用于获得抗体的方法

专利名称：用于获得抗体的方法
用于获得抗体的方法本发明涉及用于提高重组抗体(尤其是治疗性抗体)的生产及分离过程中的产量的方法。这些方法尤其适合用于治疗性抗体的大规模工业制造。重组DNA技术已经得到迅速的发展，尤其可用于生产抗体，特别是治疗性抗体。用于表达重组基因的系统是相关领域技术人员熟知的。这些系统包括在哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞以及转基因动物和植物中进行表达。对表达系统的选择取决于所编码蛋白质的特征，例如是否具有翻译后修饰。其他的考虑因素包括生产所需量的具有所需质量的材料所花费的时间和特别是成本。后者的这些考虑对于生产具有注册审批所需的质量并具有治疗大量患者所需的量的治疗性抗体尤其重要。最广泛使用的用于生产重组蛋白质的系统基于在大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli，大肠杆菌(E.coli))中的表达。使用大肠杆菌所面对的一个具体的问题在于难以生 产量以治疗所需的量的具有所需质量的材料。具体而言，所需的时间和成本太过高昂。值得注意的一个具体的问题是从大肠杆菌中提取抗体的过程中抗体的产量会有损失。尽管在比例上纯化成本是治疗性抗体产品的总成本的一部分，然而，纯化成本的比例会随着上游生产成本变得更便宜而进一步增加。因此，在抗体的回收和纯化上的改进会驱动生产成本进一步下降，不论是何种生产方式(Humphreys&Glover, Curr. Opin. Drug Disc/’overy&Development, 2001, 4:172-185)。这样，就需要方法向治疗性抗体的生产中(具体而言是在纯化中)引入时间和/或成本的节约，例如通过增加产品回收及或提高产品流的质量。
通过发酵或培养途径的低产品产量常常是在初级提取阶段注意到的一个突出的问题；抗体的表达在细胞内很高但在初级提取阶段很难达到高百分比的回收。有方法部分地解决了后者的问题并使得能够生产治疗性应用可接受的抗体，其在US 5，655，866中有所描述。此方法涉及使用热处理以帮助将抗体的功能性Fab’片段从非功能性抗体中随后分离出来，热处理可在发酵或培养期间的任何时间进行，或在抗体的提取和纯化期间的任何阶段进行。在温度升高到室温以上时，功能性抗体非常地稳定，而许多其他蛋白质包括宿主细胞蛋白质及游离的轻链重链种类以及抗体的非功能性片段形成沉淀物和/或聚集物，可容易地在初级纯化步骤如过滤或离心或流化床色谱中与功能性抗体相分离。细胞提取物是以US 5，655，866中描述的方法通过将完整的细胞在含有IOmM EDTA的Tris HCl缓冲液(IOOmM, pH7. 4)中孵育而制备的。W02006/054063描述了通过引入一种非裂解性处理与热处理相组合，提高了初级提取阶段功能性抗体的产量。此方法的要点是在离心后，将细胞沉淀重悬于含有IOOmMEDTA的IM Tris (pH7. 4)，随后进行非裂解处理，然后进行热处理。W02005/019466描述了在发酵之后但在包括提取的下游加工之前引入在限定的温度和PH条件下的中断步骤，提高了重组蛋白质的产量。发明概述本文描述的本发明是基于如下令人惊奇及出乎意料的观察事实在培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品后，初级回收过程中所得样品的PH的增加对抗体的产量有显著有益的影响。在加工(如加热)之前，抗体的pH起始范围为6-9的，而出乎意料的是甚至在有缓冲的情况下PH还是下降，可能是由于细胞代谢的结果。本发明人现在认为这对于产量/回收是极为有害的，并提出通过在恰当的时候在加工之前和/或之中调整材料的PH以确保pH处于目标范围内来解决这一问题。已经出乎意料地发现在热处理步骤之前，样品的pH对细胞样品中的抗体产量有显著的影响。已经发现将样品的PH调整至在热处理步骤前样品的pH为6-9将使抗体产量提高多达40%。这使得在生产大量具有治疗性质量的功能性抗体的时间和成本上有巨大的有益节省。事实上，可能不再需要其他常用于提高产量的步骤以达到高水平抗体产量，如均质化和稳定步骤。在先前所用的方法中，例如在US 5，655，866中，细胞提取物是通过将完整的细胞在PH 7. 4的缓冲液中孵育而制备的。已经发现，尽管添加了预期维持样品pH在恒定水平的缓冲液，细胞样品的PH事实上却随着时间逐渐降低。在特定的环境下，如添加缓冲液后经过长时间，发现样品的PH在热处理步骤之前低至pH 5.5。已经发现在热处理之前检测并 任选地调整pH以确保样品的pH为6-9之间导致抗体产量的惊人提高。不希望受到理论的束缚，认为在加工步骤如热处理期间将pH维持在6-9的范围内非常重要。在加工(如热处理步骤)之前调整PH有助于将pH维持在适当的范围内。因此，在一方面，提供了抗体提取步骤，其中PH在几乎整个加工过程的几乎全部持续期中基本上维持在6-9的范围内。不受理论的约束，认为本发明提供的方法使得能够在初级分离过程中从细胞周质中回收在标准提取条件下不会释放的重组蛋白质。因此，在本发明的第一方面，提供了用于生产重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及对样品进行热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的PH并任选地对其进行调整，以确保在热处理步骤前样品的pH为6-9。在此阶段对pH的监测对建立pH控制是至关重要的。在一个备选的方面，提供了用于从用编码重组抗体分子的表达载体转换的宿主细胞样品中提取重组抗体分子的方法；其包括以下步骤将所述细胞的组合物的pH调整到6-9的范围内，使得pH在随后的提取步骤中维持在此范围内，对细胞进行提取步骤，如热处理步骤，其中在提取步骤前及/或当中的至少一个时间点监测pH。还已经发现提取缓冲液的pH的提高使得样品经过热处理步骤后的抗体产量的惊人提闻。因此，本发明的第二方面提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将PH为7. 5-9. 0的提取缓冲液添加至样品；以及对样品进行热处理步骤。发明详述如本文所使用的抗体分子意欲指代完全抗体或其结合片段，尤其是完全抗体或Fab片段。在本发明的第一个方面，在热处理步骤前，样品具有或被调整至pH为6-9。在一个优选的实施方式中，热处理步骤之前的样品具有pH6. 5-8. 5、pH 6. 5-8. O、pH 7. 0-9. 0、pH 7. 0-8. 5、pH 7. 0-8. 0、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH 7. 