两类羊病原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法与流程

本发明涉及两类羊病原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法，属于预防兽医学领域。

背景技术：

随着羊现代化养殖规模的提升，羊的疾病也日益增多，且由单一病原引发的疾病越来越少，逐渐呈现出多元化混合感染的趋势；每年给养羊户造成的经济损失上百亿元，福建省仅羊口疮和羊支原体性肺炎造成的经济损失就达2亿元以上。

羊口疮（contagious ecthyma），是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人畜共患病。该病的发病率为4%-100%，死亡率为1%-59%。多种支原体可感染山羊而引起胸膜肺炎性疾病，特别是丝状支原体簇（Mycoplasma mycoides cluster，Mm cluster) 的成员，包括山羊支原体、丝状支原体和李奇氏支原体亚群，其中山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种均可感染羊而引起胸膜肺炎性疾病。山羊传染性胸膜肺炎对山羊养殖业的危害尤为严重，新传入地区严重爆发时发病率为80-100％，死亡率高达60～80％。

当前羊病主要以混合感染为主，仅采用一种PCR进行检测不能全面掌握病原种类，从而无法正确指导临床用药和疫苗免疫，而采用两种PCR技术进行检测则相对费时、费力，也不利于流行病学的大规模调查。近年来关于Mm cluster成员引起的羊支原体性肺炎和羊口疮混合感染的报道屡见不鲜，然所使用的检测方法均为单重PCR，未见有双重PCR同时鉴定此二病的报道。

当前羊病的单重PCR扩增技术已相对成熟，然多重PCR方法研究相对滞后，文献报道较少，商品化检测试剂盒几乎没有。因此，根据PCR扩增技术，建立一种快速鉴别羊口疮病毒和丝状支原体簇的双重PCR检测方法，可为混合感染病原快速、准确诊断及大规模流行病学调查提供有效方法，省时省力省钱，对疫情的控制具有重要意义。

技术实现要素：

由于羊口疮病毒以及丝状支原体簇中的丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种可同时感染养殖羊，常规使用的单重PCR检测方法相对费时、费力，不利于检测工作的高效开展。基于需快速、准确诊断混合感染病原的需要，本发明提供一种快速、特异、敏感的检测羊口疮病毒和丝状支原体簇的专用引物及双重PCR方法。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了两类羊病原体双重PCR专用引物，其核苷酸序列为：

（1）羊口疮病毒专用引物ORFVB2L：

ORFVB2L 1：5’- ATCGAGAACGCCAAGAACAGCATCG-3’，

ORFVB2L 2：5’- TGTCGTCCACGATGAGCAGCTTAGT-3’；

（2）丝状支原体簇专用引物Mm-cluster：

Mm-cluster 1：5’-TGAGATGGGGATGCGGCGTATT-3’，

Mm-cluster 2：5’-TGGGAAGCGCTCTCCAAATGGT-3’。

所述羊口疮病毒专用引物ORFVB2L的扩增产物大小为304bp，所述丝状支原体簇专用引物Mm-cluster的扩增产物大小为1232bp。

本发明还提供了利用上述两类羊病原体双重PCR专用引物进行双重PCR检测的方法，包括以下步骤：

（1）待测样品组织DNA的提取；

（2）将引物对ORFVB2L及Mm-cluster分别配置成浓度为20μM的溶液；

（3）以待测样品DNA为模板进行双重PCR：

PCR反应体系为：Premix TaqTM聚合酶10.0μL，引物ORFVB2L 1和ORFVB2L 2各1.1μL、引物Mm-cluster 1和Mm-cluster 2各0.5μL，模板2.0μL、无菌去离子水补足至20.0μL；

PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30sec, 59℃退火15sec, 72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸7min；

（4）扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断：PCR反应终止后，取7μL PCR产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到304bp大小产物则判定为检测出羊口疮病毒核酸，扩增得到1232bp大小产物则判定为检测出丝状支原体簇核酸。

