专利名称：用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系和使用方法
技术领域：
本发明涉及用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系和使用方法，可使动物 精原干细胞在短期内大量增殖。
背景技术：
1971年，Huckins, Oakberg, Dym等分别通过对精原干细胞(SSCs)的研究，确认 SSCs定居在曲细精管上皮的基膜处，是由Asingle (As)细胞组成，该类细胞既可自我更新 维持其细胞数量，又可定向分化生成各级生精细胞直至最后生成精子。2003年和2006年， Wagab-Wahlgren和Anjamrooz等分别证实了表皮生长因子(EGF)可促进SSCsDNA的合成、 有丝分裂以及克隆簇的形成。1993年，Niederberger等通过研究认为EGF超家族中的EGF 和TGF- α都具有调控生殖细胞增殖的能力。且主要通过与其受体erbBl (Ullric等，1982)， erbB2 (Coussens 等，1985)，erbB3 (Krau 等，1989)和 erbB4 (Plowman 等，1993)结合之后发 挥作用。1997年，Robert等发现EGF和其受体复合物能够促进环氧化酶_2的超表达，该酶 能够改善SSCs减数分裂的活性。2008年，王凯明等通过研究发现10_7-10_6mol/ml的EGF能 够有效的促进SSCs克隆簇的形成。1999年，Boussouar等确定了 EGF可以刺激支持细胞合 成乳酸盐而后促进SSCs的增殖。2010年，余荣娇等通过研究认为，EGF通过激活JAK-STAT 信号转导通路刺激SSCs的增殖。1992年，loir等发现胰岛素样生长因子(EGFs)与其受体 结合后可直接刺激鲑鳟鱼生殖细胞DNA的合成。2002年，Yin等发现，干细胞因子、白血病 抑制因子和成纤维细胞生长因子都能独立促进SSCs的增殖。
确立此种培养液的目的在于为精原干细胞的稳定和高效增殖提供一整套支撑体 系，从而为濒危物种的保护与繁衍提供可靠的实践方案。发明内容
本发明的目的在于，提供新型的提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系。三种 培养液以不同种类和不同配伍的生长因子为主要成分，同时配伍高糖DMEM(含4mM L-谷氨 酰胺)，胎牛血清(10%)，维生素E (5uM)，双抗[青霉素(100IU/ml)和链霉素(100mg/ml)]。 探索最佳配伍的培养液，来提高精原干细胞的增殖率。
为了实现上目的，本发明采取如下技术方案
用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系，包括基础培养液和促生长因子； 所述基础培养液为含10%胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM800ul+双抗50ul+5uM 的维生素E30ul ；所述促生长因子包括lOng/ml表皮生长因子EGF20ul。
所述的培养液体系，所述促生长因子包括20ng/ml表皮生长因子EGF和20ng/ml 胰岛素样生长因子-1IGF-1各10ul。
所述的培养液体系，所述促生长因子包括20ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml胰 岛素样生长因子-lIGF-l、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF各IOul。
所述培养液体系的使用方法，1)，首先用所述基础培养液对精原细胞进行培养；2)，待精原细胞生长至细胞簇较多时对其进行预先处理，所述预先处理先用10%浓度为 30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH对二次纯化的精原细胞液处理15mins，然后接种到支持细胞饲 养层上，同时加入所述促生长因子，继续培养。
所述培养液体系的使用方法，1)，首先用所述基础培养液对精原细胞进行培养； 2)，二次纯化的精原细胞液接种到支持细胞饲养层上培养20个小时后，用10%浓度为30ng ml-1的卵泡刺激素FSH处理30分钟，而后重新接种到支持细胞饲养层上培养，同时加入所 述促生长因子，继续培养。
可使动物精原干细胞在短期内大量增殖。
图1为传代后第一代精原细胞的形态学观察QOO X)；
图2为传代后第一代精原细胞的形态学观察QOO X)；
图3为传代后第一代精原细胞的形态学观察O00X)；
图4为传代后第一代精原细胞的形态学观察(100X)；
图5为二次纯化得到的精原细胞簇的AKP染色QOO X)；
图6为PT-PCR分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
本实验设置了以下培养方案
1.空白对照组培养体系为含胎牛血清(10% )的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+双抗50ul+维生素E(5uM)30ul+ 二次纯化细胞液每孔IOOul。
2.单因子组培养体系为含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+双抗50ul+维生素E(5uM) 30ul+ 二次纯化细胞液每孔IOOul+表皮生长因子 EGF(10ng/ml)20ul/胰岛素样生长因子IGF-I (lOng/ml) 20ul/碱性成纤维细胞生长因子 bFGF(10ng/ml)20uL·注单因子组分三个类型，其中以预先处理的EGF (lOng/ml)组效果最 优。
