专利名称：一种新型β-甘露聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种新型β -甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，新型β -甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组 β -甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于微生物基因工程技术领域。
背景技术：
甘露聚糖是一种结构较复杂的多糖，可分为均一甘露聚糖和异甘露聚糖。均一甘露聚糖是以β-1，4-甘露糖苷键连接而成的线性多糖；如果主链的某些甘露糖残基被葡萄糖取代或半乳糖通过α -1，6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称为异甘露聚糖，主要有葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖。甘露聚糖是自然界中一类较丰富的半纤维素资源，其数量仅次于木聚糖。豆科植物种子、针叶树木材、咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖；在植物性饲料原料中含量也较高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22. 7%、11. 9%、9. 6%和33. 7%;—些植物胶，如田青胶、角豆胶、魔芋精粉等几乎完全是由半乳糖或葡萄糖与甘露糖组成的甘露聚糖。甘露聚糖酶(β-ι， 4-D-mannan mannohydrolase, EC 3. 2. 1. 78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物甘露聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在食品、医药、饲料、造纸、纺织、洗涤剂和石油开采等领域中的广泛应用。为了提高甘露聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) β -甘露聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型β -甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆， 新型β -甘露聚糖酶工程菌的构建，以及重组β -甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明来源于宇佐美曲霉EOOl的一种新型甘露聚糖酶属于糖苷水解酶的第5家族，命名为Aus Man5A，其相应的基因命名为Aus man5A。Aus Man5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。本发明的技术方案一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型 β -甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO=I和SEQ ID NO :2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。宇佐美曲霉(A. usamii)E001菌株由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2008年在 《生物加工过程》杂志的Vol. 6 No. 2 Pg. 38公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。所述的重组β -甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO :3。所述的重组β -甘露聚糖酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用ρΗ 4. 8、乙酸-乙酸钠缓冲液配制的质量浓度为0. 5%的角豆胶溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C 准确反应IOmin ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加 0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL，摇勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个β -甘露聚糖酶活性单位(IU)。所述的新型β -甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和表达方法(1) β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆首先对Aspergillus aculeatus(GenBankL35487) > Aspergillus sulphureus(GenBank DQ328335)禾口 Trichoderma reesei (GenBank L25310) β -甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物 Man5A-3Fl 和 Man5A_3F2。Man5A-3Fl 5' -GCTACTT(C/T)GC(C/G)GG(A/G/C)AC(G/C)AAC-3‘Man5A-3F2 5‘ -TACTGG (A/T)(T/G)C(G/T)(G/C)(T/G)TTCCT(G/C)AC-3‘提取A.usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与 pUCm-Τ载体连接(pUCm-T-man5A3 ‘)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到A.usamii EOOl新型β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列。(2) β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的β -甘露聚糖酶基因3 ‘端mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5Rl和Man5A_5R2。Man5A-5Rl 5 ‘ -ATTGTCGATTTGCCGTCCTG-3‘Man5A-5R2 5‘ -GCAGTTGGTACCAGACTGTG-3‘按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit说明书进行5' -RACE。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A5')，转化JM109， 经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到A.USamii EOOl新型β-甘露聚糖酶基因5'端 mRNA序列。(3) β -甘露聚糖酶基因5'端调控序列的克隆采用我们发明的一种T载体介导的PCR方法，以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和 Man5A-5Rl为引物，第二轮PCR以T-PrimerF和Man5A_5R2为引物。将两轮PCR产物用
琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶基因5‘端调控序列。
(4) β -甘露聚糖酶基因3'端调控序列的克隆基于上述得到的β -甘露聚糖酶基因3 ‘端mRNA序列，设计两条正向引物Man5A-3F3和Man5A_3F4。
Man5A-3F3 5‘ -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘Man5A-3F4 5' -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘采用我们发明的一种T载体介导的PCR方法，以经处理的A.usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以Man5A-3F3和T-PrimerR为引物，第二轮PCR以Man5A_3F4 和T-PrimerR为引物。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到 A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶基因3'端调控序列。(5) β -甘露聚糖酶基因(Aus man5A)的生物信息学分析将Aus man5A的5'和 3 ‘端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly (A)的完整mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open Reading Frame)进行分析，进而推导出Aus Man5A的氨基酸序列；最后进行信号肽预测。将Aus man5A的编码区DNA序列与它的两侧调控序列进行拼接，获得完整DNA序列，并对其5'端启动子区域和3'端区域的功能进行预测。