猪博卡病毒1型、2型和3型多重pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法。多重PCR方法引物包括PBoV1引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对。该方法利用不同引物对扩增出不同大小的病毒核酸片段来达到鉴别诊断的目的。本发明可同时检测并区分PBoV1、PBoV2和PBoV3，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。
【专利说明】猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明专利属于动物病原微生物检测【技术领域】，具体的说是一种同时鉴别三种不 同猪博卡病毒的多重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV)自2009年被首次发现以来，证实存在序 列同源性较低的三种基因型（Jiang YH et al，2014，J Gen Virol，95:453-465)，被疑为猪 圆环病毒相关性疾病、"猪腹泻病"的重要病原，并在这类病的发生发展上起重要作用，已成 为世界各国科研人员的研究热点。
[0003] 猪博卡病毒1型（PBoVl)发现于瑞典患仔猪多系统衰竭综合征的猪体中，其基因 组大小约为4786bp (GenBank Number :HQ223038)，核苷酸序列水平上与犬博卡病毒、牛细 小病毒、大猩猩博卡病毒和人博卡病毒的同源性分别为52-55%、44-45%、50%和44-48% (Blomstrom AL et al.，2009, Virus Res，146 (1-2) :125-129)。基因组结构编码 3 个主 要的开放阅读框（Open reading frames, ORF) ,ORFl和0RF3编码非结构蛋白（NS1和NP1)， 0RF2 编码结构蛋白（VPl/2)(Zeng S et al.，2011，J Gen Virol，92(Pt 4) :784-788)。
[0004] 猪博卡病毒2型（PB〇V2)亦是利用病毒的宏基因组研究方法之一非序列依赖的单 一引物核酸扩增技术（Sequence-independent single primer amplification，SISPA)由 中国科研人员发现于中国健康猪群的粪便中，而在该基因型中仍有不同的基因亚群，它们 的基因组大小分别约为 5173bp 和 5186bp (GenBank Number :HM053693-GU053694)，核苷酸 序列同源性为93. 6%-94. 2%。与其他博卡病毒属一样也有3个主要的ORF(Cheng WX，et al. ，2010,PLoS One，5(10) :el3583)。
[0005] 此外，在发现PBoV2的同时，在样品6V和7V中还发现了不同于PBoV2的DNA片 段（2407bp 和 2434bp) (GenBank Number :HM053672-HM053673)，其包括部分非结构蛋白基 因和完整的VPl基因，故把6V和7V命名为猪博卡病毒3型（PB〇V3)。之后的研究中，北爱 尔兰研究人员又报道两种PBoV，其基因组大小为5082bp (GenBank Number JF512472)和 4125bp(GenBank Number JF512473)，进化树分析其也与 6V 和 7V 同源性高（McKillen J et al.，2011，Vet Microbiol，152(1-2) :39-45)。香港的科学人员也发现两种PBoV，其基因组 大小为 5278bp 和 5177bp (GenBank Number : JF429834-JF429836)，进化树分析其与 6V 和 7V 同源性高（Lau SK et al.，2011，J Gen Virol，92 (Pt 9) :2047-2059)。
[0006] 目前，猪场中猪博卡病毒混合感染严重。现有文献表明，由于病原研究基础较薄 弱和体外病毒分离培养等难度，其检测方法主要有单纯PCR(Zhai S et al.，2010, Arch Virol, 155(8) :1313-1317)、荧光 PCR(Li B et al.，J Virol Methods. 179(2) :390-395)、 双重PCR(蔡雨函等，2013,中国兽医科学，43(8) :833-838)等，存在着费时费力、不能同时 鉴别三种病毒等缺点。
【发明内容】
[0007] 本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对 及反应体系优化，构建三种猪博卡病毒多重PCR检测方法，实现猪博卡病毒"一样三检"的 快速检测效果。该方法为猪博卡病毒诊断提供一种快速检测方法，填补三种猪博卡病毒诊 断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持 与帮助。
[0008] 本发明专利要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
[0009] 本发明涉及的检测引物有3对，分别是PBoVl引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物 对，其中用于PBoV1检测的I3BoV1引物对包括PBoVI-F和PBoVI-R两条引物，用于PBoV2检 测的PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及用于PBoV3检测的PBoV3引物对 包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物。
[0010] 本发明的特征还涉及到以下步骤。
[0011] 配置 50i! L PCR 反应体系：2XBuffer 25i! L，PBoVl-F、PBoVl-R、PBOV2-F、 PBoV2-R、PBoV3-F 和 PBoV3-R 各 0? 5 ii L，PBoVl、PBoV2 及 PBoV3 模板分别 3 ii L，灭菌 H2O 13 u L0
[0012] PCR反应程序：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共计 35个循环；72°C再延伸IOmin ;
[0013] 结果观察：取l〇y L PCR产物进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下 观察结果。