2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. UpH 7. 2、pH 7. 3、pH 7. 4、pH 7. 5、pH 7. 6、pH 7. 7, pH 7. 8 或 pH 7. 9、如 pH 7. 4，尤其是 pH 6.8。本文提到的pH测量通常都标准化到20°C。本发明的方法中的热处理步骤是在加热期期间达到所需的高温后，将样品温度维持在所需的高温下的步骤。热处理步骤的合适的温度范围包括30-70°C。在本发明的上下文中，词句“热处理步骤前”指的是在样品达到所需 要的高温及热处理步骤(维持在高温下)开始的时间点之前并包括此时间点。为了达到热处理步骤所需的高温，样品会经历“加热期”，其中样品的温度升高到所需的高温。在一个实施方式中，根据本发明的方法包括使样品经历加热期及热处理步骤。在本发明的方法中，在热处理步骤前，样品具有pH 6-9，例如pH6. 8。在此上下文中，“热处理步骤前”指的是在样品达到热处理步骤所需的高温之前或在此时间点，样品的PH处于所需的水平。在其中的方法包括在使样品经历加热期及热处理步骤的实施方式中，样品在加热期开始之前可处于所需的PH水平和/或在加热期期中处于所需pH水平。在一个优选的实施方式中，在加热期开始之前样品处于所需的pH水平，为pH
6-9。在一个实施方式中，本发明提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及使样品经历加热期及热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的PH，并任选地对其进行调整，以确保在加热期前样品的PH为pH 6-9，例如为pH 7-9，如pH 7-8。在一个备选的实施方式中，本发明提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及使样品经历加热期及热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的PH并任选地对其进行调整，以确保在加热期中样品的PH为6-9，优选地为pH 6-8，更优选地为pH6-7。在一个实施方式中，检测样品的pH并任选地对其进行调整以确保样品的pH在加热期前为第一个pH,而在加热期中处于第二个pH。优选地,第一个和第二个pH水平优选是不相同。优选地，第二个PH低于第一个pH。因此，本发明提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及使样品经历加热期及热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的PH并任选地对其进行调整，以确保在加热期前样品的pH为7-9，优选地为pH 7-8，并确保在加热期中样品的pH为pH 6-8，优选地为pH 6-7。在此实施方式中，可在加热期前检测样品pH并任选地加以调整，且任选地在加热期中对其进行调整。在一个优选的实施方式中，在加热期前很短时间样品具有pH 6-9，优选地为pH
7-9，更优选地为pH7-8。另外地或备选地，在加热期中的热处理步骤前很短时间(任选地包括样品达到所需的高温且热处理步骤开始的时间点)，样品具有PH 6-9，优选地为pH 6-8，更优选地为pH 6-7。已经发现在加热期之前很短时间或热处理步骤之前很短时间的样品的pH对重组抗体的产量有显著的影响。在本发明的上下文中，术语“在……之前很短时间”优选地指的是在加热期或热处理步骤之前30分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短、4分钟或更短、3分钟或更短、2分钟或更短、I分钟或更短、30秒钟或更短、10秒钟或更短、5秒钟或更短、I秒钟或更短的时间内。术语“在……之前很短时间”还可包括在加热期开始或热处理步骤开始时的溶液pH为6-9。在添加提取缓冲液后检测样品的pH。样品的pH可使用本领域已知的任何合适的pH测量设备检测。样品的pH可在所述方法中的一个或多个独立的时间点检测，如在添加提取缓冲液的时间点、添加提取缓冲液之后很短时间、加热期开始之前很短时间、加热期开始的时间点、加热期当中(包括样品达到热处理步骤所需的高温的时间点)、热处理步骤中及热处理步骤之后。备选地，样品的PH通过连续监测而检测。在其中对样品pH进行连续监测的实施方式中，优选地，在培养细胞的步骤之后，优选地从培养后的离心步骤之后直到热处理步骤开始，对样品的pH进行连续监测。在一个优选的实施方式中，从添加提取缓冲液的时间点直到热处理步骤开始，对样品的PH进行连续监测。然而，还可在培养步骤中和 /或在热处理步骤中对PH进行监测。因此，在一个实施方式中，加热步骤的pH概况受到控制。在一个优选的实施方式中，检测样品的pH，并任选地对其进行调整，然后当样品达到所需pH时，(优选地自动)开始加热期。在培养细胞样品步骤后加入提取缓冲液。如果所述方法包括在培养步骤后进行离心步骤，则可在离心步骤之前和/或之中和/或之后加入提取缓冲液。优选地，在离心步骤之后加入提取缓冲液以重悬离心形成的细胞沉淀物。在本发明的一个实施方式中，提取缓冲液具有合适的pH，可确保在热处理步骤前样品的PH为pH 6-9，例如为pH 6-8。在其中提取缓冲液具有合适的pH以确保在热处理步骤前样品的PH为pH 6-9，例如为pH 6-8实施方式中，所述提取缓冲液例如具有的pH为pH7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH 7. 5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH8. I、pH 8. 2、pH 8. 3、pH 8. 4、pH 8. 5、pH 8. 6、pH 8. 7、pH 8. 8、pH 8. 9 或 pH 9. 0。优选地，加热期和热处理步骤是在加入提取缓冲液后很快进行，优选地是随后立即进行，这样确保样品在热处理步骤之前具有所需的pH。例如，加热期或热处理步骤可在加入提取缓冲液后4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短、I小时或更短、30分钟或更短、10分钟或更短或5分钟或更短的时间内进行。因此，本发明的方法可能不需要样品的pH调整的步骤。样品pH可在加入提取缓冲液后检测，维持在所需的pH 6-9范围内。这可能例如为如上文所描述的提取缓冲液的pH适合于将样品PH调整到6-9的情况，例如，其中提取缓冲液具有pH 7. 5-9. 0而热处理步骤随后很快进行。然而，通常由于加入提取缓冲液和热处理步骤之间的时间间隔，除了添加提取缓冲液可能引起的任何PH的调整之外，根据本发明的方法还需要检测并调整样品pH的步骤以确保样品的PH在热处理步骤之前为6-9。在其中的方法包括pH检测和调整的此实施方式中，提取缓冲液的pH可为低于pH8，如 pH 7. 4 或更低，例如为 pH 6. 0-7. 4, pH 6. 5-7. 4 或 pH 7. 0-7. 4，如 pH 6.8。
