专利名称：用于病原体检测和治疗的工程化调理素的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学、微生物病原体以及用于检测和/或移除流体(包括体液如血液)中的病原体的系统。更具体而言，例如，本发明提供了可用于结合生物病原体或者识别亚类(subclasses)或特定病原体种的工程化分子调理素，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中。
背景技术：
在美国，脓毒症是非冠状I⑶患者中的第二大主要死因，并且总的说来是第十大最常见死因。脓毒症是一种严重的医学症状，其以全身炎症性状态(称为全身性炎症应答综合征)和存在已知的或可疑的传染为特征。脓毒症一般在菌血症、病毒血症或真菌血症期间出现，并可能起因于由病原体(如金黄色葡萄球菌)所引起的传染，所述病原体不是典型的血源性病原体。血源性病原体是当通过血液或其它潜在已感染体液从受感染者转移至另一人时引发疾病的微生物。最常见的疾病包括乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、疟疾、丙型肝炎和梅毒。不幸地是，在通过血培养识别出传染物之前，全身性炎症应答综合征可变得危及生命。这一免疫应答引起急性期蛋白的普遍活化，影响了补体系统和凝集途径，然后，引起对脉管系统和器官的损害。各种神经内分泌逆调节系统(neuroendocrinecounter-regulatory systems )也得以活化,常常使得问题复杂化。即使是立即且强有力地进行治疗，其也可能发展至多器官功能障碍综合征并最终死亡。因此，仍然需要改进用于对患有传染病、血源性传染、脓毒症或全身性炎症应答综合征的患者进行诊断和治疗的技术。
发明内容
本发明提供了工程化分子调理素，所述工程化分子调理素可用于结合生物病原体或者识别亚类或特定病原体种，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中，或用于对水源性病原体或食源性病原体进行鉴别。本发明一方面提供了甘露糖结合凝集素(MBL)，所述MBL为丰富的天然血清蛋白，是先天性免疫系统的一部分。这一蛋白凝集素结合至几乎所有种类生物病原体(病毒、细菌、真菌、原生动物)上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在诊断和治疗传染病和脓毒症中极其有用。本发明的实施方式提供了一种重组调理素，所述重组调理素包含调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至固体表面结合结构域的柔性肽结合域。在本发明的一些方面中，所述碳水化合物识别结构域为凝集素或凝集素的片段。或者，所述碳水化合物识别结构域为胶原凝集素或ficollin、或者它们的局部或片段。在特定的方面中，所述碳水化合物识别结构域(CRD)包含MBL的局部，所述局部起始于工程化调理素的凝集素部分的N末端的第81位脯氨酸残基。在另一特定的方面中，所述碳水化合物识别结构域包含MBL的局部，所述局部起始于工程化调理素的凝集素部分的N末端的第111位甘氨酸残基。在本发明的特定方面中，重组调理素的基底结合结构域包含一个或多个使其化学交联至固体基底的半胱氨酸残基。所述固体基底可包括磁性微珠(可包被有蛋白A)、微孔膜、中空纤维反应器或任何其它血液过滤膜或流动装置。在其它方面中，基底可以为细胞(如免疫细胞(例如，巨噬·细胞))的表面、在免疫系统的组织或器官(例如，淋巴结或脾)排列的细胞的表面、或者免疫系统的组织或器官的胞外基质的表面。在本发明的另一方面中，柔性肽结构域可包含至少一个甘氨酸+丝氨酸节段和/或至少一个脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段。在本发明的另一方面中，柔性接头为免疫球蛋白Fe部分，如Fe Y。人IgGlFc与MBL的颈区和CRD区的融合改进了表达和纯化以及以活化形式对基底的偶联。本发明的实施方式提供了一种从流体中收集结合调理素的微生物的方法，所述方法包括使缀合至固体表面的重组调理素与所述流体相接触；其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、固体基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述固体表面结合结构域的柔性肽结构域组成；使结合所述调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物；以及将所述微生物结合的重组调理素-固体表面缀合物与所述流体分离。所述流体可以是从受试者处得到的生物流体，如血液。然后，所述流体可返回至所述受试者。本发明的另一实施方式提供了一种对受试者的血液感染进行治疗的方法，所述方法包括向受试者的血液给予重组调理素，其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的柔性肽结构域组成，其中，所述碳水化合物识别结构域与结合调理素的微生物相结合，并且，其中所述基底结合结构域与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合；使所述重组调理素与结合调理素的微生物相结合；以及，使所述微生物结合的重组调理素与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合，所述微生物在所述免疫系统中被杀死。受试者可为动物或人。
图I示出在本发明的实施方式中经工程化为成组的三聚体(聚合物)的甘露糖结合凝集素(MBL)的示意图。图2A和图2B为本发明实施方式的示意图，其中，人工蛋白(图2A)包含空间上不受阻的N-末端(任选在N-末端处或接近N-末端处具有半胱氨酸)、随后是以长的柔性肽节段、接着是处于C-末端的MBL凝集素结构域，所述人工蛋白交联至图2B中的示例装置中的固体基底。图3示出本发明实施方式的Fc-MBL. 81的草图形式以及基于Fe与MBL的颈区和碳水化合物识别结构域(CRD)的X射线晶体学模型的模型形式的图。图4为本发明的一个方面中编码Fe的载体的示意图。图5示出DynaBead-MBL对白色念珠菌(C. albicans)的I丐依赖性结合,其中，I丐维持结合而EDTA使结合不稳定。图6不出MBL-磁珠对不同病原体的结合。将病原体通过MBL包被的磁珠(对照无MBL的磁珠)结合、漂洗并洗脱至培养平板上。图7示出来自将MBL-磁珠结合至微生物并过夜培养试验的数据。将病原体通过MBL包被的磁珠(对照■ 无MBL的磁珠)结合、漂洗并洗脱至培养平板上，并孵育过夜。图8表明来自瞬时转染的FcMBL的高水平表达。图8A为用转染有pFUSEFc MBL. 81(和pFUSE Fe)的293细胞的未纯化上清液加样的、用抗_hFc进行探测的还原胶Western印迹。图8B示出Protein A纯化的Fe MBL. 81。图9示出耗竭试验(depletion assay)的结果，其中，在结合白色念珠菌(C. albicans)的方面，FcMBL. 81构建体的活性等同于全长的MBL。