本发明根据羊口疮病毒B2L基因和丝状支原体簇16S rRNA基因序列，设计两对可特异性扩增B2L基因和16S rRNA基因的专用引物，建立了羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR检测方法。克服了当前仅采用一种PCR进行检测不能全面掌握病原种类，从而无法正确指导临床用药和疫苗免疫的不足。建立了一种快速鉴别羊口疮病毒和丝状支原体簇的双重PCR检测方法，可为混合感染病原快速、准确诊断及大规模流行病学调查提供有效方法，省时省力省钱，对疫情的控制具有重要意义。

附图说明

图1专用引物ORFVB2L对羊口疮病毒PCR扩增产物电泳图。图中，M为Marker，泳道1为羊口疮病毒目标片段，泳道2为丝状支原体山羊亚种、泳道3为山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道4为绵羊肺炎支原体、泳道5为猪肺炎支原体、泳道6为大肠杆菌、泳道7为金黄色葡萄球菌、泳道8为沙门氏菌、泳道9为巴氏杆菌和泳道10阴性对照。

图2 专用引物Mm-cluster对丝状支原体簇PCR扩增产物电泳图。图中，M为Marker，泳道1和泳道2分别为丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种即目标片段，泳道3羊口疮病毒、泳道4绵羊肺炎支原体、泳道5猪肺炎支原体、泳道6大肠杆菌、泳道7沙门氏菌、泳道8金黄色葡萄球菌、泳道9巴氏杆菌和泳道10阴性对照。

图3双重PCR法检测羊口疮病毒和丝状支原体簇结果电泳图。M为Marker，泳道1为羊口疮病毒和丝状支原体山羊亚种的混合模板，泳道2为羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种的混合模板，泳道4 为羊口疮病毒模板，泳道6和泳道7分别为丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种模板；泳道3、5、8为阴性对照。

图4 双重PCR敏感性试验结果电泳图。图中：M为Marker，1-7泳道模板浓度分别为10-1-10-7。

图5 双重PCR 重复性试验结果电泳图。M为Marker，泳道1为羊口疮病毒和丝状支原体簇混合模板，泳道2至泳道4为羊口疮病毒，泳道5和泳道6为丝状支原体山羊亚种，泳道7为山羊支原体山羊肺炎亚种，泳道8至泳道11分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌阴性对照和空白对照。

具体实施方式

实施例1

以下结合实施例对本发明作进一步阐述，便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。

以下实施例对羊口疮病毒和丝状支原体簇用单重PCR及双重PCR方法进行阐述。

实施例1

快速检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L 的设计及其对羊口疮病毒的检测。.

(1) 检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L的设计与合成

检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L是根据羊口疮病毒基因组中B2L基因片段，用Primer 6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物ORFVB2L，它是由专用上游引物ORFVB2L 1和专用下游引物ORFVB2L 2组成，其序列为：

上游引物ORFVB2L 1：5’- ATCGAGAACGCCAAGAACAGCATCG-3’，

下游引物ORFVB2L 2：5’- TGTCGTCCACGATGAGCAGCTTAGT-3’；

所述的检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L的目标产物片段长度为304bp。

上述检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

(2) 用检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L检测羊口疮病毒的单重方法，按以下步骤进行：

①合成上述步骤(1) 所述的检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L。该专用引物ORFVB2L由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

②羊口疮病毒的单重PCR 反应

以羊口疮病毒的DNA为模板，丝状支原体山羊亚种的DNA、山羊支原体山羊肺炎亚种的DNA、绵羊肺炎支原体的DNA、大肠杆菌的DNA、金黄色葡萄球菌的DNA、巴氏杆菌的NDA、沙门氏菌的DNA、猪肺炎支原体的DNA为阴性对照组，水作为空白对照，按表1 所述单重PCR反应体系进行PCR 扩增，

表1 单重PCR 反应体系

PCR 反应条件为:

94℃预变性2min，从94℃变性30sec, 59℃退火15sec, 72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸7min。

③电泳检测

PCR 反应终止后，取7μL PCR 产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出304bp 左右的片段即为羊口疮病毒，如图1。泳道1为羊口疮病毒目标片段，泳道2为丝状支原体山羊亚种、泳道3为山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道4为绵羊肺炎支原体、泳道5为猪肺炎支原体、泳道6为大肠杆菌、泳道7为金黄色葡萄球菌、泳道8为沙门氏菌、泳道9为巴氏杆菌和泳道10阴性对照均无条带。

