专利名称：一种t载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，是一种利用限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、pUCm-T 载体连接和巢式 PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩 增等技术，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列确定其3'端侧翼未知DNA序 列的方法。
背景技术：
随着生物工程技术的发展，越来越多的功能性蛋白质逐步地被报道出来。为了使 功能性蛋白质实现高水平表达以便于后期的分离纯化和工业化生产，人们开始研究它们的 基因序列和异源表达，从而推动基因组学的发展。但现在报道的许多新基因仅获取了部分 DNA序列，而不了解某个基因完整的DNA序列时，就无法深入研究其结构和功能，因此需要 从它的部分已知DNA序列获得完整序列。随机测序法是通过大量的随机测定DNA序列，借 助计算机进行排序的方法来获取所需要的DNA序列，而该方法存在很大的偶然性，通常会 耗费很大的人力和物力。3'-和 5' -RACE(3‘ and 5' Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情况下，获取目的基因完整的mRNA序列，但不能确定基 因的上下游调控元件序列。另外，RACE法较繁琐，mRNA又极其不稳定，反转录还特别容易受 到丰度低和高级结构的影响，因此效果也不是很理想。利用同位素或生物素标记探针对基 因组文库进行杂交筛选的方法，更是费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确、pUCm-T载 体介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其3'端侧翼未知DNA序列。本发明的内容包括①选用限制性内切酶双酶切基因组DNA ；②纯化的酶切产物 用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3 ‘端加A (Adenine)反应，与pUCm_T载体连接；③利用 引物设计软件选定T载体上的一段特异性互补序列作为3'端引物、两条靠近未知序列端 的已知DNA序列上的序列作为5'端引物；④以pUCm-T载体连接物为模板，用设计的引物 进行二轮的PCR(巢式PCR)扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。具体步骤如下(I)PCR引物的设计根据已知DNA序列设计两条5'端特异性引物，命名为 Primer-Fl和Primer_F2 (18_22bp) ；Primer_F2的3'端距待测序列要保留30bp以上长度， 比ft~imer-Fl接近待测的未知序列(图1和图4)；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/ A克隆位点的下游选定一条3'端特异性引物OObp，Tm值58°C )，命名为T-PrimerR(图 2和图5)。(2)限制性内切酶的选择分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从 I^imer-Fl到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种限制性内切酶。本发明可供选择常 用的产生 5'粘性末端的内切酶有 EcoR I ,Hind IILBgl IKSal I ,BamH I、Nco I、Xba I 和Xho I等；产生平齐末端的有EcoR V、SnaB I和^^ I等；产生3'粘性末端的有tot I、Pst I , Sac I 禾口 Kpn I 等。(3)PCR模板的构建运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行双酶切，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3'端加A反应，与pUCm-T载体连接，即 可作为PCR模板。此步骤若选用的两种内切酶都是5'粘性或平齐末端，只需选用普通Taq 酶；否则需要选用带有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶。(4)巢式PCR扩增以步骤(3)的pUCm-T连接物为模板，采用Primer-Fl和 T-PrimerR为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用Primer-F2和 T-PrimerR为引物进行第二轮PCR扩增。将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测，根据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。本发明的优点本发明使用特异性引物进行巢式PCR扩增，可以确定出已知DNA序列3'端侧翼的 未知序列。它与现行的方法相比，具有如下的优点1、操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行 繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。2、应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，pUCm-T载体介导的PCR扩增可应 用于各种不同基因的3'端侧翼未知序列的测定。3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足够操作，而且可供选择的限 制性内切酶较多。4、引物特异性强。本发明通过利用T载体介导的PCR方法，把随机引物的扩增转 变成特异性引物的扩增，大幅度提高了 PCR扩增的特异性和效率。5、结果验证简捷。巢式PCR扩增可快速验证其扩增的产物是否为目标DNA片段， 具有简捷、准确和实用性强等特点。6、未知序列长度不限。由于基因组DNA的酶切位点是随机分布的，本发明可获取 未知序列长达几Kb的片段，而且序列的准确性和真实性不会因长度的增加而影响。7、成本低廉。本发明的核心还是简单的PCR扩增，所以无需昂贵的仪器和试剂盒。