具体实施例方式应当理解的是，本发明不限于本文所记载的具体的方法学、方案和试剂等，并因而可以进行变化。本文所使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方式，而并不打算限定本发明的范围，只通过权利要求书对本发明的范围进行限定。除非上下文明确地另有要求，如本文和权利要求书中所使用的单数术语应包含复数且复数术语应包含单数。除在操作实施例中或是另有指明以外，本文所使用的全部表达成分的量或反应条件的数值在所有实例中都应被理解为由术语“约”修饰。为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利和其它已确定的出版物在此明确地并入本文，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本发明相关。这些出版物仅因为它们的公开早于本发明的申请日而提供。在这方面的任何内容不应视为承认发明者没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开内容的日期提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。除非本文另有定义，与本申请结合使用的科技术语应具有本领域普通技术人员所共同理解的相同含义。尽管任何已知的方法、装置和原料可被用于本发明的实际操作或测试中，就这一点而言，本文已对这些方法、装置和原料进行了描述。从最广义上看，调理素为结合至颗粒表面的蛋白质。本质上，调理素充当了吞噬过程的结合增强剂(例如，通过在靶病原体膜上包被带负电的分子)。本发明提供了一种工程化分子调理素，如甘露糖结合凝集素(MBL)，可将所述调理素用于结合生物病原体或者识别亚类或特定病原体种，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中。治疗可在体内或体外进行。MBL为结合至许多微生物病原体表面上存在的甘露糖、含N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的碳水化合物和各种其它碳水化合物的血清凝集素调理素。MBL(也称为甘露糖结合蛋白或甘露聚糖结合蛋白，MBP)为由三个以上32kDa单体组装成的聚合蛋白。各单体具有N-末端富含半胱氨酸区、胶原样gly-X-Y区、颈区和碳水化合物识别结构域。从32kDa单体的三聚体的形成开始装配较高分子量(MW)聚合物；然后，这些三聚体自组装成3-6组三聚体的更高分子量的聚合物。参见图I。MBL为微生物病原体的调理作用和补体活化(通过凝集素途径)及凝集作用中的关键组分。调理作用是蛋白质对靶细胞的结合和以这些细胞作为靶标用于通过吞噬细胞(如巨噬细胞和中性粒细胞)进行摄取和破坏。这一调理作用看起来是通过MBL的小的、富含半胱氨酸的N末端结构域以及通过MBL-介导的补体的凝集素途径活化而在靶细胞表面上沉积的C3b加以介导。在经由凝集素途径的补体活化中，微生物和特化蛋白(specialized protein)(即，MASP-I (甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶)(Matsushita&Fujita, 176, J. Exp.Med. ,1497 (1992))和 MASP-2 (Thiel 等，386，Nat.，506 (1997)))与结合的 MBL 相互作用并在不存在抗体的情况下活化补体。更高分子量MBL复合物(功能性MBL三聚体的5-6次重复)是补体经由这一凝集素途径的强力活化剂，其中，看起来MASP2活化补体而MASPl活化凝集作用。较小的复合物(MBL三聚体单位的3-4次重复)是凝集作用的最强力活化剂(Krarup 等，2，PLoS One, e623 (2007))。在某些人群中，处于胶原螺旋中的MBL于第52位、第54位和第57位密码子处存在高的等位基因突变频率(Garred等，7，Genes Immun. , 85 (2006))。这些突变妨碍了更高分子量MBL形式的形成并抑制了补体活化。在这些情况下，MBL仍然作为调理素起作用·并激发凝集作用，但并不活化补体。还有一些就脓毒症而论的杂合子优势(heterozygoteadvantage)的证据，在脓毒症中，杂合子具有最佳存活率，纯合的“野生型”具有次最佳存活率，而纯合的“突变型”具有最差的存活率(参见Sprong等，49，Clin. Infect Dis.，1380(2009))。另外，在获得性免疫系统开始起作用前，纯合的突变型新生儿特别易于感染。已有很多关于MBL作为重组治疗蛋白用于传染病治疗的有用性的争论。当从人血捐献物中进行纯化时，将完整的MBL作为重组蛋白用于I期和II期临床试验中。事实上，血浆来源MBL已被用作MBL缺乏(患有化疗导致的中性白细胞减少症的儿科患者)的I期和II期试验中的治疗剂(Frakking等,45, Eur. J. Cancer, 50 (2009))。由于生产重组蛋白和确定功效中的困难，开发MBL的商业努力已经失败。如本文所使用的，对受试者进行治疗可指被提供用于管理、改善或缓解其疾病、病症或其症状的医疗护理。本发明提供了工程化调理素(例如工程化的MBL或MBL聚合物)，从而用于病原体检测和清除的装置和系统中。图5显示出缀合MBL的磁微珠对酵母白色念珠菌(C. albicans)的钙依赖性结合。图6和图7比较了数种不同病原体(包括革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(S. aureus);革兰氏阴性细菌克雷伯氏菌(Klebsiella)和大肠杆菌(E.coli);以及酵母菌白色念珠菌(C. albicans))之间的MBL-磁珠结合。