(6) β -甘露聚糖酶基因内含子序列的测定基于上述得到的β -甘露聚糖酶基因完整mRNA序列，设计一对引物Man5A-Fl和Man5A_R。Man5A-Fl 5' GAATTCATGAAGCTTTCCAACGCCCTC-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点Man5A-R 5' GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGCAG-3 ’，含 Not I 酶切位点以A. usamii EOOl基因组DNA为模板，Man5A_Fl和Man5A_R为引物进行PCR，将其产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A-DNA)， 转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶基因的编码区DNA序列。将DNA序列与mRNA序列用DNAMAN 6. 0进行序列比对，便能得出 A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶基因2个内含子序列。(7)构建含编码β -甘露聚糖酶成熟肽基因的表达质粒基于上述得到的β -甘露聚糖酶基因完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一条正向引物Man5A-F。Man5A-F 5' ~GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC~3 ‘，含 EcoR I 酶切位点按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用说明书进行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Man5A_F 为引物进行第一轮PCR ；以Man5A-F和Man5A-R为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A)，转化 JM109,经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T_man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-man5A(图幻，并对重组质粒进行序列测定。(8)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K_man5A 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ man5A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组β -甘露聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的重组β-甘露聚糖酶。
本发明的有益效果本发明提供了一种新型β-甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA 序列的克隆，新型β-甘露聚糖酶工程菌GS115/man5A的构建，以其重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明来源于宇佐美曲霉EOOl的一种新型β -甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Aus Man5A，其相应的基因命名为Aus man5A0 Aus Man5A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值，也为其它β-甘露聚糖酶的研究奠定了理论基础。
图1 获取A. usamii EOOl Man5A基因完整mRNA和DNA序列的流程2 重组质粒pPIC9K_man5A的构建示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Man5A_3Fl为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C 2min，30个循环 (94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 90s) ,72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 Man5A_3F2 为引物进行第二轮 PCR，其反应条件为94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 90s), 72°C IOmin0将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接 (pUCm-T-man5A3 ‘)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus man5A 3 ‘ 端mRNA序列。实施例2β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Man5A-5Rl 为引物进行第一轮 PCR，其反应条件为94°C 3min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ; Whner Primer和Man5A_5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 3min,30个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s),72°C IOmin0将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A5')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus man5A 5 ‘端mRNA序列。实施例3β_甘露聚糖酶基因5'端调控序列的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和 Man5A-5Rl 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72°C IOmin ；第二轮 PCR 以 T-PrimerF 和 Man5A_5R2 为引物，反应条件为94°C，4min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30s, 72°C 60s)，72°C lOmin。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus man5A 5'端调控序列。实施例4β-甘露聚糖酶基因3'端调控序列的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以Man5A_3F3和 T-PrimerR 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s),720C IOmin ；第二轮 PCR 以 Man5A-3F4 和 T-PrimerR 为引物，反应条件为-MV 4min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30s, 72°C 60s)，72°C lOmin。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus man5A 3'端调控序列。实施例5构建含编码β -甘露聚糖酶成熟肽基因的表达质粒以Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以 Man5A-F和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，反应条件为94°C 2min，30个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 Man5A_F 和 Man5A_R 为引物进行第二轮 PCR，反应条件为94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C lOmin。将第二轮PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-man5A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K 质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-man5A，并对重组质粒进行序列测定。实施例6 GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选， 得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A。该基因工程菌用1. 0%甲醇诱导表达96h， 采用DNS法测得发酵液中重组β -甘露聚糖酶活性达452IU/mL。发酵液经离心后的上清液为重组β -甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10，OOODa的超滤膜浓缩，再经 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和kphadex G_75凝胶过滤层析纯化，纯化后经 SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组β -甘露聚糖酶的分子量为45kDa。该重组β -甘露聚糖酶的最适作用温度75°C，最适作用ρΗ 3.5，该酶在？!1 3. 0-7. 0、70°C以下稳定；金属离子Al3+、Ca2+对酶活性有明显的激活作用，而Ag+则具有很强的抑制作用。