备选地，在一个优选的实施方式中，提取缓冲液的为pH 7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH
7.5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH 8. UpH 8. 2、pH 8. 3、pH 8. 4、pH 8. 5, pH 8. 6, pH 8. 7, pH 8. 8、pH、8. 9、pH 9.0，最优选地为 pH 8.0。在此实施方式中，样品pH可通过任何合适的方式在所述方法的任何合适的时间得到调整。样品PH可在加入提取缓冲液之前和/或之后进行调整。
在一个实施方式中，样品的pH在加入提取缓冲液之前进行调整。在此实施方式中，如果所述方法包括培养步骤后的离心步骤，则可在离心步骤之前和/或之后进行PH调整步骤。在培养细胞之后，任选地在离心后，样品PH—般较低。例如，样品可能具有的pH为大约pH5. 5。因此，在培养细胞后和任选地在一个或多个附加的步骤如离心后，可调整样品的pH。例如，样品的pH可在加入提取缓冲液前调整到pH 6. 5-8. O、优选地为pH 7. 0-8. O、pH 6. 5-7. 5、pH 6. 6-7. 4、pH 6. 7-7. 3、pH 6. 8-7. 2、pH 6. 9-7. 1，最优选地为 pH 6. 9。在一个其中加入提取缓冲液前的样品pH低于pH 7 (如，为pH6. 9)而所要求的热处理步骤前的样品PH为pH 7-9的实施方式中，样品pH需要通过添加提取缓冲液和/或通过添加提取缓冲液后进行其他的PH调整而进一步提高，使得样品pH在热处理步骤之前为
7-9。在本发明的一个优选的实施方式中，在加入提取缓冲液后、热处理步骤前将样品pH调整到pH6-9。在此阶段，优选地将样品调整到pH 7. 0-9. O、pH 7. 0-8. 5、pH 7. 0-8. O、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH 7. 2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8 或 7. 9，最优选的为 pH 7. 4。在一个实施方式中，在加热期前调整样品的pH。优选地，在加热期前将样品pH调整至pH 7-9、优选地为pH 7-8。备选地或另外地，在加热期中调整样品的pH调整。优选地，在加热期中将样品pH调整到pH6-8，优选地为pH 6-7。在本发明的一个优选的实施方式中，在热处理步骤前，优选地在加热期前，更优选地是在加热期前很短时间将具有pH为7. 4或pH 8的提取缓冲液加入样品并检测样品pH，随后将其调整到PH 7. 4。在其中样品的pH是在加入提取缓冲液后进行检测并在热处理步骤前进行调整的实施方式中，可在加热期开始前检测和调整样品pH。另外地或备选地，可在加热期中检测和调整样品pH。在一个优选的实施方式中，样品的pH是在加热期前立即检测和调整的。另外地或备选地，在加热期的热处理步骤前(任选地包括样品达到所需的高温且热处理步骤开始的时间点)立刻对样品的PH进行检测和调整。在本发明的上下文中，术语“在……前很短时间”优选地表示在加热期之前或在热处理步骤之前30分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短、4分钟或更短、3分钟或更短、2分钟或更短、I分钟或更短、30秒钟或更短、10秒钟或更短、5秒钟或更短、I秒钟或更短的时间内检测样品的pH并将其调整至pH 6-9。术语“在……之前很短时间”还可包括在加热期开始或热处理步骤开始时进行检测和调整的溶液pH。在一个优选的实施方式中，在检测到样品PH为pH 6-9时，(优选地自动)引发加热期和/或热处理步骤。样品的pH可通过如上文所述的任何单一或多重pH调整步骤进行检测和调整。因此，pH可在以下阶段进行调整 只在加入提取缓冲液前； 只在加入提取缓冲液后而在热处理步骤前；或 在加入提取缓冲液前以及在加入提取缓冲液后而在热处理步骤前。在加入提取缓冲液后可多次调整pH，例如调整1、2、3、4或更多次。在一个实施方式中，对样品的pH进行连续调整，优选地在加入提取缓冲液和热处理步骤前之间进行。在一个实施方式中，可在热处理步骤中另外地检测样品的pH并任选地对其进行调整。因此，根据本发明的方法可进一步包括在热处理步骤中调整样品PH的步骤。优选地， 在热处理步骤中将样品的 pH 调整到 pH 6. 0-9. 0、pH 6. 5-8. 5、pH 6. 5-8. 0、pH 7. 0-9. 0、pH
7.0-8. 5、pH 7. 0-8. 0、pH 7. 1-8. 0、pH 7. 5-8. 0、pH 7. 0-7. 8、pH 7. 1-7. 8、pH 7. 1-7. 7、pH
7.2-7. 6、pH 7. 3-7. 5、pH 7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8 或 7. 9。在根据本发明的第二方面，提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将具有pH 7. 5-9. 0的提取缓冲液添加至样品；以及对样品进行热处理步骤。如上文本文第一方面所描述的，提取缓冲液优选地具有pH7. 5-9. O、pH 7. 5-8. 8、pH 7. 5-8. 5、pH 8. 0-9. 0、pH 8. 5-9. 0、pH 8. 6-8. 9、pH 8. 0、pH 8. I、pH 8. 2、pH 8. 3、pH
8.4, pH 8. 5, pH 8. 6, pH 8. 7, pH 8. 8、pH、8. 9或pH 9.0。在本发明的这个方面，检测样品的pH不那么重要。根据本发明的第二方面的方法可包括如本发明第一方面中描述地检测样品PH进行并调整样品pH。然而，包括检测pH或调整pH的步骤并不紧要。在一个实施方式中，根据本发明第二方面的方法不包括检测样品PH的步骤或调整pH的步骤。以下的本发明详述适用于本发明第一和第二方面的实施方式。pH调整试剂及提取缓冲液对pH的调整必须使得热处理步骤中的pH保持/维持在所需的pH6_9的范围内。在一个实施方式中，pH是用碱进行调整的，如无机碱，例如氢氧化钠，或有机碱如