近期的研究表明了使用微磁技术和微流体技术的组合从流动的液体(如生物流体，如血液)中清除活病原体白勺可行性(Xia 等，8, Biomed. Dev. Biomed. Microdev. , 299 (2006) ;Yung 等，Lab on a ChipDOI :10. 1039/b816986a (2009))。在这些微装置中(包被有分子的磁微珠，所述分子特异性地结合至病原体细胞上的表面标记)，允许结合至人全血中的这些细胞，然后，使用施加的磁场梯度通过微流体通道从血流中自由地吸出(参见W0/2008/130618 ;W0/2007/044642)。除此用途外，这些装置很有希望快速清理具有产毒素的病原体的脓毒症患者的血液，并因此极大地增强了对传统抗菌素疗法的响应。使用有可能便宜且易于使用的微装置快速(在几分钟内)结合、检测和分离在血液中循环或者存在于其它生物流体内的活病原体的能力还规避了目前的病原体检测和敏感度测试试验的主要限制(需要在医院实验室或商业实验室中进行多天的微生物培养)。
本发明中可使用的生物流体包括例如血液、脑脊髓液、关节液、尿液、精液、唾液、泪液和由插针收集的液体。另外，液体可收集自用于如本发明所述的快速、通用污染试验的食物样品或水样品可收集并对天然微生物污染或对可能的“生物恐怖主义(bio-terrorism)”污染的此类流体进行分析。进一步而言，这些方法的当前效用利用了期望从血液中清除的特定病原体的现有知识，因为在使用血液净化装置前，将病原体的特异性配体(如特异性抗体)放置在了磁珠上。因此，本发明通过提供工程化的通用结合分子(generic binding molecules)来补强目前的方法，所述分子如同生物调理素一样发挥作用并结合至本应用所需要的特异性的许多类型或全部类型的微生物病原体。就这点而言，本发明具有治疗应用。本文所针对的另一需求是专化型病原体类特异性调理素的开发，所述调理素结合例如所有类型的真菌、或者所有的革兰氏阴性细菌、或者所有的或特定的革兰氏阳性细菌、或者所有的病毒、或者所有的原生动物，因为在通过传统方法(通常花费很多天去完成)对抗生素敏感性的种型的完整表征进行识别前，这一认知在医师选择抗菌素疗法中可以快速 地给予建议。另外，随着基因工程及定向进化和选择策略的使用，可将修饰形式的天然调理素(如MBL)进行工程化从而以种特异性的方式结合至病原体。最终，可使用适当的选择策略完成结合，所述结合对于对不同的抗生素或抗菌素疗法敏感的病原体来说是特异性的。因此，本发明提供了对供给这些高价值特性的工程化调理素的开发。MBL是作为用于本文所述目的的通用调理素的出色选择；然而，一般不在全血存在的情况下使用完整的分子，因为其具有多个促进血液凝固作用的功能域，从而可能会干扰诊断和治疗微装置的功能。可将MBL的这一特征与如本文所提供的其病原体结合功能相分离。更具体而言，MBL从N末端到C末端含有4个部分具有实质上未知功能的小的N末端结构域，可能参与巨噬细胞结合和/或MASP结合；胶原节段，可能也参与MASP结合和更高级的寡聚化；α螺旋“颈”节段，足以用于三聚化；以及介导直接的病原体结合的、位于C-末端的CRD凝集素结构域。该凝集素结构域对于即将到来的应用来说是有用的，其它结构域根据使用者的需要可存在或删除，并且可通过常规测试来确定。另外，凝集素活性为钙依赖性的，所以，可通过螯合剂使结合的微生物释放用于诊断目的。作为用于诊断和治疗应用中的通用调理素的工程化构造MBL的一个实施方式包含MBL的凝集素结构域。例如，第111位的甘氨酸(如在结构生物信息学研究中心(RCSB)，蛋白质数据库结构文件IHUP中所定义的)是方便的N末端点，工程化调理素的凝集素部分起始于该位置。由于MBL对所给定的单体糖的结合很微弱，因此MBL可以柔性方式连接至固体基质，以便表面上的蛋白能够移动并适应微生物的形状。例如，如图2Α中所示，可将柔性肽(如一个或多个甘氨酸+丝氨酸节段或一个或多个脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段或本领域已知的其它肽接头)置于MBL的N末端，因为这些节段倾向于不形成折叠结构。作为用于诊断和治疗应用中的通用调理素的工程化构造MBL的另一实施方式包含MBL的颈结构域和凝集素结构域。第81位脯氨酸(如，例如，结构生物信息学研究中心，蛋白质数据库(RCSB TOB)结构文件IHUP中所定义的)是方便的N末端点，用于这一工程化调理素构建体的凝集素序列起始于该位置。MBL的这一局部下游(C末端)融合至人IgG的Fe部分(Fe Y )。所述Fe部分可包含IgG Fe结构域的CH2-CH3交界处，所述CH2-CH3交界处含有大量Fe受体(包括葡萄球菌蛋白A)的结合部位。在使用中，所述Fe部分二聚化并增强了 MBL凝集素对单体糖结合的亲合力与亲和力(avidity affinity)。另外，当作为诊断剂使用时，可移除重组调理素的N-连接糖基化。例如，在Fe MBL. 81中，可通过将抗体中的编号氨基酸的Kabat系统中的第297位残基处的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸(N297D)来移除糖基化，这对应于这一特定Fe构建体中的第82位氨基酸。糖基化的Fe维持了 Fe介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体介导的细胞毒作用(CDC)的正确取向(correct orientation)。可将工程化Fe MBL调理素用于Fe受体介导的对Fe MBL调理的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的摄取的活化,而绕过甘露糖受体介导的对结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的摄取。近期的出版物(Kang 等，202，J. Exp. Med. , 987 (2005))表明在吞噬过程中，结核分枝杆菌的细胞表面上的脂阿拉伯甘露聚糖(ManLaM)接合巨噬细胞甘露糖受体(MMR)。这指引结核分枝杆菌至其初始的吞卩遼体生态位(phagosomal niche)并抑制吞噬体-溶酶体(P-L)融合，借此增高在人巨噬细胞中的存活率。有趣的是，通过Fe Y受体进入时并不发生P-L融合的抑制。