权利要求
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型β -甘露聚糖酶基因，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
2.如权利要求1所述的新型β-甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3。
3.A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的获取方法(1)β-甘露聚糖酶基因3'端mRNA序列的克隆首先对A. aculeatus、A. sulphureus 和T.reesei β -甘露聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对它们的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Man5A-3Fl和Man5A-3F2 ；Man5A-3F1:5, -GCTACTT(C/T)GC(C/G)GG(A/G/C)AC(G/C)AAC-3‘Man5A-3F2 5 ‘ -TACTGG(A/T)(T/G)C(G/T)(G/C)(T/G)TTCCT(G/C)AC-3‘以A. usamii EOOl总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成 cDNA的第一条链；以Man5A-3Fl和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，其反应条件为 94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 Man5A_3F2 和 M13 ft~imerM4为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 2min，30个循环(94°C 30s, 53°C 30s，72°C 90s)，72°C IOmin ；目的条带经克隆、测序，得到Aus man5A 3'端mRNA序列;(2)β-甘露聚糖酶基因5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus man5A 3'端 mRNA序列，设计两条反向引物Man5A-5Rl和Man5A_5R2 ；Man5A-5Rl 5' -ATTGTCGATTTGCCGTCCTG-3‘Man5A-5R2 5‘ -GCAGTTGGTACCAGACTGTG-3‘以合成的 cDNA 第一条链为模板，5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Man5A_5Rl 为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C 3min，30个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；以hner Primer和Man5A_5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为 940C 3min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的条带经克隆、测序，得到Ausman5A 5 ‘端mRNA序列；(3)β-甘露聚糖酶基因5'端调控序列的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA 为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Man5A-5Rl为引物，其反应条件为94°C %iin，30个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；第二轮PCR 以 T-PrimerF和 Man5A_5R2 为引物，其反应条件为94°C，^iin，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ； 目的条带经克隆、测序，得到Aus man5A 5'端调控序列；(4)β-甘露聚糖酶基因3'端调控序列的克隆基于上述得到的Aus man5A 3'端 mRNA序列，设计两条正向引物Man5A-3F3和Man5A_3F4 ；Man5A-3F3 5‘ -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘Man5A-3F4 5‘ -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以Man5A_3F3和T-PrimerR 为引物，其反应条件为94°C %iin，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；第二轮PCR以Man5A-3F4和T-PrimerR为引物，反应条件为94°C 4min，30个循环 (94°C 30s，55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的条带经克隆、测序，得到 Aus man5A 3'端调控序列。
4.A. usamii EOOl新型β -甘露聚糖酶工程菌的构建和表达方法(1)构建含编码Aus Man5A成熟肽基因的表达质粒以合成的cDNA第一条链为模板，第一轮PCR以Man5A-F和M13 Primer M4为引物，反应条件为94°C 2min，30个循环 (94°C 30s，53°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；第二轮PCR 以 Man5A_F和 Man5A_R 为引物，反应条件为94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s)，72°C IOmin ；将第二轮 PCR的目的条带进行克隆、测序；测序结果正确的pUCm-T-man5A与pPIC9K质粒均用EcoR I 和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒pPIC9K-man5A，并对表达质粒进行测序鉴定；(2)GS115/man5A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K_man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ man5A;该基因工程菌用1.0%甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β -甘露聚糖酶活性达452 IU/mL;发酵液经离心后的上清液为重组β-甘露聚糖酶粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10，000 Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-kpharose Fast Flow离子交换层析和kphadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组 β -甘露聚糖酶的分子量为45kDa ；该重组β -甘露聚糖酶的最适作用温度75°C，最适作用 PH 3.5，在？!1 3.0-7.0、70°C以下稳定；金属离子Al3+、Ca2+对酶活性有明显的激活作用，而 Ag+则具有很强的抑制作用。
全文摘要
本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的新型β-甘露聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息学分析表明该β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶第5家族，命名为Aus Man5A，其氨基酸序列为SEQ ID NO3，相应的基因命名为Aus man5A。本发明还公开了β-甘露聚糖酶工程菌的构建以及重组β-甘露聚糖酶的高效表达和纯化的方法，制备的重组β-甘露聚糖酶的最适作用温度和pH分别为75℃和3.5，在pH 3.0-7.0、70℃以下稳定，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N15/56GK102154343SQ20101055092
公开日2011年8月17日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者唐存多, 李剑芳, 赵顺阁, 邬敏辰, 郭静, 韦敬土 申请人:江南大学