三乙胺或三甲胺。任何合适的试剂可用于调整样品的pH。所述试剂可以为提取缓冲液，或者可在提取缓冲液之前和/或之后加入。典型的可用于调整PH的试剂包含或由一种或多种以下物质组成Na0H、NH40H、硫酸、EDTA、Tris缓冲液。优选地，样品的pH是使用碱(如氢氧化钠或氢氧化铵)进行调整的。在一个实施方式中，提取缓冲液为Tris (羟甲基)甲胺/无水乙二胺四乙酸二钠盐(Tris/EDTA)缓冲液，一般通过加入HCl将其调整至所需的pH。不受任何理论的约束，人们认为Tris和EDTA协同作用使脂多糖(LPS)从大肠杆菌外膜中释放出来。EDTA移除稳定化外膜中的LPS的二价阳离子。人们认为Tris结合于LPS并取代Ca2+和Mg2+。这使LPS分子之间的相互作用降低，因此导致外膜产生通透性增加(Vaara，M. 1992. AgentsThat Increase the Permeability of the Outer Membrane. American Society forMicrobiology56:395-411)。热处理步骤优选地，本发明的方法中的热处理步骤如US 5，665，866 (其内容通过引用并入本文)中详细描述的。热处理步骤通过有助于其他抗体相关材料的移除使得有可能获得可溶的、正确折叠及装配的抗体样品。“正确折叠和装配”的抗体表现为非还原性SDS PAGE上出现的对应于装配的重链和轻链的预期分子量的单一条带。其他抗体相关材料一般为游离的重链和轻链或其部分，以及正确折叠和装配的抗体的部分降解的片段。热处理步骤是通过使样品达到所需的高温而进行。最优选地，热处理步骤是在30°C-70°C的范围内进行的。温度可根据需要或根据进行纯化的抗体的稳定性而选择。在另一个实施方式中，温度在40°C _65°C的范围内，或优选地在40°C _60°C的范围内，更优选地在45°C _60°C的范围内，甚至更优选地在50°C -60°C的范围内，最优选地为在55°C _60°C、58°C -60°C或为59°C。因此，最低的温度为30°C、35°C或40°C，最高温度为60°C、65°C或70。。。优选地，热处理步骤会持续一段长期的时间。热处理的时间长度优选地在1-24小时之间，更优选地为4-18小时之间，甚至更优选地在6-16小时之间，最优选地在10-14小 时或10-12小时之间，例如为12小时。因此，热处理的最短时间为1、2或3小时，最长为20,22或24小时。在一个具体的实施方式中，热处理在50°C -60°C下进行10-16小时，更优选地在59°C下进行10-12小时。本领域技术人员会理解的是，温度和时间可为适应要处理的样品及生产中的抗体的特征而选择。在一个实施方式中，根据本公开的方法不包括在进行热处理步骤之前的将细胞维持在控制条件下的预处理步骤。在一个优选的实施方式中，本发明提供了用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品及将提取缓冲液添加至样品，以及在40°C _70°C的范围内(优选地为59°C)对样品进行长达15小时(优选地为10-12小时)的热处理步骤；其中在热处理步骤前(优选地为在加热期前很短时间)监视并调整样品的PH以使样品的pH为pH 7-8，优选地为pH 7.4。优选地，将具有pH为7. 4或8. 0的提取缓冲液加入样品。优选地，热处理步骤在设定为合适的RPM的摇床上进行，如200RPM。然而，合适的RPM要根据所述方法的规模而变化。发酵培养宿主细胞样品的步骤可包括任何所需规模的发酵。在本发明的方法中，样品可以为发酵产物包括细菌，尤其是革兰氏阴性细菌，或酵母、细胞培养物，例如但不限于哺乳动物或昆虫细胞培养物。最优选地，样品为发酵产物，包括表达重组抗体的大肠杆菌，其中产生的所述抗体可以为功能性和非功能性抗体的混合物。如有需要,宿主细胞可从发酵培养基中收集，例如，宿主细胞可通过离心、过滤或通过浓缩收集自样品。具体而言，本发明的方法适合于具有治疗性质量的抗体的大规模工业制造。其他步骤根据本发明的方法可包括一个或多个其他步骤。在一个实施方式中，根据本发明的方法包括培养步骤后的离心步骤，随后通过加入提取缓冲液重悬细胞。所述方法可以另外包括初级纯化方法如过滤及/或离心。流化床色谱也包括在内。优选的下游纯化方法包括离子交换色谱、微滤、超滤、渗滤以及固定床捕获和膨胀床捕获，以及这些的任何组合。非裂解性处理步骤所述方法可进一步包括在使样品进行热处理步骤之前对样品进行非裂解性处理步骤。此步骤还可称为均质化步骤(均化步骤)。非裂解性处理步骤可进一步增加所分离或获得的功能性抗体的产量并简化大规模的样品处理。裂解导致粘稠度的增加，这可在对功能性抗体的下游加工和纯化中产生问题。具体而言，宿主细胞的裂解导致宿主细胞蛋白质的释放，使得纯化变得更耗费时间和金钱，因为可能需要更多的纯化步骤且/或需要更大量的色谱材料以达到所需的纯度。宿主细胞DNA几乎全部释放增加了样品的粘稠度，引起过滤和离心的困难，这是澄清过程中蛋白质损失的主要原因。裂解的样品(即，含有宿主细胞蛋白质和DNA的样品)还可引起色谱材料的阻塞。优选地，如WO 2006/054063(其内容通过引用并入本文)中所描述的方法进行非裂解性处理步骤。如WO 2006/054063所描述的，非裂解性处理步骤包括不产生细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞或其他用于重组抗体表达的生物体(如大肠杆菌)的相当大的比例的裂解的任何处理。在一个最优选的实施方式中，·非裂解性处理包括压力处理。备选地，非裂解性处理包括摇动或搅拌等预调节步骤。“相当大的比例”包括发酵物或培养物中80%或更多比例的生物体以完整形式存在，更优选地为超过85%，甚至更优选地为超过90%，最优选地为95%或更多为完整形式。裂解可以以任何本领域已知的方式进行判断，包括通过显微镜下观察、荧光激活细胞分选(FACS)分析及对总蛋白质相比于上清和/或生物体(细胞)沉淀中的蛋白质的测定。在一个实施方式中，可在非裂解性处理后通过比较处理前后的样品中总蛋白质而判断是否有裂解发生。如果处理引起了裂解，经处理的样品上清中存在的总蛋白质相比于所述未处理样品中存在的总蛋白质的量会增加，例如使用Bradford测定法进行测量。在一个优选的实施方式中，进行FACS分析，其中将样品用荧光染料进行标记随后进行非裂解性处理及FACS分析。最优选地，在处理前进行FACS分析以给出用于比较的基线值。因此，非裂解性处理可包括在例如缓冲液中，通过在一段时间内进行轻柔的重悬进行预调节，例如通过摇动或搅拌，或通过手动重悬如通过枪头吹打。在一个实施方式中，预调节要进行1-24小时，更优选地为I小时-20小时，更优选地为2小时-18小时、4小时-16小时、6小时-16小时，最优选地为12、14或16小时。