在一个实施方式中，通过Fe受体胞吞作用途径将细菌 (例如，结核分枝杆菌(M. tuberculosis))摄取至不同的胞内囊泡。如图2B中所示，本发明的工程化调理素的构造也帮助了融合蛋白使用对N末端氨基基团特异的化学交联接头连接至基底(如微孔膜或磁微珠的固体表面)、或连接至已被工程化为靠近蛋白质N末端的游离半胱氨酸残基(赖氨酸是半胱氨酸的备选物，任选地紧接着移除蛋白质中的剩余的赖氨酸残基)。在一些实施方式中，与调理素结合的基底为组织或器官的活细胞或胞外基质。例如，基底可为与免疫应答有关的细胞、组织或器官的表面。例如，细胞可为吞噬细胞(巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和/或天然杀伤细胞。细胞可为免疫系统的组织或器官(如脾、淋巴结、淋巴管、扁桃体、胸腺、骨髓、派伊尔氏淋巴集结(Peyer’s patches)、结缔组织、粘膜、网状内皮系统等)的细胞。调理素所结合的表面也可为一个或多个这些组织或器官的胞外基质。在一些实施方式中，固体基底可包含磁珠或其它结构材料，然后，将微生物从流体(包括生物流体如血液)中吸出，浓缩和收集微生物(包括活微生物)。这一方法是有利的，因为可对珠进行微生物存在的检查，或将珠用于将所收集的微生物转移至传统的病原体培养和敏感度测试试验。换句话说，可将工程化调理素用于作为收集潜在病原体以进行鉴别的手段的诊断中；不仅用于疾病的诊断中，而且用于水源性病原体或食源性病原体、微粒或其它污染物的鉴别中。或者，固体基底可包括中空纤维反应器或任何其它血液过滤膜或流动装置(例如，简单的渗析管)或选择性结合并隔离生物病原体的其它树脂、纤维或片材(sheets)。磁珠可为任何形状，包括但不限于球形、杆状、椭圆形、圆柱形和盘状等。在一些实施方式中，将具有真正的球形形状和定义的表面化学的磁珠用于最小化化学凝聚和非特异性结合。如本文所使用的术语“磁珠”是指可被磁场梯度吸引或排斥的、或者具有非零磁化率(magnetic susceptibility)的纳米或微米尺寸的颗粒。磁珠可以是顺磁或超顺磁的。在一些实施方式中,磁珠为超顺磁的。本文中也将磁珠称为磁性粒子。在一些实施方式中，将具有聚合物壳的磁珠用来保护病原体免于暴露至铁。例如，可将聚合物包被的磁珠用于保护病原体免于暴露至铁。磁珠尺寸可为lnm-lmm。例如，磁珠尺寸为约250nm_约250 μ m。在一些实施方式中，磁珠尺寸为O. I μ m-100 μ m。在一些实施方式中，磁珠尺寸为O. I μ m_50 μ m。在一些实施方式中，磁珠尺寸为O. Iym-IOym0在一些实施方式中，磁珠为磁性纳米颗粒或磁性微米颗粒。磁性纳米颗粒为可使用磁场或磁场梯度进行操控的一类纳米颗粒。此类颗粒通常由磁性元素(如铁、镍和钴以及它们的化学化合物)组成。磁性纳米颗粒为众所周知的，并且它们的制备方法已在本技术领域中有所描述。参见例如，美国专利No. 6，878，445 ；No. 5，543，158 ；Νο. 5，578，325 ；Νο. 6，676，729 ；Νο. 6，045，925 和 No. 7，462，446 ；以及美国专利公开 No. 2005/0025971 ；Νο. 2005/0200438 ；Νο. 2005/0201941 ；Νο. 2005/0271745 ；No. 2006/0228551 ；Νο.2006/0233712 ；Νο.2007/01666232 和 No. 2007/0264199。具有或者不具有能与亲和分子相结合的功能基团的磁珠可容易且广泛地商购得至丨J。合适的磁珠可例如从下处商购得到Dynal Inc. (Lake Success, NY) ；PerSeptiveDiagnostics,Inc. (Cambridge, MA)；Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) ；Cortex BiochemInc. (San Leandro, CA);以及 Bangs Laboratories (Fishers, IN)。在特定的实施方式 中，磁性颗粒为 MyOne Dynabeads⑨磁珠(Dynal Inc.)。所述固体基底可由生物相容材料制造或者包被有生物相容材料。如本文所使用的术语“生物相容材料”是指当植入或放置在邻近于受试者的生物组织时不会随时间而发生可察觉的损害和引起显著的免疫应答或有害的组织反应(例如，毒性反应或显著的刺激)，或者当与血液接触时，不引起凝血或血凝的任何材料。合适的生物相容材料包括,例如聚酰亚胺的衍生物和共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺和聚乙烯胺、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚碳酸盐/酯以及聚苯乙烯。在一些实施方式中，所述固体基底用选自于由下述材料所组成的组中的材料制造或包被有选自于由下述材料所组成的组中的材料聚二甲基硅氧烷、聚酰亚胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯聚砜、聚碳酸盐/酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏氟乙烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚醚砜、聚醚醚酮、聚乙二醇、苯乙烯-丙烯腈树脂、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚乙烯醇缩丁醛、聚偏二氟乙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及上述材料的任意组合。在本发明的一个方面中，本文所述的重组调理素可通过本领域公知的、用于使肽与其它分子缀合的方法来与固体基底缀合。例如=Hermanson, B10C0N JUGATETECHNIQUES (第 2 版，Academic Press (2008))和 Niemeyr, BioconjugationProtocols:Strategies&Methods,METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Humana Press,2004),提供了大量的用于使肽缀合至其它分子的方法和技术。de Graaf等,20, BiocojugateChem. ,1281 (2009)提供了将非天然氨基酸位点特异性地引入肽中用于缀合的综述。