用于改善蛋白质生产的方法和组合物的制作方法

专利名称：：用于改善蛋白质生产的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有益于培养真核细胞的组合物及其用途，和使用它们促进细胞生长、生存力和重组蛋白表达的方法。
背景技术：
：研究生物学过程经常需要在构成上比完整生物体小的细胞、组织和器官中检验那些过程。许多年来，这些细胞、组织和器官已经从生物体中分离并且在离体或体外模型中在支持它们存活的条件下独立地加以研究。一般而言，从生物体中取出细胞、组织或器官并且将其在支持存活和/或被研究的生物过程的培养基中维持。鉴于丰富多样的细胞、组织和器官类型，在完整生物体外部支持其存活、生长和生物特性的培养基的配方不是无价值的。出于没有完全理解的原因，许多细胞和组织难以在培养下维持。此外，细胞和组织经常用于以下过程中，所述过程涉及体外制造对于生物医学研究和基于生物制品的药品为关键的重组蛋白、疫苗、病毒原液和其他产品。因此，需要识别支持细胞、组织和器官培养物在体外和离体条件下生长和存活的条件和培养基组分。此类细胞组分包括例如，白蛋白、转铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶、乳铁蛋白和生长因子。白蛋白是血浆中存在的最丰富的蛋白质。它在哺乳动物中由肝脏产生并且在多种能力方面发挥作用。白蛋白是一种可溶性单体蛋白质，其包含约一半的血清蛋白。白蛋白主要作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白发挥作用并且在稳定细胞外液容量方面发挥作用。白蛋白是分子量67，000的球状非糖基化的血清蛋白并且含有5个或6个内部二硫键。白蛋白作为前白蛋白合成，所述前白蛋白具有在新生蛋白质从糙面内质网释放之前移去的N端肽。产物白蛋白原依次在高尔基囊泡中经切割以产生分泌型白蛋白。白蛋白对于维持体液在血管内区室和身体组织之间适当分布所需要的渗透压是必需的。它还通过非特异性结合几种疏水性类固醇激素充当血浆载体并且作为氯高铁血红素和脂肪酸的转运蛋白。牛血清白蛋白(BSA)已经长期用作细胞培养基中的补充物，因为它是常以1-20%总体积添加至基础培养基的胎牛血清(FBS)的组分。BSA是众多确定无血清培养基配方中的主要组分，原因是它是容易大批获得的，相对便宜并且可以相对容易地纯化至均一。白蛋白的代表性来源包括例如源自牛、马、猪和其他哺乳动物物种的血浆。随着用于人类临床使用的重组蛋白、疫苗和其他产品的大规模生产的来临，已经对生产这些产品时所用的配方提出更严格要求。因为动物源材料携带可能影响产品安全性的病原体的威胁，已经调整许多现存的重组生产工艺，从而整个过程中所用的全部材料或培养组分避免动物源产物。即，细胞培养组分已经不能从完整动物来源分离或纯化。因此，作为从完整动物直接纯化出这些补充物的替代，优选重组产生培养基补充物。因此，使用重组手段，使用保证无病毒和毒素的确定成分的组织培养培养基以及高度表征的组织培养细胞，可以制造人和来自其他物种的细胞培养组分。一种基于细胞培养组分制备重组蛋白的方法是工程化酵母或植物以过量表达这种蛋白质并且随后纯化这种蛋白质。作为用于意在治疗性使用的人蛋白质的重组蛋白生产细胞培养组分的来源，植物衍生的重组蛋白是特别有吸引力的，因为没有植物病毒也可以感染人的实例。目前迫切需要支持重组产生人治疗用蛋白质以及培育和分化干细胞的重组细胞培养组分，并且随着此类产品在市场上的继续成功和巨大潜力，产生重组细胞培养组分的更有效方式是合乎需要的。特别是，用于重组产生蛋白质和培育及分化干细胞的现有方法是缓慢、昂贵和费力的。这些方法分别部分地受到涉及细胞生长速率和重组宿主细胞或干细胞生存力的基本方面限制。这些限制的关键方面包括i)从细胞的复杂混合物中快速分离和扩增单一细胞克隆的能力，ii)促进快速细胞生长的能力，尤其在低密度和在无血清培养基中，iii)在生物反应器中以极高密度维持细胞生长和生存力的能力，iv)冷冻保存、解冻细胞和细胞库同时维持高生存力的能力，V)有效培育和分化干细胞培养物的能力。因此，需要满足这些需求和使培养细胞的生长和生存力能够改进的改良培养基和培养条件。通过改善生存力和细胞生长的速率，本发明的补充物和方法满足这些需求并且也可以导致从哺乳动物细胞培养生产过程获得的重组产物有改善的产率和质量。
发明内容本发明部分地基于以下展示在添加至培养中培育的哺乳动物细胞时，植物衍生的重组细胞培养组分蛋白令人惊讶地增强细胞的生长和生存力至大于标准纯化蛋白质的程度。此类植物衍生的细胞培养组分可以用来产生在组织和细胞培养中有用的补充物。本申请中公开的方法和补充物，例如，用于改善细胞生存力和加速培养中培育的细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高从细胞培养物中产生的重组蛋白的产率。下文详细描述由本发明提供的进一步改善。在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，所述方法包括在转染之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善冷冻保存后的细胞生存力的方法，所述方法包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。在一个实施方案中，本发明包括一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，所述方法包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物。在重组细胞生产方法的一个方面，培养细胞的生存力增加。在这些方法中的任一个方面，补充物包含重组白蛋白；其中所述重组白蛋白在植物中产生，其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg的白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。