[0014] 进一步的，本发明建立的方法，其特征在于包括了本发明所述的引物。
[0015] 更进一步的，本发明所述的引物用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型。
[0016] 所述的步骤用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型的单一感染或混合感染。
[0017] 本发明所述的应用或者检测方法不仅仅用于临床的疾病诊断和检测，还可以应用 于畜牧业、食品安全、生物制药、生物模型构建等多种非疾病诊断和治疗的领域。
[0018] 本发明公开了同时鉴别检测猪博卡病毒1型、2型和3型的多重PCR方法，具有特 异性强、敏感性高、省时省力等优点。该方法为猪博卡病毒的诊断提供一种快速检测方法， 填补三种猪博卡病毒诊断方法的空白，为猪博卡病毒不同基因型的诊断、调查、防控及净化 提供一定的技术支持与帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是多重PCR扩增结果；M :DNA Marker 2000 ;1 :阴性对照；2 :PBoVl阳性质粒； 3 :PBoV2阳性质粒；4 :PBoV3阳性质粒；5 :PBoVl+PBoV2+PBoV3阳性质粒；
[0020] 图2是多重PCR特异性试验结果；M :DNA Marker 2000 ;1 :阴性对照；2 :PBoVl阳 性质粒；3 :PBoV2阳性质粒；4 :PBoV3阳性质粒；5 :PBoVl+PBoV2+PBoV3阳性质粒；6 :猪圆 环病毒2型阳性DNA ;7 :犬博卡病毒阳性DNA ;8 :猫博卡病毒阳性DNA ;
[0021] 图3多重PCR敏感性结果；M :DNA Marker 2000 ; 1-8 : IOci-KT7质粒倍比稀释。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
[0023] 优化实施例：
[0024] 1材料和方法
[0025] I. 1猪博卡病毒1型、2型和3型阳性重组质粒，猪圆环病毒2型毒株由广东省农 业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，猪博卡病毒3型、犬博卡病毒、猫博卡病毒毒株 由香港大学刘嘉佩教授馈赠。
[0026] 1. 2主要试剂
[0027] DNA提取试剂盒、PCR试剂购自北京天根公司，DNA Marker 2000购自Takara公 司。
[0028] 1.3引物设计
[0029] 分别根据最新文献及GenBank中猪博卡病毒1型、2型、3型的序列，设计三对引 物。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表1。
[0030] 表1多重PCR引物序列
[0031]
【权利要求】
1. 一种用于检测猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR的引物组合物，其特征在于：所 述引物组合物包括PBoVl引物对、PBoV2引物对及PBoV3引物对，其中PBoVl引物对包括 PBoVl-F和PBoVl-R两条引物，PBoV2引物对包括PBoV2-F和PBoV2-R两条引物以及PBoV3 引物对包括PBoV3-F和PBoV3-R两条引物。
2. 如权利要求1所述的引物组合物，所述的引物具体为： PBoVl-F ：TCAATGGTACGTGCCGATAT SEQ ID NO. 1 PBoVl-R ：TTATTCTGCTTCGCCTGGTT SEQ ID NO. 2 PBoV2-F ：GAGGTATTCAGCCAGCACAT SEQ ID NO. 3 PBoV2-R ：AGYTCCTGCGGTTCTGTTTC SEQ ID NO. 4 PBoV3-F ：TYTTGAACATCCAGGGCTAC SEQ ID NO. 5 PBoV3-R:CCATACACCTTBACCGCVTK SEQ ID NO. 6。
3. 如权利要求1或2所述的引物组合物的应用，所述应用为猪博卡病毒1型、2型和3 型多重PCR检测。
4. 如权利要求3的应用，所述应用具体为包括以下步骤：配置50 iiLPCR反应体系： 2XBuffer 25 ii L，PBoVl-F、PBoVl-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F 和 PBoV3-R 各 0? 5 ii L， PBoVl、PBoV2 及 PBoV3 模板分别 3 ii L，灭菌 H2013 ii L ; 其中，PBoVl-F和PBoVl-R用于猪博卡病毒1型的检测，PBoV2-F和PBoV2-R用于猪博 卡病毒2型的检测，PBoV3-F和PBoV3-R用于猪博卡病毒3型的检测； PCR反应程序：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共计35 个循环；72°C再延伸lOmin ; 结果观察：取10 U L PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察 结果。
5. -种猪博卡病毒1型、2型和3型多重PCR检测方法，其特征在于包括权利1或2所 述的引物组合物。
6. 如权利要求6所述的检测方法，所述方法为：配置50 ii L PCR反应体系：2X Buffer 25 ii L，PBoVl-F、PBoVl-R、PBoV2-F、PBoV2-R、PBoV3-F 和 PBoV3-R 各 0? 5 ii L，PBoVl、PBoV2 及PBoV3模板分别3 ii L，灭菌H20 13 ii L ; 其中，PBoVl-F和PBoVl-R用于猪博卡病毒1型的检测，PBoV2-F和PBoV2-R用于猪博 卡病毒2型的检测，PBoV3-F和PBoV3-R用于猪博卡病毒3型的检测； PCR反应程序：95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共计35 个循环；72°C再延伸lOmin ; 结果观察：取10 U L PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察 结果。
【文档编号】C12R1/93GK104450969SQ201410801967
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】翟少伦, 李小鹏, 魏文康, 陈琴苓, 吕殿红, 吴大成, 温肖会 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所