或者，可将固体基底的表面进行功能化以包含选择性地与重组调理素结合的结合分子。本文中也将这些结合分子称为亲和分子。结合分子可共价或非共价地结合于固体基底的表面上。如本文所使用的术语“结合分子”或“亲和分子”是指能够特异性地结合本文所述的重组调理素的任何分子。亲和分子的代表性实例包括但不限于抗体、抗原、凝集素、蛋白质、肽、核酸(DNA、RNA、PNA以及作为它们的混合物的核酸、或者包含核苷酸衍生物或类似物的核酸)；受体分子，如胰岛素受体；用于受体的配体(例如，用于胰岛素受体的胰岛素)；以及对另一分子具有亲和力的生物、化学或其它分子(如生物素和抗生物素蛋白)。结合分子不需要包含整个天然存在的分子，而可仅由天然存在的分子或非天然存在分子的局部、片段或亚基组成，例如抗体的Fab片段。结合分子还可包含可被检测到的标记物。可使用本领域技术人员已知的任何方法将结合分子缀合至固体基底的表面。可将结合分子共价或非共价地偶联至或缀合至固体基底的表面。可通过例如硅烷偶联完成共价固定。参见例如，Weetall，15，Adv.Mol.Cell Bio. , 161 (2008) ；ffeetall,44, Meths.Enzymol. , 134, (1976)。还可通过接头介导结合分子和表面之间的共价连接。亲和分子和表面之间的非共价连接可基于离子相互作用、范德华力、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用。如本文所使用的术语“接头”意味着连接组合物的两部分的分子基团。肽接头可影响所给定的融合蛋白的折叠，并且也可与其它蛋白反应/结合，并且这些特性可通过已知技术进行筛选。除本文所述的以外，示例的接头还包括成串的组氨酸残基，例如，His6 ； 由丙氨酸和脯氨酸组成的序列，改变Ala-Pix)对的数目以调整接头的柔性；以及由带电氨基酸残基组成的序列，例如，将Glu和Lys进行混合。可通过接头中的残基的类型和数目来控制柔性。参见例如，Perham, 30, Biochem. , 8501 (1991) ；ffriggers 等,80, Biopolymers,736 (2005)。化学接头可包括直接键合或原子(如氧或硫)、单元(如NH、C (O)、C (O) NH、S0、SO2, SO2NH)或者原子的链(如取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C5-C12杂芳基、取代或未取代的C5-C12杂环基、取代或未取代的C3-C12环烷基，其中，一个或多个亚甲基可由O、S、S (O)、SO2、NH或C (O)中断或终止)。基于核酸的结合分子包括适体。如本文所使用的术语“适体”意味着能够通过除Watson-Crick碱基配对或三螺旋形成以外的机制来特异性地识别所选择的非寡核苷酸分子或分子的基团的单链、部分单链、部分双链或双链的核苷酸序列。适体可包括而不限于所定义的序列节段和包含如下核苷酸的序列核苷酸；核糖核苷酸；脱氧核糖核苷酸；核苷酸类似物；经修饰的核苷酸；以及包含骨架修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥连的核苷酸。选择用于结合至分子的适体的方法是本领域普遍已知的，并且对本领域普通技术人员来说很容易理解。重组调理素可通过亲和结合对缀合至固体基底的表面。术语“亲和结合对”或“结合对”是指特异性地相互结合的第一分子和第二分子。结合对的一个成员与固体基底相缀合而第二成员与重组调理素相缀合。如本文所使用的术语“特异性结合”是指比起对其它分子的结合，结合对的第一成员对结合对的第二成员具有更高亲和力和特异性的结合。示例性的结合对包括与相应的抗体或其结合部分或其片段相组合的任何半抗原化合物或抗原化合物(例如，地高辛和抗地高辛；小鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠免疫球蛋白)和非免疫结合对(例如，生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素)、激素(例如，甲状腺素和皮质醇-激素结合蛋白)、受体-受体激动剂、受体-受体拮抗剂(例如，乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-酶抑制剂以及能形成核酸双螺旋的互补寡核苷酸对等。结合对还可包括带负电的第一分子和带正电的第二分子。
使用结合对缀合的一个实例是生物素-夹心法。参见例如，Davis等，103，PNAS,8155(2006)。使待缀合在一起的两个分子生物素化，然后，使用四价的链霉亲和素作为接头缀合在一起。可将肽偶联至受体肽的15-氨基酸序列以进行生物素化(称为AP ;Chen等，2，Nat. Methods，99(2005))。受体肽序列允许通过大肠杆菌(E. coli)酶生物素连接酶(BirA ；同上文)进行位点特异性的生物素化。重组调理素可类似地被生物素化以与固体基底缀合。对于生物素化的蛋白质也有许多可商购的试剂盒。缀合至固体表面的另一实例将使用PLP介导的生物缀合。参见例如，Witus等，132，JACS，16812 (2010)。在这一实施例中，Fe N末端上的AKT序列允许缀合至固体表面，并且处于最佳取向的凝集素结合结构域的取向指向远离固体表面。应注意的是，单个凝集素结构域对糖的亲和力很低，并且正常情况下，结合受亲合力和多价驱使。就本装置来说，从蛋白上除去了多聚化结构域，并且通过以高密度连接至固体基底(例如，珠)来有效地产生蛋白的多价，可改变所述浓度以提供最佳的功能性。