3.双因子组培养体系为含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+双抗50ul+维生素E(5uM)30ul+ 二次纯化细胞液每孔IOOul+[20ng/ml表皮生 长因子EGF和20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-1各IOul]/[20ng/ml表皮生长因子EGF 和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF各IOul] / [20ng/ml胰岛素样生长因子IGF-I和 20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF各IOul]。双因子组分三个类型，其中以后处理的 表皮生长因子和胰岛素样生长因子(20ng/ml 20ng/ml)组效果最优。
4.三因子组培养体系为含胎牛血清(10%)的高糖DMEM(含4mM L-谷氨酰 胺)800ul+双抗50ul+维生素E(5uM)30ul+ 二次纯化细胞液每孔IOOul+[20ng/ml表皮生 长因子EGF，20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-1和lOng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF 各IOul]。三因子组分三个类型，其中以后处理20ng/ml表皮生长因子，20ng/ml胰岛素样 生长因子和lOng/ml碱性成纤维生长因子组效果最优。
四种培养方式中，空白对照组不加任何生长因子。也不做关于FSH的预前处理和后处理，所谓预先处理指的是经过纯化的精原干细胞在向纯化的支持细胞接种以前先用 10%浓度为30ng πιΓ1的FSH处理15分钟，所谓后处理指的是经过纯化的精原干细胞在向纯 化的支持细胞接种20小时后，吸弃每孔中1/3的培养液，而后用含10%浓度为SOngmr1FSH 的培养基处理30分钟，离心去上清，重新接种到培养板中。上述单因子组，双因子组和三因 子组都要做关于FSH的预前处理和后处理。不同的处理方式和培养液对精原干细胞促增殖 影响作用不同，关于促生长因子的促增殖影响见表1、表2，、表3，和图1，2，3。
精原干细胞的检测方法(1)形态学观察法。典型特征是链状分布，8细胞链和16 细胞链，根据这些典型特征可以确定其为精原细胞(图4)。(2) AKP染色。原理是在碱性磷 酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，会形成不 溶性的深蓝色至蓝紫色的终产物NBT-formazan (图5)。(3) RT-PCR鉴定。根据NCBI发表 的关于基因β -actin和Ngn3的序列信息，采用primer5. 0软件设计引物，并由华大基因公 司合成，引物信息见下表4，电泳图见图6。
表1单因子的促增值率(％ )
权利要求
1.用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系，其特征在于，包括基础培养液和促 生长因子；所述基础培养液为含10%胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEMSOOul+双 抗50ul+5uM的维生素E30ul ；所述促生长因子包括lOng/ml表皮生长因子EGF20ul。
2.根据权利要求1所述的培养液体系，其特征在于，所述促生长因子包括20ng/ml表皮 生长因子EGF和20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-1各IOul。
3.根据权利要求1所述的培养液体系，其特征在于，所述促生长因子包括20ng/ml表皮 生长因子EGF、20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-I、lOng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF 各 IOul。
4.权利要求1所述培养液体系的使用方法，其特征在于，1)，首先用所述基础培养液 对精原细胞进行培养；2)，待精原细胞生长至细胞簇较多时对其进行预先处理，所述预先处 理先用10%浓度为30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH对二次纯化的精原细胞液处理15mins，然 后接种到支持细胞饲养层上，同时加入所述促生长因子，继续培养。
5.权利要求2或3所述培养液体系的使用方法，其特征在于，1)，首先用所述基础培养 液对精原细胞进行培养；幻，二次纯化的精原细胞液接种到支持细胞饲养层上培养20个小 时后，用10%浓度为30ng πιΓ1的卵泡刺激素FSH处理30分钟，而后重新接种到支持细胞 饲养层上培养，同时加入所述促生长因子，继续培养。
全文摘要
本发明公开了用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系，包括基础培养液和促生长因子；所述基础培养液为含10％胎牛血清并含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM800ul+双抗50ul+5uM的维生素E30ul；所述促生长因子包括10ng/ml表皮生长因子EGF20ul。所述促生长因子还可以包括20ng/ml表皮生长因子EGF和20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-1各10ul。所述促生长因子还可以包括20ng/ml表皮生长因子EGF、20ng/ml胰岛素样生长因子-1IGF-1、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF各10ul，还公开了培养液体系的使用方法。可使动物精原干细胞在短期内大量增殖。
文档编号C12N5/076GK102031242SQ20101055060
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者凡志国, 刘玉, 李青旺, 江中良, 索丽娟, 胡建宏 申请人:西北农林科技大学