图1 3 ‘和5 ‘粘性末端的PCR模板构建图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因组DNA经产生3'和5'粘性末端的 限制性内切酶双酶切后，用Ex Taq酶补齐和3'端加A反应，与pUCm_T载体连接构建PCR 模板。图2 引物Cel5A-Fl、Cel5A-F2和Τ-PrimerR在3，和5'粘性末端的PCR模板上 的位置图3:宇佐美曲霉EOOl第5家族葡聚糖酶基因(cel5A)3'端侧翼的测序结果图4:5'粘性末端的PCR模板构建图宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl基因组DNA经产生5‘粘性末端的限制性 内切酶双酶切后，用Taq酶补齐和3'端加A反应，与pUCm_T载体连接构建PCR模板。图5 引物Cell2A-Fl、Cell2A-F2和Τ-PrimerR在5，粘性末端的PCR模板上的位
置
图6:宇佐美 曲霉EOOl第12家族葡聚糖酶基因(cell2A)3'端侧翼的测序结果
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cel5A 3'端侧翼序列的测定。(I)DNA双酶切产物的制备选用Pst I和Bgl II对宇佐美曲霉基因组DNA进行双 酶切。构建如下双酶切体系10XH Buffer 2 μ 1，Pst I 1 μ 1，Bgl II 1 μ 1，基因组DNA 10 μ 1，无菌水6 μ 1 ；将该体系在37°C水浴中反应4h后。纯化回收双酶切产物并溶于20 μ 1 无菌水中。(2)酶切产物的补齐和3'端加A反应双酶切产物20μ1，IOXEx Taq Buffer 2. 5 μ l，dNTP0. 5μ l，Ex Taq 酶 0· 25 μ 1，无菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反应 IOmin0 目的产物命名 为 cel5A3UT。(3)。615八3肌与口肌111-11的连接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1μ 1，pUCm-T 1μ 1，T4 DNA Ligase 1μ 1，cel5A3UT 6 μ 1 ； 16°C连接过夜。目的产物命名 为 pUCm-T-cel5A3UT。(4)cel5A 3 ‘端侧翼第一轮 PCR: 10 X PCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1, pUCm-T-cel5A3UT 5 μ 1，Cel5A_Fl 1 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，无菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cel5A3UT-0uto(5)cel5A 3 ‘端侧翼第二 轮 PCR: 10 X PCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1, cel5A3UT-0ut 1 μ 1，Cel5A_F21 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，无菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0· 5 μ 1 ； 94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cel5A3UT-In。(6) cel5A3UT-In的克隆及测序将cel5A3UT-In按照割胶回收试剂盒说明书的操 作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图3所示。实施例2宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 cell2A 3'端侧翼序列的测定。(I)DNA酶切产物的制备选用Sal I和BamH I对宇佐美曲霉基因组DNA进行双酶 切。构建如下酶切体系10XT Buffer 3 μ 1，Sal I 1μ l,BamH I 1 μ 1，基因组DNAlO μ 1， 无菌水5 μ 1 ；将该体系在37°C水浴中反应4h。纯化回收双酶切产物并溶于20 μ 1无菌水中。(2)酶切产物的补齐和3'端加A反应双酶切产物20μ1，10XPCR Buffer 2. 5 μ l，dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，无菌水 1. 75 μ 1 ；72°C反应 IOmin0 目的产物命名为 cell2A3UT。(3)。6112六3肌与口。011-11的连接50% PEG4000 1 μ 1,10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer 1 μ 1，pUCm-T 1μ1，Τ4 DNA Ligase 1 μ 1，cell2A3UT 6 μ 1 ; 16°C连接过夜。目的产物命名 为 pUCm-T-cell2A3UT。
(4)cell2A 3 ‘端侧 翼第一轮 PCR: 10XPCR Buffer 5μ 1, dNTP 3μ 1, pUCm-T-cell2A3UT5y 1，Cell2A_Fl 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1,无菌水 34. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 -M0C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C lOmin。目的产物命 名为 cell2A3UT-0ut。(5)cell2A 3 ‘端侧翼第二 轮 PCR:10XPCR Buffer 5μ 1, dNTP 3μ 1, eel 12A3UT-0ut 1 μ 1，Cel 12A-F2 1 μ 1，T-PrimerR 1 μ 1，无菌水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5 μ 1 ； 940C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 目的产物命名为 cell2A3UT-In。(6)cell2A3UT-In的克隆和测序将cell2A3UT-In按照割胶回收试剂盒说明书上 的操作步骤进行割胶回收，将纯化的产物克隆到PUCm-T载体上进行测序，结果如图6所示。
权利要求