进一步考虑MBL，可通过用于改变的结合特异性的定向进化来操控其结合特征。可对MBL进行修饰，以便其结合至糖或其它分子特征的更受限的集合，结果是，所述经修饰的MBL将结合至微生物的更有限的集合，从而提供病原体类别鉴定(例如，病毒、细菌、真菌或原生动物中的一种)、亚类分型(例如，革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌)或确定特定种的能力。在本领域中有很多可利用的策略。例如，直接的定向进化策略直观地检查与糖络合的MBL的原子结构，然后，将适当的氨基酸进行突变从而以糖特异性的方式进行接触，以便丧失独特的接触或产生特定类型的空间位阻。大鼠MBL的三维结构以与高甘露糖寡聚糖络合和与N-乙酰氨基葡萄糖胺、甲基化的岩藻糖等络合的方式得以解析。Hisl89Val和Ile207Val为替代的实例，所述修饰改变了特异性。在定向进化的另一策略中，蛋白质受到随机诱变并且对得到的蛋白质进行期望性质的筛选。这对噬菌体展示抗体的亲和力成熟来说是特别有用的技术，其中，通过饱和诱变使抗体互补决定区(CDRs)发生突变，并将成功的六个CDRs变体一起改组以形成最高亲和力抗体。为了选择特异性地结合至酵母菌、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、凝固酶阴性细菌、需氧细菌等的MBL变体，可将定向进化范式应用到MBL。然而，为使之起效，这些靶标生物体上的相关表面特征或靶标糖的模式和性质在不同类或种之间可能必须不同。已知MBL强有力地结合至真菌、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌上的甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺糖。例如，MBL强有力地结合至假丝酵母菌(Candida spp.)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、A 组 β 溶血性链球菌(β hemolytic group A streptococci·)。MBL 对大肠杆菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)和 b 型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzaetype b)具有中等亲和力。MBL较弱地结合至B组β溶血性链球菌(β hemolyticgroup B streptococci)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) (Neth 等，68, Infect.,688 (2000))。认为脑膜炎奈瑟菌血清组B(Neisseria meningitides serogroupB)、b型流感嗜血杆菌(H. influenzaetype b)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的荚膜多糖减弱了 MBL结合,细菌内毒素也减弱了 MBL 结合。同上文，Van Emmerik 等，97, Clin. Exp. Immunol. ,411 (1994);Schelenz 等,63, Infect. Tmmun. , 3360 (1995)。其他人报道称MBL促进酵母菌而非细菌的调理吞噬，而不管MBL结合补体的MBL(凝集素)途径对酵母菌的调理吞噬来说至关重要，但是经典的补体途径对细菌的调理吞噬来说至关重要(Brouwer等，180, J. Immunol. , 4124 (2008))。然而，并未报道MBL结合至受试细菌菌种，只报道了 MBL结合不会促进显著的补体激活和调理吞噬。可通过以下方法分离具有特定特异性的MBL衍生物，所述方法为标准的噬菌体展示策略首先，由噬菌粒载体表达一组MBL变体；然后，使这一库结合至感兴趣的靶标(例如，大肠杆菌(E. coli))并进行一轮或两轮选择；然后，针对相关靶标(例如，假丝酵母(Candida))进行一轮阴性选择，取出未能结合的那些嗜菌粒。然后，重复进行这些阳性选择和阴性选择的循环直至产生普遍地结合至靶标而不结合至非靶标的噬菌体群。可将这一方法应用至期望差异化结合的任何成对的微生物菌株，如对所给定抗生素有抗性的细菌和敏·感的细菌。这一阳性/阴性富集策略也可与抗体-噬菌体展示库一起使用，抗体-噬菌体展示库甚至是分离此类特异性结合物的更为标准的方法。MBL属于C型(钙依赖性)凝集素超家族中的胶原凝集素类，可将胶原凝集素类的其它成员(如表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、CL-Ll和CL-P1)用于本发明中。其它可能的调理素包括ficollins (Thiel等，1997),所述ficollins还激活了补体的凝集素途径并结合MASP蛋白质。这些蛋白质与MBL有关但具有不同的、更加受限的特异性。在本文上下文所述的诊断装置中，一个选择是简单地使用对应于上述MBL凝集素结构域的ficollin凝集素结构域。另一方法是使用MBL和一种或多种Ficollins之间的片段的“改组”或个别氨基酸的“改组”以产生可能具有杂交特异性的杂交分子。上述定向进化和选择方法也可潜在地被用来生成提供上述的类特异性、亚类特异性和种特异性的人抗体片段或肽。本发明可如下述任一编号的段落所定义I. 一种重组调理素，所述重组调理素包含调理素的碳水化合物识别结构域；基底结合结构域；以及连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的肽结构域。2.段落I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是胶原凝集素或ficollin、或者衍生自胶原凝集素或ficollin。3.段落I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是凝集素或者凝集素的局部或片段。4.段落3中所述的重组调理素，其中，所述的凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。5.段落4中所述的重组调理素，其中，所述凝集素由MBL的第81位氨基酸残基(脯氨酸)至第228位氨基酸残基(异亮氨酸)(SEQ ID NO: 2)组成。6.在先任一段落中所述的重组调理素，其中，所述基底结合结构域包含至少一个使其化学交联至固体基底的半胱氨酸残基。7.在先任一段落中所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含甘氨酸+丝氨酸节段、或者脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段。8.在先段落中所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含免疫球蛋白Fe部分。