在这些方法中的任一个方面，细胞是原代细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是干细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是组织培养细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是血液细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是原代单核细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是CHO细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是杂交瘤细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是Vero细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞由流式细胞术分选。在这些方法中的任一个方面，细胞是通过梯度离心分离的原代细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是B细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是T-细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞由流式细胞术分离。在这些方法中的任一个方面，细胞由微流体装置分离。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约O.01%wt/wt的热休克蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白是稻热休克蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白选自稻HSP70基因和稻胚乳腔结合蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白选自稻(gbIACJ54890.11)、EEC69073/0sI_37938和AAB63469。在这些方法中的任一个方面,补充物包含至少约O.01%wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约O.04%wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约O.06%wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约O.08%wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面,补充物包含至少约O.1%wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约100mg/L和约200mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约200mg/L和约400mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约400mg/L和约600mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约600mg/L和约800mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约800mg/L和约1000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约1000mg/L和约2000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约2000mg/L和约5000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约5000mg/L和约10000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面,补充物包含添加至约10000mg/L和约20000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于10%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于15%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于20%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于25%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于30%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于40%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于50%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于60%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于70%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于80%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于90%。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于100%。可以通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述，获得对本发明特征和优点的更好理解，在所述实施方案中使用本发明的原理，并且其附图是图I显示通过HPLC大小排阻层析比较从稻产生的重组白蛋白和其他来源的白蛋白以及纯化的方法。图IA显示血清源(非重组)白蛋白的层析图。图IB显示使用“老方法"B000纯化所产生的稻重组白蛋白(CellastimP0107)的层析图。