了用于多重荧光定量PCR检测的扩增引物和Taqman探针，分别使 用荧光基团FAM、TAMARA及CY5作为探针的发光基团，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长 段用于同时检测。引物与探针序列见表2。 表2.荧光定量PCR引物与探针序列
目标致病菌引物与探针序列(5 to 3，)目标基因正向:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTAACTTTAGTTGjfffF金黄色葡萄球菌反向:TGCWZTATATACTGTTG'SATCTTCAGAA(342-438,探针:FAW-TGCATCACAAACAGATAACGGCCTAMTAGMCt-BHQ 197bp)正向:TTATTAOJATCGCGCCAtKCOtj'C沙门ft菌反向:GGACCACGATCACCCrATC(165-264,探针:TMM-TCMIGCGTTGGAMGGATCACTAGCTGT-BmZlOObp)正向:TCCGATACCCTCTCTGCACGCMTIpalf\ 志Sift菌反向:AGCGAAAfJACTGCTGTCClMGCTC(280-384,探针:CY5-ATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATG :TG-BHa2105bp)阳性内参(IPC)探针:J0I-TCCTCCTGCATCAGAGGTGCTTCGA-BH32重组序列
4用于监控多重荧光定量PCR扩增的阳性内参DNA构建流程见附
图1。重组质粒 PUC57-IPC经测序，其序列与设计完全吻合。用于扩增阳性内参的Taqman探针序列见表2。 将双酶切后回收的内参小片段用双蒸水梯度稀释后分别加入多重荧光定量PCR反应体系 进行扩增，选择Ct值为35左右的稀释度为实际使用的阳性内参浓度。4.将42种已知菌株快速扩增并提取总DNA后，分别使用单重和多重荧光定量PCR 方法对目标致病菌进行检测，同时加入阳性内参及其探针监控反应体系。使用特异性引物 /探针对相应目标致病菌进行单重荧光定量PCR反应，均由相应的报告基团在35个循环内 出现典型的扩增曲线；使用混合引物/探针对42种已知菌株进行多重荧光定量PCR检测， 其检测结果也与设计完全相符三种目标致病菌均由相应报告基团出现显著扩增，且未出 现其他扩增，对除目标致病菌外的其他细菌的多重荧光定量PCR检测均未见任何扩增。阳 性内参DNA在多重荧光定量PCR体系中扩增的Ct值均保持在35左右。对42种已知单菌 株进行多重荧光定量PCR检测的特异性考察结果见表3 ；对三种目标致病菌标准菌株单重 和多重荧光定量PCR检测的典型扩增曲线见附图2。同时，对随机制备的两种以上已知标准菌株同时污染的样本21份进行多重荧光 定量PCR检测也表明，不同目标致病菌的基因组DNA未对检测产生交叉干扰，不同组合的目 标致病菌均可被同时检出，且未出现未预知的其他扩增。表3多重荧光定量PCR检测的特异性考察
权利要求
一种对食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行同时快速检测的多重荧光定量PCR方法，其特征是由以下步骤构成 (1)应用一定配比的含7.5%氯化钠肉汤和GN的混合培养基对含有上述致病菌的食品进行快速同时增菌，并使用离心柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养液中的细菌基因组总DNA； (2)应用根据沙门氏菌的复制原点C基因、金黄色葡萄球菌的Nuc基因、志贺氏菌的IpaH基因设计的扩增引物和Taqman探针对上述细菌基因组总DNA进行多重荧光定量PCR同时检测，并使用自行设计的重组DNA片段作为阳性内参监控反应体系，根据分别代表三种致病菌的荧光信号在一定循环数内是否出现显著扩增判定食品中是否存在上述致病菌。
2.根据权利要求1所述的对食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行同时 快速检测的多重荧光定量PCR方法，其特征在于在检测中使用自行设计并构建的重组阳 性内参DNA片段，内参的扩增片段结合了本发明中志贺氏菌荧光定量PCR检测的引物结合 序列与人对氧磷酶基因的小片段，为原核基因与真菌来源的真核基因的重组基因片段，与 食品中细菌基因组DNA及其他DNA成分的同源性很低，确保了其在多重荧光定量PCR体系 中的独立性，有效防止假阴性检测结果的出现，与市售的阳性内参相比，反应体系中减少了 一对内参引物，降低了对多重荧光定量PCR体系产生干扰的风险，用于本发明及所有包含 志贺氏菌为目标致病菌的单重或多重荧光定量PCR检测的反应体系监测。
3.权利要求1所述食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行同时快速检测 的多重荧光定量PCR方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。
全文摘要
本发明属于食品质量安全检测技术领域。具体涉及应用快速共增菌、细菌基因组提取、多重Taqman荧光定量PCR的流程对食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行同时快速检测，并设计用以保证检测结果准确性的重组阳性内参DNA监控PCR反应。结果表明，以上方法具有良好的针对目标致病菌的特异性，检测限可达101cfu/PCR反应，且反应体系各组分间未见交叉干扰。对人工污染的食品盲样检测验证了方法的实用性。阳性内参DNA有效地保证了检测的可靠性，避免了假阴性结果的出现。总之，本发明建立了一种食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时快速检测的多重荧光定量PCR方法，为食源性致病菌的高通量检测提供了新的方法。
文档编号C12Q1/10GK101974641SQ20101055013
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者凌睿, 刘新梅, 周骏贵, 张驰, 杨军 申请人:南京市产品质量监督检验院