因此，预调节的最短时间为1、2或4小时而最长时间为16、18或24小时。预调节可通过以50-250rpm旋转而进行、优选地以60rpm-100rpm，并且最优选地进行14或16小时。在预调节过程中，细胞维持在4°C -30°C的温度范围内，更优选地为4°C -20°C之间，最优选地为维持在室温。在一个实施方式中，预调节步骤不包括加工的部分。在一个优选的实施方式中，非裂解性处理包括使宿主细胞经受高压，例如使用法式压滤或氮减压。在一个特异性实施例中，样品为大肠杆菌发酵产物，所述大肠杆菌表达重组抗体，其在法式压滤中受到压力处理。压力范围可为750psi或附近到5000psi或附近。在一个实施方式中，压力处理是在 IOOOpsi 或 1250psi、1500psi、1750psi、2000psi、2250psi、2500psi、2750psi、3000psi、3250psi、3500psi、4000psi、4250psi、4500psi 或 4750psi 下进行的。更优选地，压力处理是在1000psi-3000psi进行的，最优选地在2000psi下进行。压力处理几乎是非裂解性的(即，少于20%的裂解)，可通过简单的实验而确定，取决于缓冲液和包含样品的细胞类型，以及压力。在本发明的一个实施方式中，所述方法不包括如上文所描述的非裂解处理步骤，如使宿主细胞受到增加的压力或在一段时间内通过轻柔的重悬进行预调节。已知包括这样的非裂解性处理步骤能够提高重组蛋白质的产量(W0 2006/054063)。然而，我们惊人地发现是通过包括或不包括这种非裂解性处理步骤的本发明的方法达到抗体产量的提高。因此，在其中的方法不包括非裂解性处理步骤的实施方式中，本发明提供了制造重组抗体的更简化节约的方式。稳定步骤在一个实施方式中，根据本发明的方法包括在培养宿主样品步骤和加入提取缓冲液之间中断所述方法的步骤。在中断步骤中，将样品稳定在合适的温度下。优选地，按WO2005/019466中所描述的方法进行中断所述方法的该步骤。此步骤还可称为细胞浆稳定步骤(CSH)。优选地，所述方法至少被中断一个小时、I小时-72小时、12小时-48小时、12小时、24小时、33小时或48小时的阶段。 优选地，在所述方法的中断过程中将样品稳定在合适的温度下，如18°C。在本发明的一个实施方式中，所述方法不包括在培养宿主细胞样品步骤后的中断步骤，如WO 2005/019466中所描述的。已知包括这样的中断能提高重组蛋白质的产量(W02005/019466 )。我们惊人地发现是通过包括或不包括这种中断步骤的本发明的方法达到抗体产量上类似的提高，即当在所述方法中包括中断步骤时没有观察到产量的进一步增加。因此，在其中的方法不包括中断步骤的实施方式中，本发明提供了制造重组抗体的更简化节约的方式。因此，在一个实施方式中，培养宿主细胞样品的步骤和加入提取缓冲液的步骤之间的时间段少于12小时，优选地为10小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、2小时或更少、I小时或更少或少于I小时。抗体如本文所使用的，“功能性抗体”包括保留了特异性识别或结合于同源抗原(这些抗体是针对其而产生的)的能力的抗体分子。功能性抗体的产生表现为非还原性SDS-PAGE上出现的对应于所述抗体的预期分子量的单一条带或通过使用BIAcore或其他本领域技术人员已知的方法进行直接测定，例如但不限于ELISA。非功能性抗体包括不识别其同源抗原的片段，并包括不正确折叠或不正确装配的抗体、游离重链和轻链及其片段，包括抗体的不识别或结合于其同源抗原的部分降解片段。在一个优选的实施例中，重组抗体分子为至少部分的抗体轻链和至少部分的抗体重链，这样使得至少一些所表达的轻链和重链抗体分子能够组合形成功能性抗体。如本文所使用的，“抗体”包括具有全长重链和轻链的抗体；其功能性活性片段、衍生物或类似物，并可以为但不限于VH、VL、VHH、Fab、修饰的Fab、变化的铰链区Fab、Fab’、F(ab’)2 *Fv片段；轻链或重链单体或二聚体；单链抗体如单链Fv，其中重链和轻链可变结构域通过肽连接子相连，或双特异性抗体，如Fab-dAb，如PCT/GB2008/003331中所描述。抗体可为多克隆、单克隆、二价、三价或四价抗体、人源化或嵌合抗体。这些抗体及其片段可以是天然发生的、人源化的、嵌合的或CDR移植抗体，如有需要，可使用标准分子生物学技术修饰、添加或删除氨基酸或结构域。人源化抗体为来自非人物种的抗体，其具有一个或多个来自所述非人物种的互补决定区(CDR)以及来自人的免疫球蛋白分子的骨架区(见，例如US 5，585，089)。使用本发明的方法纯化的抗体分子可为免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类。用于产生这些抗体分子的方法在本领域已知(见例如，Shrader等人，WO 92/02551 ;Ward 等人，1989，Nature, 341: 544 ; Orlandi 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833;Riechmann 等人，1988，Nature, 322:323;Bird etal,1988，Science,242:423;Queen 等人，US5,585，089;Adair, W091/09967;Mountainand Adair, 1992，Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1-142;Verma 等人，1998，Journal ofImmunological Methods, 216:165-181)。单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(Kohler&Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983, Immunology Today, 4:72)及 EBV-杂交瘤技术(Cole 等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc.，1985)。嵌合抗体为由经过遗传改造的免疫球蛋白基因编码的那些抗体，所述遗传改造使 得轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段组成。这些嵌合抗体的抗原性可能较低。二价抗体可通过本领域已知的方法产生(Milstein等人，1983，Nature 305:537-539;TO93/08829, Traunecker 等人，1991，EMBO J. 10:3655-3659)。