专利名称：一种t载体介导的测定5′端侧翼未知序列的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，是一种涉及限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、pUCm-T 载体连接和巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩 增等技术，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列确定其5'端侧翼未知DNA序 列的方法。
背景技术：
GenBank的核酸序列信息日益丰富，但报道的许多新基因仅获取了部分DNA序列。 当我们不了解某个基因完整的DNA序列时，就无法深入研究该基因的结构和功能，因此需 要从基因的部分已知DNA序列来确定其完整的序列，由于现行的方法极其有限，从而使这 项工作变得繁重和棘手。随机测序法是通过大量的随机测定DNA序列，并借助计算机进行 排序的方法来获取所需要的DNA序列。该方法存在很大的偶然性，通常会耗费很大的人力 和物力。3'-和 5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已 知部分mRNA序列的情况下，获取目的基因完整的mRNA序列。RACE法只能获取基因的可转 录部分，而不能确定基因的上下游调控元件序列。另外，RACE法步骤较繁琐，mRNA又极其不 稳定，反转录还特别容易受到丰度低和高级结构的影响，因此效果也不是很理想。而利用同 位素或生物素标记探针对基因组文库进行杂交筛选的方法，则更是费时费力，是研究者在 不得已的情况下的最后选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确、pUCm-T载 体介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其5'端侧翼未知DNA序列。本发明的技术方案①选用限制性内切酶双酶切基因组DNA ；②纯化的酶切产物 用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3 ‘端加A (Adenine)反应，与pUCm_T载体连接；③利用 引物设计软件选定T载体上的一段特异性序列作为5'端引物、两条靠近未知序列端的已 知DNA序列上的互补序列作为3'端引物；④以pUCm-T载体连接物为模板，用设计的引物 进行二轮的PCR(巢式PCR)扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。具体步骤如下(I)PCR引物的设计根据已知DNA序列设计两条3'端特异性引物，命名为 Primer-Rl和Primer_R2 (18_22bp) ；Primer-R2的3'端距待测序列要保留30bp以上长度， 比ft~imer-Rl接近待测的未知序列(图1和图4)；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/ A克隆位点的上游选定一条5'端特异性引物Olbp，Tm值60°C )，命名为T-PrimerF (图 2和图5)。(2)限制性内切酶的选择分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从 I^imer-Rl到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种限制性内切酶。本发明可供选择常 用的产生 5'粘性末端的内切酶有 EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、Xba I 和Xho I等；产生平齐末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等；产生3'粘性末端的有tot I、Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等。(3)PCR模板的构建运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行双酶切， 纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3'端加A反应，与pUCm-T载体连接，即 可作为PCR模板。此步骤若选用的两种内切酶都是5'粘性或平齐末端，只需选用普通Taq 酶；否则需要选用带有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶。(4)巢式PCR扩增以步骤(3)的T载体连接物为模板，用T-PrimerF和I^rimer-Rl 为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用T-PrimerF和ft~imer-R2为 引物进行第二轮PCR扩增。将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根 据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。本发明的优点本发明使用特异性引物进行巢式PCR扩增，可以确定出已知DNA序列5'端侧翼的 未知序列。它与现行的方法相比，具有如下的优点1、操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行 繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。2、应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，pUCm-T载体介导的PCR扩增可应 用于各种不同基因的5'端侧翼未知序列的测定。3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，而且可供选择的限 制性内切酶较多。4、引物特异性强。本发明通过利用T载体介导的PCR方法，把随机引物的扩增转 变成特异性引物的扩增，大幅度提高了 PCR扩增的特异性和效率。5、结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段， 具有简捷、准确和实用性强等特点。6、未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取 未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而影响。7、成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，所以无需昂贵的仪器和试剂盒。
图1 5 ‘粘性末端的PCR模板构建图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因组DNA经产生5‘粘性末端的限制性 内切酶双酶切后，用Taq酶补齐和3'端加A反应，与pUCm_T载体连接构建PCR模板。图2 引物T-PrimerF、Cell2A-Rl和Cell2A_R2在5，粘性末端的PCR模板上的位
置图3:宇佐美曲霉EOOl第12家族葡聚糖酶基因(cell2A)5'端侧翼的测序结果图4:3'粘性和平齐末端的PCR模板构建图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii) EOOl基因组DNA经产生3'粘性和平齐末端的限制性内切酶双酶切后，用Ex Taq酶补齐和 3'端加A反应，与pUCm-T载体连接构建PCR模板。图5 引物T-PrimerF、Cel5A_Rl和Cel5A_R2在3，粘性末端的PCR模板上的位置图6:宇佐美曲霉EOOl第5家族葡聚糖酶基因(cel5A)5'端侧翼的测序结果
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cell2A启动子序列的测定。(I)DNA酶切产物的制备选用Hind III和Xba I对宇佐美曲霉基因组DNA进行双 酶切。构建如下双酶切体系10XM Buffer 2 μ 1, Hind III 1μ l,Xba I Ιμ ，基因组DNA 10μ 1，无菌水6μ 1 ；将上述体系在37°C水浴中反应4h。纯化回收双酶切产物并溶于20 μ 1 无菌水中。(2)酶切产物的补齐和3'端加A反应双酶切产物20μ1，10XPCR Buffer 2. 5 μ l，dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，无菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反应 IOmin0 目的产物命名为 cell2AP。(3)cell2AP 与 pUCm-T 的连接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-Tl μ 1，Τ4 DNALigase 1μ 1，cell2AP 6 μ 1 ； 16°C连接过夜。目的产物命名为 pUCm-T-cell2AP。(4)cell2A 启动子第一轮 PCR 扩增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1， pUCm-T-cel 12ΑΡ 5 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cel 12A-R1 1 μ 1，无菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cell2AP-0uto(5)cell2A 启动子第二轮 PCR 扩增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1， cell2AP-0ut 1 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_R2 1 μ 1，无菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cell2AP-In。