④克隆和测序

用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（购于康宁生命科学（吴江）有限公司）纯化PCR 扩增产物，pMD-19T载体（购于TaRaKa公司）连接，并通过大肠杆菌细胞（Escherichia coli）DH5α（ 购于TaRaKa公司）转化，用标准生物学操作程序，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

⑤序列比对

将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 比对分析，与GenBank报道的羊口疮病毒B2L基因（登录号KF703747.1）的一致性为100％。证明本发明检测羊口疮病毒的专用引物ORFVB2L对于羊口疮病毒有良好的特异性。

实施例2

快速检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster的设计及其对丝状支原体簇的PCR检测。

(1) 检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster的设计与合成

检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster是根据丝状支原体丝状支原体簇16S rRNA基因片段，用Primer 6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物Mm-cluster，它是由专用上游引物Mm-cluster 1和专用下游引物Mm-cluster 2组成，其序列为：

Mm-cluster 1：5’-TGAGATGGGGATGCGGCGTATT-3’，

Mm-cluster 2：5’-TGGGAAGCGCTCTCCAAATGGT-3’。

所述的检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster的目标产物片段长度为1232bp。

上述检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

(2) 用检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster检测丝状支原体簇的单重PCR方法，按以下步骤进行：

以丝状支原体山羊亚种PG3和山羊支原体山羊肺炎亚种F38的DNA为模板，以羊口疮病毒（YT2014）的DNA、绵羊肺炎支原体的DNA、大肠杆菌的DNA、金黄色葡萄球菌的DNA、巴氏杆菌的NDA、沙门氏菌的DNA、猪肺炎支原体的DNA为阴性对照组，水作为空白对照，除合成的专用引物和PCR 反应中使用的专用引物是上述检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster外，其余操作步骤及其条件等与实施例1所述步骤(2) 中②至④相同，不再赘述。该PCR反应终止后，取7μL PCR产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增出1232bp 左右的片段即含有丝状支原体簇的核酸。如图2，泳道1和泳道2分别为丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种即目标片段，泳道3羊口疮病毒、泳道4绵羊肺炎支原体、泳道5猪肺炎支原体、泳道6大肠杆菌、泳道7沙门氏菌、泳道8金黄色葡萄球菌、泳道9巴氏杆菌和泳道10阴性对照水均无条带。

将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 比对分析，与GenBank 报道的丝状支原体丝状支原体簇16S rRNA基因（登录号为HM155915.1）的一致性为99.8％。证明本发明检测丝状支原体簇的专用引物Mm-cluster对于丝状支原体簇有良好的特异性。

实施例3

羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR特异性试验

(1) 混合模板样品的PCR 反应。

以羊口疮病毒和丝状支原体簇的混合DNA为模板，以去离子水作阴性对照，各样品模板分别用表2 所述的本发明最优反应体系进行PCR 扩增。

表2 本发明双重PCR最优反应体系

反应条件为：95℃预变性2min；从94℃变性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸10min。

③电泳检测及判断

PCR 反应终止后，分别取7μL PCR产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增得到304bp和1232bp的相应组合片段即可认为对应成功检测出羊口疮病毒核酸和丝状支原体簇核酸。如图3，图中：M为Marker，泳道1为羊口疮病毒和丝状支原体山羊亚种的混合模板，泳道2为羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种的混合模板，泳道4 为羊口疮病毒模板，泳道6和泳道7分别为丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种模板。泳道3、5、8为阴性对照；泳道1中A位置的条带、泳道2中A位置的条带、泳道4中A 位置的条带都为羊口疮病毒的目的条带，目的条带长度为304bp。泳道1中B 位置的条带、泳道2中B 位置的条带、泳道6中B位置的条带、泳道7中B位置的条带都为丝状支原体簇的目的条带，目的条带长度为1232bp。