二价、三价和四价抗体可包括多重特异性，或为单特异性(见例如W092/22853)。抗体序列还可使用单一淋巴细胞抗体法生成，其基于产生自被选择用于生产特异性抗体的单一淋巴细胞的免疫球蛋白可变区cDNA的分子克隆和表达，如Babcook，J.等人，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15) :7843-7848及TO 92/02551 中所描述的。后者的方法依赖于个别产生抗体的细胞的分离，然后将其进行克隆扩增，随后筛选出产生识别其同源抗原的抗体的克隆，如果需要，随后对其可变重链(Vh)和轻链(')基因的序列进行鉴定。备选地，可在筛选后将产生识别其同源抗原的抗体的细胞一起培养。使用本发明的方法制备的抗体最优选地为人源化抗体，其随后可连接于毒素、药物、细胞毒性化合物或多聚体或其他化合物，这些可延长抗体在施用于患者后的半衰期。抗体可特异于任何靶标抗原。抗原可以为细胞结合的蛋白质，例如细胞(如细菌细胞、酵母细胞、T-细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白质或可溶性蛋白质。目的抗原还可为任何医疗相关蛋白质，如在疾病或感染中上调的蛋白质，例如受:体和/或其对应的配体。细胞表面蛋白质的具体实例包括粘附分子，例如整合素如P I整合素，例如VLA-4、E-选择素、P 选择素或 L-选择素、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、I COS, BCMP7、CD137、CD27L、CDCPU CSFl 或 CSFl-受体、DPCRU DPCRU dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK, MAL2、MRP2、nectin_like2、NKCCI、PTK7、RA IGI、TCAMI、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、甲胎蛋白抗原(CEA )、人乳脂肪球蛋白(HMFGl和2)、I型MHC和II型MHC抗原、KDR和VEGF，恰当时还包括其受体。可溶性抗原包括白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17如IL17A和/或IL17F，病毒抗原如呼吸道合胞体病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE、干扰素如a干扰素干扰素或Y干扰素，肿瘤坏死因子TNF(先前称为肿瘤坏死因子-a )，肿瘤坏死因子，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF,及血小板衍生生长因子如H)GF-a和TOGF-P，在恰当时还包括其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒如流感病毒，EBV, HepA, B和C，生物恐怖主义试剂、放射性核素和重金属，以及蛇和蜘蛛的毒液和毒素。在一个实施方式中，抗体可用于功能性地改变目的抗原的活性。例如，抗体可以直接或间接地中和、拮抗或激动所述抗原的活性。在一个优选的实施方式中，抗体为抗-TNF抗体，更优选地为抗-TNF Fab’，如W001/094585中所描述的(其内容通过引用并入本文)。用于表达重组蛋白质的方法在本领域已知。用于表达重组抗体分子的宿主细胞合适的实例包括细菌如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌，或酵母细胞，例如啤酒酵母(S. Cerevisiae)或哺乳动物细胞，例如CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系，例如NSO细胞。最优选地，在本发明的方法中，重组抗体在细菌如大肠杆菌中生产(见Verma等人，1988，J. Immunol. Methods 216:165-181;Simmons 等人，2002，J. Immunol. Methods263:133-147)。
细胞本发明中所使用的术语“样品”指的是用编码重组抗体分子的表达载体转化的细胞的群体。样品可具有任何合适的规模，从小规模抗体生产到用于商业目的的大规模抗体制造。本发明中所使用的细胞可以为例如但不限于细菌(尤其是革兰氏阴性细菌)、酵母、哺乳动物或昆虫。最优选地，细胞为大肠杆菌。细胞可以为野生型细胞或经过遗传工程改造的重组细胞。大肠杆菌宿主细胞可以为天然发生的大肠杆菌菌株或能够产生重组蛋白质的突变菌株。具体的宿主大肠杆菌菌株的实例包括此4100、了61、了62、0耶4、0册[1、0111、BL2UK12,XLlBlue和JM109。一个实例为大肠杆菌W3110 (ATCC 27，325)，一种常用的用于重组蛋白质发酵的宿主菌株。实例还包括修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体和蛋白酶缺陷菌株。使用本发明的方法生产的重组抗体通常在大肠杆菌宿主细胞的细胞周质中或在宿主细胞培养物上清中表达，取决于蛋白质性质及生产规模。用于使蛋白质靶向这些区室的方法在本领域已知，综述见 Makrides, Microbiological Reviews, 1996,60,512-538。将蛋白质引入大肠杆菌细胞周质的合适信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可通过依赖于天然分泌途径或通过诱导外膜的限制性渗漏引起蛋白质分泌将蛋白质靶向上清，实例为使用PelB前导序列，蛋白质A前导序列，与菌素释放蛋白质，表达丝裂霉素诱导的菌素释放蛋白质共表达并向培养基中加入甘氨酸，以及与膜通透性相关的kil基因共表达。最优选地，在本发明的方法中，重组蛋白质表达于大肠杆菌的细胞周质中。重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的表达还可以受到可诱导系统的控制，从而重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的表达还可以受到可诱导启动子的控制。很多可用于大肠杆菌的可诱导启动子在本领域已知，根据启动子的性质，重组蛋白质的表达可由不同因子诱导，如温度或生长培养基中特定物质的浓度(Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421;Goldstein and Doi, 1995, Biotechnol. Annu. Rev, 105-128)。