(6)cell2AP-In的克隆和测序将cell2AP_h按照割胶回收试剂盒说明书上的操 作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图3所示。实施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cel5A启动子序列的测定。(I)DNA双酶切产物的制备选用EcoR V和I3St I对宇佐美曲霉基因组DNA进行 双酶切。构建如下酶切体系10 X H Buffer 2 μ 1, EcoR V 1μ 1, Pst I 1 μ 1，基因组DNA 10 μ 1，无菌水6 μ 1 ；将该体系在37°C水浴中反应4h。纯化回收双酶切产物并溶于20μ 1无 菌水中。(2)酶切产物的补齐和3'端加A反应双酶切产物20μ1，IOXEx Taq Buffer 2. 5 μ l，dNTP0. 5μ l，Ex Taq 酶 0· 25 μ 1，无菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反应 IOmin0 目的产物命名 为 cel5AP。(3)cel5AP 与 pUCm-T 的连接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-ΤΙμ 1，T4 DNALigase 1μ 1, cel5AP 6 μ 1 ;16°C连接过夜。目的产物命名为 pUCm-T-cel5AP。(4)cel5A 启动子第一轮 PCR 扩增10 X PCRBuffer 5 μ 1，dNTP 3μ 1, pUCm-T-cel5ΑΡ 5 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cel5A_Rl 1 μ 1，无菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5 μ 1 ；940C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cel5AP-0uto(5)cel5A 启动子第二轮 PCR 扩增10 X PCR Buffer 5 μ l，dNTP 3 μ l，cel5AP_0ut 1 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1, Cel5A-R2 1 μ 1，无菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ;94°C 4min，30 个 循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cel5AP_In。(6) cel5AP-In的克隆及测序将Cel5AP_h按照割胶回收试剂盒说明书的操作步 骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图6所示。
权利要求
1.一种pUCm-T载体介导的PCR扩增已知DNA序列5'端侧翼未知序列的方法，其特征 在于选用限制性内切酶酶切基因组DNA ；纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶补齐和3' 端加A，与pUCm-T连接；利用引物设计软件选定T载体T/A克隆位点上游的一段序列作为 5'端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3'端引物；以pUCm-T 连接物为模板，用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5'端侧翼的未知序 列；(1)PCR引物的设计基于已知DNA序列设计两条3'端特异性引物，命名为I^rimer-Rl 和ft~imer-R2 (18_22bp) ；Primer-R2的3 ‘端距待测序列要保留30bp以上长度，它比 Primer-Rl接近待测的未知序列；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/A克隆位点的上 游选定一条5'端特异性引物，命名为T-PrimerF (2lbp, Tm值60°C )；(2)限制性内切酶的选择根据对已知DNA序列上限制性内切酶位点的分析，选用从 Primer-Rl到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种内切酶；本发明可供选择的常用的 产生5'粘性末端的限制性内切酶有EcoR I、Hind III、Bgl II, Sal I、BamH I、Nco I、 Xba I和Bio I等；产生平齐末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等；产生3'粘性末端的有 Bmt I ,Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等；(3)PCR模板的构建运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行酶切，纯化的 酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3'端加A反应，与pUCm-T载体连接，即可作为 PCR模板；此步骤若选用的两种内切酶都是5'粘性或平齐末端，只需选用普通Taq酶，否则 需要选用带有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶；(4)巢式PCR扩增以步骤(3)的T载体连接物为模板，采用T-PrimerF和I^rimer-Rl 为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用T-PrimerF和ft~imer-R2 为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根 据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下(1)按如下的体系和条件双酶切宇佐美曲霉EOOl基因组DNA(以Hind III和)(ba I为代 表)10XM Buffer 2 μ 1，Hind III 1 μ 1, Xba I 1 μ 1，基因组 DNA 10 μ 1，无菌水 6 μ 1 ；将 该体系在37°C水浴中反应4h ；纯化回收双酶切产物并溶于20 μ 1无菌水中；(2)按如下的体系和条件对酶切产物进行补齐和3'端加Α(以宇佐美曲霉EOOl的 cell2A 基因为代表)酶切产物 20μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，无菌水1. 75 μ 1 ；72°C反应IOmin ；目的产物命名为cell2AP ；(3)按如下的体系和条件连接cell2AP 与 pUCm-T :50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1，pUCm-T 载体 1 μ 1，T4 DNA Ligase 1μ l,cell2AP 6yl;16°C 连接过 夜；目的产物命名为pUCm-T-Cell2AP ；(4)按如下的PCR体系和条件进行第一轮的PCR扩增10XPCRBuffer 5 μ 1, dNTP 3 μ 1, pUCm-T-cell2AP 5 μ 1, T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_Rl 1 μ 1，无菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 ；94 °C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin;首轮 PCR 产物命名为cell2AP-0ut ；按如下的体系和条件进行第二轮的PCR扩增10XPCR Buffer 5 μ 1，dNTP 3 μ 1，cell2AP-0ut 1 μ 1，T-PrimerF 1 μ 1，Cell2A_R21 μ 1，无菌水 38. 5 μ 1， Taq 酶 0. 5μ 1 ;94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；第二轮PCR产物命名为cell2AP-In。
全文摘要
本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、pUCm-T载体和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列确定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过选用限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体上T/A克隆位点上游的一段序列作为5′端引物，选定两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以pUCm-T载体连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。
文档编号C12Q1/68GK102140500SQ20101055084
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者唐存多, 张慧敏, 李剑芳, 谭中标, 邬敏辰, 陈伟, 高金湖 申请人:江南大学