1.一种PUCm-T载体介导的PCR扩增已知DNA序列3'端侧翼未知序列的方法，其特征 在于对基因组DNA用限制性内切酶进行双酶切；纯化的酶切产物采用Taq酶或Ex Taq酶 补齐和3'端加A，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体T/A克隆位点下游的 一段序列的互补序列作为3'端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA上的两段序列作为 5'端引物；以pUCm-T载体连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增；(1)PCR引物的设计根据已知DNA序列设计两条5'端特异性引物，命名为I^rimer-Fl 和Primer-F2 (18_22bp) ；Primer-F2的3 ‘端距待测序列要保留30bp以上长度，它比 Primer-Fl接近待测的未知序列；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/A克隆位点的下 游选定一条3'端特异性引物，命名为T-PrimerR(20bp, Tm值58°C )；(2)限制性内切酶的选择根据对已知DNA序列上限制性内切酶位点的分析，选用从 Primer-Fl到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种内切酶；本发明可供选择的常用的 产生5'粘性末端的限制性内切酶有EcoR I、Hind III、Bgl II, Sal I、BamH I、Nco I、 Xba I和Bio I等，产生平齐末端的有EcoR V、SnaB I和ka I等，产生3'粘性末端的有 Bmt I ,Pst I、Sac I 禾口 Kpn I 等；(3)PCR模板的构建运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行酶切，纯化的 酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3'端加A反应，与pUCm-T载体连接，即可作为 PCR模板；此步骤若选用的两种内切酶都是5'粘性或平齐末端，只需选用普通Taq酶，否则 需要选用带有3' -5'外切酶活性的Ex Taq酶；(4)巢式PCR扩增以步骤(3)的pUCm-T连接物为模板，采用I^rimer-Fl和T-PrimerR 为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用ft~imer-F2和T-PrimerR 为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根 据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。
2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下(1)按如下的体系和条件双酶切宇佐美曲霉EOOl基因组DNA(以Ml I和BamH I为代 表)10XT Buffer 3μ 1，Sal I 1 μ 1，BamH I 1 μ 1，基因组 DNA 10 μ 1，无菌水 5 μ 1 ；将 该体系在37°C水浴中反应4h ；纯化回收双酶切产物并溶于20 μ 1无菌水中；(2)按如下的体系和条件对酶切产物进行补齐和3'端加Α(以宇佐美曲霉EOOl的 cell2A 基因为代表)酶切产物 20μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1, dNTP 0. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，无菌水1. 75 μ 1 ；72°C反应IOmin ；目的产物命名为cell2A3UT ；(3)按如下的体系和条件连接cell2A3UT与pUCm-T:50 % PEG40001 y 1, 10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1, pUCm-T 1 μ 1, T4 DNA Ligase 1 μ 1，cell2A3UT 6μ 1 ； 16°C连接过夜；目的产物命名为pUCm-T-ce112A3UT ；(4)按如下的PCR体系和条件进行第一轮的PCR扩增10XPCRBuffer 5 μ 1, dNTP 3 μ 1, pUCm-T-cell2A3UT 5 μ 1，Cell2A_Fl 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1,水 34.5 μ 1，Taq 酶 0. 5μ 1 -M0C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；首轮 PCR 产 物命名为Cell2A3UT-0ut ；按如下的体系和条件进行第二轮的PCR扩增10XPCR Buffer 5 μ 1, dNTP 3μ 1，cell2A3UT-0utlμ 1，Cell2A-F2 1 μ 1, T-PrimerR 1 μ 1，水 38. 5 μ 1，Taq 酶 0. 5yl;94°C 4min，30 个循环(94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin)，72°C IOmin ；第二轮 PCR 产物命名为 cell2A3UT-In。
全文摘要
本发明是一种利用限制性内切酶酶切、pUCm-T载体和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列确定其3′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过选用限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体上T/A克隆位点下游的一段序列作为3′端引物；选定两条靠近未知序列端的已知DNA上的序列作为5′端引物。以pUCm-T载体连接物为模板，用设计的引物进行巢式PCR扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。
文档编号C12Q1/68GK102140501SQ20101055086
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者史红玲, 吴静, 李剑芳, 汪俊卿, 谭中标, 邬敏辰, 高金湖 申请人:江南大学