可诱导启动子的实例包括大肠杆菌lac、tac和trc启动子，其受到乳糖或不可水解的乳糖类似物，异丙基-D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导，以及phoA、trp和araBAD启动子，其分别受到磷酸、色氨酸和L-阿拉伯糖的诱导。表达可由例如加入诱导子或温度变化(当诱导依赖于温度时)而诱导。在向培养物添加诱导子而实现重组蛋白质表达的诱导的情况下，可通过任何合适的方法加入诱导子，取决于发酵系统和诱导子，例如，通过单次或多次添加或通过给料逐步加入诱导子。应当理解的是，在加入诱导子和蛋白质表达的实际诱导之间可能有延迟，例如诱导子是乳糖时，当任何已存在的碳源都在乳糖之前被使用时可能在对蛋白质表达的诱导前发生延迟。大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可在任何支持大肠杆菌生长及重组蛋白质表达的培养基中培养。培养基可以为任何化学限定培养基，如Pirt S. J. (1975)在Principlesof Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications 中提供的那些培养基，在恰当的时候可加以修饰以控制生长速率，如本文所描述的。合适的培养基的实例为 “SM6E”,如 Humphreys 等人，2002，Protein Expression and Purification, 26:309-320所描述的。大肠杆菌宿主细胞的培养可在任何合适的容器如摇瓶或发酵罐中进行，取决于所 需的生产规模。有多种大规模发酵罐可用，具有的容积为超过1，000升直到大约100，000升。优选地，使用的是1，000-50, 000升的发酵罐，更优选地为1，000-10, 000或12，000升。还可使用较小规模的发酵罐，容积为0. 5-1，000升。大肠杆菌的发酵可在任何合适的系统中进行，例如在连续、批式或料批式发酵系统(Thiry&Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105),取决于所需的蛋白质及产量。使用批式发酵时，可在需要的时候一次性加入营养物质或诱导子。备选地，可使用料批式培养，在诱导前以批式发酵生长的培养物具有最大的特异性生长速率，可使用发酵罐中起始存在的营养物质以及用于控制生长速率的一种或多种加料规则维持培养物生长直到发酵完成。还可在诱导前使用料批式发酵以控制大肠杆菌宿主细胞的代谢，并可以达到较高的细胞密度(Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105)。本发明的各个实施方式的优选特征为其他实施方式加上必要的变更的结果。所有出版物，包括但不限于本说明书中引用的专利和专利申请都通过引用并入本文，对每项出版物都具体地、分别地提到并通过引用并入本文，虽然在前面已经整体地提到这一点。在一方面，提供了从所述方法中获得或可获得的抗体。在一方面，提供了 pH控制工具如缓冲液的用途，用于改善抗体的提取，例如初级提取的用途，尤其是在其中所述控制确保提取步骤如热提取步骤中的PH维持在pH 6-9的的范围内。如本文所采用的pH控制工具为缓冲液、碱和/或酸。本发明现在将参考以下实施例进行描述，这些实施例仅仅是说明性的，不在任何意义上被认为会限制本发明的范围。图I的图显示了重悬于pH 7. 4和pH 8的Tris/EDTA提取缓冲液的细胞在一段时间内的pH。图2a为直方图，显示了提取缓冲液的pH对抗体A的产量的影响。图2b为直方图，显示了刚刚加入具有pH 7. 4-9. 0的提取缓冲液后细胞样品(重悬的细胞浆)的PH以及细胞样品在加入所述缓冲液I小时后而在加热期前的pH。
图3a为直方图，显示了在热处理步骤前调整样品pH对抗体A产量的影响。每条上方的数字表示相比于无PH调整步骤的对照的产量的增加百分比。图3b的图显示了样品在所述方法的多个阶段的pH变化细胞浆(培养和离心后)；添加缓冲液后(刚刚添加提取缓冲液后);PH调整前；pH调整后，加热期前；以及热处理步骤后。图4显示了热处理后提取自细胞的抗体A样品的SDS-PAGE分析。泳道I为分子量标记物，泳道2为抗体A样品，泳道3为无pH调整的样品，泳道4-8显示了热处理步骤前pH分别调整至7. O、7. 2、7. 4、7. 6和7. 8后的样品。图5为直方图，显示了使用pH 8的提取缓冲液并在热处理步骤前将样品pH调整至pH 7. 4对抗体A的产量的影响。图5还显示了包括有均质化步骤或细胞浆稳定步骤的 影响。每条上方的数字表示相比于有均质化但无PH调整步骤的对照的产量的增加百分比。图6显示了热处理后提取自细胞的抗体A样品的SDS-PAGE分析。泳道I为分子量标记物；泳道2为抗体A样品；泳道3为均质化步骤后但不经pH调整也不经细胞浆稳定的样品；泳道4为用pH 8的提取缓冲液处理后并在热处理前调整到pH7. 4，并且经过均质化步骤而不经过细胞浆稳定的样品；泳道5为不经pH调整、不经均质化、不经细胞浆稳定的样品；泳道6为用pH 8的提取缓冲液处理后并在热处理前调整到pH7. 4，并且不经过和均质化和细胞浆稳定的样品；泳道7为细胞浆稳定步骤后但不经pH调整、不经均质化的样品；泳道8为用pH 8的提取缓冲液处理后并在热处理前调整到pH7. 4，并且经过细胞浆稳定而不经过均质化的样品。图7为图，显不了一段时间内的样品的pH,分别为未经pH调整的对照样品、用pH8的提取缓冲液的处理的样品、用pH 7. 4的提取缓冲液处理并在热处理步骤前将样品pH调整到PH 7. 4的样品以及用pH 8的提取缓冲液处理并在热处理步骤前将样品pH调整到pH7. 4的样品。第一个峰表示加入提取缓冲液的点，第二个峰显示两个样品的pH在热处理步骤之前受到调整的点。图8为直方图，显示未经pH调整的对照样品、用pH 7. 4的提取缓冲液处理并在热处理步骤前将样品PH调整到pH 7. 4的样品、用pH8的提取缓冲液处理的样品以及用pH 8的提取缓冲液处理并在热处理步骤之前将样品PH调整到pH 7. 4的样品对抗体A的产量的影响。每条上方的数字表示相比于未经PH调整的对照的产量的增加百分比。图9为直方图，显示未经pH调整的对照样品、用pH 7. 4的提取缓冲液处理并在热处理步骤之前在加热期中将样品pH调整到pH 7. 4的样品以及用pH 8的提取缓冲液处理并在热处理步骤之前在加热期中将样品PH调整到pH 7. 4的样品对抗体A产量的影响。每条上方的数字表示相比于未经PH调整的对照的产量的增加百分比。