从图3 可以看出，用本发明中的双重PCR专用引物和双重PCR检测方法能同时检测出羊口疮病毒，丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种的混合样品。

图3 中泳道1和泳道2能够很清楚的看见长度为304bp 和1232bp 的条带，而泳道3的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出羊口疮病毒和丝状支原体簇。证明本专利同时检测羊口疮病毒和丝状支原体簇的准确性高。

图3 中泳道4是对羊口疮病毒模板的检测，图上能够很清楚的看见长度为304bp的条带，而泳道5的阴性对照无明显条带，这说明成功检测出羊口疮病毒。说明本专利检羊口疮病毒的准确性高。

图3中泳道6和泳道7是对丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种模板的检测，图上能够很清楚的看见长度为1232bp的条带，而泳道8阴性对照无明显条带，这说明成功检测出丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种。说明本专利检测丝状支原体簇的准确性高。

实施例4

羊口疮病毒和丝状支原体簇混合模板的双重PCR敏感性试验

羊口疮病毒和丝状支原体簇的混合模板用无菌去离子水按10^-1-10^-7进行稀释，以去离子水作阴性对照，各样品模板分别用实施例4中表2所述的本发明最优反应体系进行PCR扩增。

反应条件为：95℃预变性2min；从94℃变性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸10min。

③电泳检测及判断

PCR 反应终止后，分别取7μL PCR 产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增得到304bp和1232bp的相应组合片段即可认为对应成功检测出羊口疮病毒和丝状支原体簇，如图4，图中：M为Marker，泳道1至泳道7为羊口疮病毒和丝状支原体山羊亚种混合模板的7个不同稀释度样品。

从图4 可以看出，用本发明中的双重PCR专用引物和双重PCR检测方法能同时检测出羊口疮病毒和丝状支原体簇样品的最低含量分别为1.25×10^-6ng/μL、1.8×10^-6ng/μL。

图4 中泳道1至泳道6 能够很清楚的看见长度为304bp和1232bp的条带，而泳道7的能隐约看到1232bp条带看不到304bp条带。

此外，羊口疮病毒和山羊支原体山羊亚种混合的7个不同稀释度检测结果与图4结果一致，不再附图说明。以上结果说明本专利同时检测羊口疮病毒和丝状支原体簇的敏感性高。

实施例5

羊口疮病毒和丝状支原体簇混合模板的双重PCR 重复性试验

羊口疮病毒3份阳性样品和丝状支原体山羊亚种2份阳性样品以及山羊支原体山羊肺炎亚种阳性样品1份，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、无菌去离子水各1份作阴性对照，各样品模板分别用实施例4中表2所述的本发明最优反应体系进行PCR扩增。间隔3天检测1次，共重复3次。

反应条件为：95℃预变性2min；从94℃变性30sec, 59℃退火15sec至72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸10min。

PCR 反应终止后，分别取7μL PCR 产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，能够扩增得到304bp和1232bp的相应组合片段即可认为对应成功检测出羊口疮病毒，丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种。如图5，图中：M为Marker，泳道1为羊口疮病毒和丝状支原体簇混合模板，泳道2至泳道4为羊口疮病毒，泳道5和泳道6为丝状支原体山羊亚种，泳道7为山羊支原体山羊肺炎亚种，泳道8至泳道11分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌阴性对照和空白对照无菌去离子水。

从图5可以看出，用本发明中的双重PCR专用引物和双重PCR检测方法可重复性良好。

图5中泳道2至泳道4能够很清楚的看见长度为304bp的条带，泳道5至泳道7能够清晰看见长度为1232bp的条带，而泳道8至泳道10的阴性对照和泳道11的空白对照均无明显条带，且重复3次结果都一致。证明本专利检测羊口疮病毒和丝状支原体簇的重复性好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 两类羊病原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> ORFVB2L 1

<400> 1

atcgagaacg ccaagaacag catcg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> ORFVB2L 2

<400> 2

tgtcgtccac gatgagcagc ttagt 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Mm-cluster 1

<400> 3

tgagatgggg atgcggcgta tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Mm-cluster 2

<400> 4

tgggaagcgc tctccaaatg gt 22