9.段落8中所述的重组调理素，其中，所述Fe部分包括IgG Fe结构域的CH2-CH3交界处。10.在先任一段落中所述的重组调理素，其中，所述基底是磁性微珠、顺磁微珠、微孔膜、中空纤维反应器或任何其它流体滤膜或流动装置。11.在先任一段落中所述的重组调理素，其中，所述基底是生物组织或器官的活细胞或胞外基质。12.段落11中所述的重组调理素，其中，所述基底是吞噬细胞。13. 一种从流体中收集结合调理素的微生物的方法，所述方法包括使缀合至固体表面的重组调理素与所述流体相接触；其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、固体基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述固体 表面结合结构域的柔性肽结构域组成；使结合所述调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物；以及将所述微生物结合的重组调理素-固体表面缀合物与所述流体分离。14.段落13中所述的方法，其中，所述固体表面是磁性粒子，并在所述结合调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物后，通过对所述流体施加磁力实现所述分离。15.段落13中所述的方法，所述方法进一步包括鉴别所述微生物的步骤。16.段落13中所述的方法，其中，所述流体是生物流体。17.段落16中所述的方法，其中，所述生物流体选自于由下述流体所组成的组血液、脑脊髓液、关节液、尿液、精液、唾液、泪液以及通过针、活组织检查或吸引术程序收集的流体。18.段落17中所述的方法，其中，所述生物流体是血液。19.段落18中所述的方法，所述方法进一步包括将血液返回至其来源的步骤。20.段落19中所述的方法，其中，所述来源是受试者。21.段落20中所述的方法，其中，所述受试者患有感染或脓毒症。22.段落13中所述的方法，其中，所述流体来自水样品或食物样品。23.段落1-10中任一段落所述的重组调理素在病原体鉴定中的用途。24.段落1-10中任一段落所述的重组调理素在疾病诊断中的用途。25.段落1-10中任一段落所述的重组调理素在水污染或食物污染鉴别中的用途。26.段落1-12中任一段落所述的重组调理素在疾病治疗中的用途。27.段落26中所述的重组调理素的用途，所述用途进一步与另外的治疗或疗法相组合。28. 一种对受试者的血液感染进行治疗的方法，所述方法包括向受试者的血液中给予重组调理素，其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的柔性肽结构域组成，其中，所述碳水化合物识别结构域与结合调理素的微生物相结合，并且，其中，所述基底结合结构域与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合；使所述重组调理素与结合调理素的微生物相结合；以及使所述微生物-结合的重组调理素与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合，所述微生物在所述免疫系统中被杀死。29.段落28中所述的方法，其中，所述受试者是动物。30.段落28中所述的方法，其中，所述受试者是人。实施例实施例I. FcMBL. 81的构建和表达在诊断和疗法应用中用作通用调理素的工程化构造MBL的实施方式，可使用MBL的“颈”和“凝集素”结构域构建。将第81位的脯氨酸(如结构生物信息学研究中心，蛋白质数据库结构文件IHUP中所定义的)选择作为N末端点，凝集素序列起始于该位置。该凝集素分子的这一局部下游(C末端)融合至人Fe部分Yl (Fcy)0在图3中示出了工程化凝集素构建体的图。在图4中示出了克隆的Fe部分的示意图。 这一构建体的氨基酸包括下列残基Fe蛋白序列001 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvvvd vshedpevkf061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp ga(SEQ IDNO: I)MBL. 81蛋白序列(这一序列包括人MBL的卷曲螺旋颈区和碳水化合物识别结构域(CRD))81 pdgdsslaas erkalqtema rikkwltfsl gkqvgnkffI tngeimtfek vkalcvkfqa141 svatprnaae ngaiqnlike eaflgitdek tegqfvdltg nrltytnwne gepnnagsde201 devillkngq wndvpcstsh lavcefpi(SEQ ID NO:2)Fc-MBL.81 序列001 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvvvd vshedpevkf061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp gapdgdssla241 aserkalqte marikkwltf slgkqvgnkf fltngeimtf ekvkalcvkf qasvatprna301 aengaiqnli keeaflgitd ektegqfvdl tgnrltytnw negepnnags dedcvlllkn361 gqwndvpcst shlavcefpi(SEQ ID NO:3)因此，FcMBL. 81构建体由具有MBL的第81位氨基酸残基(脯氨酸)至第228位氨基酸残基(异亮氨酸)的凝集素与Fe Y的部分融合组成。在使用中，所述Fe部分二聚化并向MBL凝集素对单糖的结合的弱亲和力增加亲合力。当将Fe MBL. 81设计为用作诊断试剂时，通过将其第297位氨基酸从天冬酰胺变为天冬氨酸(N297D)或将Fe构建体中的第82位氨基酸进行变化可移除N连接糖基化。糖基化的Fe维持了 Fe介导的ADCC和CDC的正确取向。另外，可将半胱氨酸残基克隆入工程化调理素中，使其通过化学缀合结合至固体基底。可通过本领域已知的多种技术来实现工程化调理素(如FcMBL)的构建和表达，参见例如，美国专利No. 5，541,087。在图8A和图8B中示出了瞬时转染细胞中的构建体的表达。所述FcMBL.81表达约 35mg/L。实施例2.将Fe MBL. 81构建体与全长MBL在结合酵母菌方面进行比较。将约550万白色念珠菌(Candida albicans)酵母细胞与不同数量的包被有野生型全长MBL (三聚体的六聚物)或Fe MBL. 81的MBL珠一起接种。如图9的图所示，1800万野生型全长MBL或Fe MBL. 81珠结合了全部550万真菌细胞。这一实施例表明在结合至 白色念珠菌方面，Fe MBL. 81珠的活性等同于野生型全长MBL珠。