图10为直方图，显示pH调整到6. 6,7. 0、7. 4和7. 8单位相比于非pH调整的对照对Fab’滴度的影响。该实验用(提取前)的三种不同预处理步骤(分别为无预处理、细胞浆稳定和均质化)进行重复。
图11为直方图，显示以下条件下的平均Fab’滴度无pH调整、无预处理并进行pH调整(至6. 6-7. 8单位的范围)、均质化和pH调整(至6. 6-7. 8单位的范围)以及所有的pH调整条件(均质化且无预处理)。误差线显示平均值的标准偏差。一般方法在以下实施例中，除非另有说明，所述方法按如下进行细胞培养步骤和离心使用具有编码抗体A的DNA插入的载体pTTOD在大肠杆菌W3110细胞中表达抗体A (Fab’)。在用乳糖诱导后于25°C下进行30小时的发酵以备收获。50ml或IL的收获培养物试样在4°C下以4200RPM离心I小时。弃去上清，为模拟生产规模的澄清过程，将一小部分上清加入细胞使得产生的细胞将样品占收获重量的35%。 细胞浆稳定步骤(CSH):在一些实验中进行细胞浆稳定步骤，其中在加入提取缓冲液前将样品在18°C及200RPM下稳定33小时。提取缓冲液的添加将300mM Tris和30mM EDTA的储备液配制成终浓度为IOOmMTris和IOmM EDTA,用盐酸调整至PH7. 4，用其重悬所产生的细胞浆样品(此后称为样品)。在下文描述的试验中，将该提取缓冲液的PH从对照的pH 7. 4调整到更高的pH水平，为pH 7. 4-9. 0之间。均质化步骤(均化)在一些实验中，在加入提取缓冲液后通过使样品在1500psi下单次通过以进行均质化步骤。加热期前的pH调整在一些实验中，在加热期开始之前用5M NaOH将样品的pH调整到所需的水平，在7. 0-7. 8 之间。加热期使样品经受加热期，其中样品的温度从18°C升高到所需的59°C高温，在此温度下开始热处理步骤。加热期期间的pH调整在一些实验中，在加热期中用5M NaOH将样品的pH调整到所需的水平，为7. 4±0. 02，直到达到的所需的59°C高温。热处理步骤将样品在59°C、200RPM下稳定10-12小时。在热处理后，通过在4°C下以4200rpm离心I小时澄清重悬的细胞沉淀。在20mM的磷酸缓冲液中使用蛋白质G HPLC分析对含有功能性抗体A的上清中的Fab’进行测定。使用注射时pH 7. 0减少到pH2. 5的pH梯度溶液洗脱抗体A。还原的提取样品在Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上分析，上样浓度为大约I U g。实施例I:加入提取缓冲液后对样品pH的影响如一般方法部分中描述的，进行细胞培养步骤和添加提取缓冲液步骤，其中的缓冲液具有PH 8.0或pH 7.4。从添加提取缓冲液时就对样品的pH进行检测。图I显示了在加入缓冲液后样品pH迅速下降，并且pH很快降低到pH 7以下，尤其在缓冲液具有pH为7. 4 时。实施例2:提取缓冲液pH对抗体产量的影响如一般方法部分中描述的，进行细胞培养步骤、添加提取缓冲液步骤、加热期及热处理步骤。未在加热前或加热中进行细胞浆稳定步骤、均质化步骤及pH调整步骤。提取缓冲液的pH 不同值如下:7. 4,8. 0. 8. 1,8. 2,8. 3,8. 4,8. 5,8. 6,8. 7,8. 8,8. 9和9. O。结果显示于图2a，显示了热提取后的Fab’浓度。可见提取缓冲液的pH升高到7. 4以上导致Fab’回收的显著增加，高至pH 8. 8都可使产量增加。8.8以上时Fab’的浓度开始下降。表I
权利要求
1.用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及使样品经历加热期及热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的PH并任选地对其进行调整，以确保在热处理步骤前样品的pH为 6-9。
2.根据权利要求I的方法，其中热处理步骤是在30°C_70°C的范围内进行的。
3.根据权利要求I或2的方法，其中提取缓冲液选自NaOH、NH4OH、硫酸、EDTA、Tris缓冲液及其组合。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中抗体选择性针对选自以下分子的抗原整合素如P I整合素，例如VLA-4、E-选择素、P选择素或L-选择素、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD 134 (0X40)、I COS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、CSFl 或 CSFl-受体、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、nectin-like2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPll、DTD、甲胎蛋白抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、1型MHC和II型MHC抗原、KDR和VEGF0
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中抗体分子选自VH、VL、VHH、Fab、修饰的Fab、变化的铰链区Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段；轻链或重链单体或二聚体；单链抗体如单链Fv,其中重链和轻链可变结构域通过肽连接子相连，以及双特异性抗体,如Fab-dAb。
6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其中将pH调整至确保样品的pH在热处理步骤前为6-9。
7.由权利要求1-6中任何一项限定的方法获得或可获得的抗体。
8.pH控制工具如缓冲液用于改善抗体提取，例如初级提取的用途，尤其是在其中所述控制确保提取步骤，如热提取步骤之前很短时间和/或之中的pH在pH 6-9的范围内。
全文摘要
本发明公开涉及用于制造重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品；将提取缓冲液添加至样品；以及使样品经历热处理步骤；其中在添加提取缓冲液后检测样品的pH，并任选地对其进行调整，以确保在热处理步骤前样品的pH为6-9。
文档编号C07K16/00GK102812042SQ201180014155
公开日2012年12月5日 申请日期2011年2月2日 优先权日2010年2月3日
发明者J-P·P·比尔基斯舍尔, P·J·巴塞特, M·R·皮尔斯-黑金斯, A·J·肯尼 申请人:Ucb医药有限公司