权利要求
1.一种重组调理素，所述重组调理素包含 调理素的碳水化合物识别结构域； 基底结合结构域；以及 连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的肽结构域。
2.权利要求I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是胶原凝集素或fi Co 11 in、或者衍生自胶原凝集素或fi col I in。
3.权利要求I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是凝集素、或者凝集素的局部或片段。
4.权利要求3中所述的重组调理素，其中，所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。
5.权利要求4中所述的重组调理素，其中，所述凝集素由MBL的第81位氨基酸残基(脯氨酸)至第228位氨基酸残基(异亮氨酸)(SEQID NO:2)组成。
6.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底结合结构域包含至少一个使其化学交联至固体基底的半胱氨酸残基。
7.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含甘氨酸+丝氨酸节段、或者脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段。
8.在先权利要求中任一项所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含免疫球蛋白Fe部分。
9.权利要求8中所述的重组调理素，其中，所述Fe部分包括IgGFe结构域的CH2-CH3交界处。
10.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底是磁性微珠、顺磁微珠、微孔膜、中空纤维反应器或任何其它流体滤膜或流动装置。
11.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底是生物组织或器官的活细胞或胞外基质。
12.权利要求11中所述的重组调理素，其中，所述基底是吞噬细胞。
13.—种从流体中收集结合调理素的微生物的方法，所述方法包括 使缀合至固体表面的重组调理素与所述流体相接触；其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、固体基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述固体表面结合结构域的柔性肽结构域组成； 使所述结合调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物；以及 将所述微生物结合的重组调理素-固体表面缀合物与所述流体分离。
14.权利要求13中所述的方法，其中，所述固体表面是磁性粒子，并在所述结合调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物后，通过对所述流体施加磁力实现所述分离。
15.权利要求13中所述的方法，所述方法进一步包括鉴别所述微生物的步骤。
16.权利要求13中所述的方法，其中，所述流体是生物流体。
17.权利要求16中所述的方法，其中，所述生物流体选自于由下述流体所组成的组血液、脑脊髓液、关节液、尿液、精液、唾液、泪液以及通过针、活组织检查或吸引术程序收集的流体。
18.权利要求17中所述的方法，其中，所述生物流体是血液。
19.权利要求18中所述的方法，所述方法进一步包括将所述血液返回至其来源的步骤。
20.权利要求19中所述的方法，其中，所述来源是受试者。
21.权利要求20中所述的方法，其中，所述受试者患有感染或脓毒症。
22.权利要求13中所述的方法，其中，所述流体来自水样品或食物样品。
23.权利要求1-10中任一项所述的重组调理素在病原体鉴定中的用途。
24.权利要求1-10中任一项所述的重组调理素在疾病诊断中的用途。
25.权利要求1-10中任一项所述的重组调理素在水污染或食物污染鉴别中的用途。
26.权利要求1-12中任一项所述的重组调理素在疾病治疗中的用途。
27.权利要求26中所述的重组调理素的用途，所述用途进一步与另外的治疗或疗法相组合。
28.一种对受试者的血液感染进行治疗的方法，所述方法包括 向受试者的血液中给予重组调理素，其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的柔性肽结构域组成，其中，所述碳水化合物识别结构域与结合调理素的微生物相结合，并且，其中所述基底结合结构域与免疫系统的细胞、组织或器官相结合； 使所述重组调理素与结合调理素的微生物相结合；以及 使所述微生物结合的重组调理素与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合，所述微生物在所述免疫系统中被杀死。
29.权利要求28中所述的方法，其中，所述受试者是动物。
30.权利要求28中所述的方法，其中，所述受试者是人。
全文摘要
本发明提供了工程化分子调理素，所述工程化分子调理素可用于结合生物病原体或者识别亚类或特定病原体种，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中。本发明一方面提供了甘露糖结合凝集素(MBL)，所述MBL为丰富的天然血清蛋白，是先天性免疫系统的一部分。这一蛋白凝集素结合至几乎所有种类生物病原体(病毒、细菌、真菌、原生动物)上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在诊断和治疗传染病和脓毒症中极其有用。
文档编号C07K19/00GK102947341SQ201180014755
公开日2013年2月27日 申请日期2011年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者米歇尔·舒普尔, 杰弗里·查尔斯·韦, 唐纳德·E·英堡 申请人:哈佛大学校长及研究员协会