图IC显示使用“新方法”B0000C纯化所产生的稻重组白蛋白(CellastimP0171)的层析图。图ID显示血清源白蛋白(1A;虚线)和使用新方法制备的CellaStim((lC;实线)的层析图的重叠。图IE显示使用老方法B000制备的Cellastim(CellastimP0107)(IB;虚线)和使用新方法B0000C制备的Cellastim(CellastimP0171)(1C;实线)的层析图的重叠。图2比较显示了通过SDSPAGE分析的从稻产生的重组白蛋白和其他来源的白蛋白以及纯化的方法。图2A显示CellastimP0171和Cellprime白蛋白(Millipore/Novozymes)的比较。泳道I是分子量标记。泳道4是Cellastim白蛋白(IOyg)并且泳道7是Cellprime白蛋白(10μg)。图2B比较显示了通过SDSPAGE分析的来自先前方法(B000)(泳道2、3和4)和新Cellastim方法(B0000C)(泳道6、7和8)的3个Cellastim批次。这六份样品以20μg/泳道上样。图3:显示酵母重组白蛋白(Cellprime)、人源白蛋白(Seracare)和植物重组白蛋白(CellastimP0171)对细胞生长和生存力的影响的比较(图3A)。图3B显示在使用重组白蛋白生产的老方法(B000)和新方法(B0000C)所产生的分批白蛋白中内毒素水平的比较。图3C显示细胞的细胞生长和生存力的比较，所述细胞在使用重组白蛋白生产的老方法(B000)和新方法(B0000C)所产生的Cellastim存在下培育。图4:显示使用抗热休克蛋白抗体的蛋白质印迹，以显示在ATP亲和层析后从重组白蛋白获得的不同级分的热休克蛋白含量。(见实施例3)图5:显示在使用新方法所产生的白蛋白通过ATP亲和柱以除去热休克蛋白后Cellastim重组白蛋白的细胞生长和生存力影响的比较。(详见文字)。图6A显示CHO-Kl在未补充和补充培养基的摇瓶中的生长曲线。图6B显示在未补充和补充的培养基中CHO-Kl的活细胞百分比。图7A:显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶中培育的CHOKl细胞的比净生长速率。图7B显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶内培育的CHOKl细胞的比净死亡速率。图8A显示在未补充和补充的培养基中(在第4日添加营养进料)的生存力细胞密度。图8B显示在未补充和补充的培养基中(在第4日添加营养进料)CHO-Kl的活细胞百分比。图9A:显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶(在第4日以营养进料强化)中培育的CHOKl细胞的比净生长速率。图9B显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶(在第4日以营养进料强化)中培育的CHOKl细胞的比净死亡速率。图9C显示在有补充物的培养基的摇瓶中增加的抗体浓度。图IOA显示在加料时不良事件后生物反应器中CHOKl的生长曲线。针对250mg/LCellastim条件运行两个生物反应器。图IOB显示在加料时不良事件后生物反应器中CHOKl的活细胞百分比。针对250mg/LCellastim条件运行两个生物反应器。图IlA显示在补充和未补充对照培养基(在第3日和第7日强化营养)的生物反应器中CHOKl的生长曲线。显示随时间推移的活细胞密度。图IlB显示在补充和未补充对照培养基(在第3日和第7日营养进料)的生物反应器中CHOKl的比生长速率。显示随时间推移的活细胞密度。图12A显示在不良事件后未补充和补充的培养基(在第3日和第7日营养进料)的生物反应器中CHOKl的活细胞百分比。图12B显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中(在第3日和第7日以营养进料强化)培育的CHOKl细胞的比净死亡速率。图13A显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育的CHOKl的pH趋势。图13B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育的CHOKl的渗透压趋势。图14A显不在补充和未补充培养基的生物反应器内培育(在第3日和第7日营养进料)的CHOKl的葡萄糖趋势。图14B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日营养进料)的CHOKl的乳酸趋势。图15A显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日以营养进料强化)的CHOKl细胞的比葡萄糖消耗量。图15B显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日以营养进料强化)的CHOKl细胞的比乳酸产量。图16A显不在补充和未补充培养基的生物反应器中(在第3日和第7日营养进料)由CHOKl产生的产物的浓度。图16B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中(在第3日和第7日营养进料)CHOKl的比生产率。图17A显示通过蛋白A层析法纯化抗体时所使用的方法的示意图。图17B:显示吸光度层析图，其显示平衡、上样、洗涤和洗脱的级分。注意，在代表已纯化抗体的洗脱级分中存在有蛋白质的强峰。图18显示采用考马斯蓝染色的SDS-PAGE，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析法成功移除培养基补充物。图19显示采用银染色的SDS-PAGE，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析法成功移除培养基补充物。具体实施例方式定义为了可以更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述额外的定义。术语“约”或“大约”意指处于由本领域技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内部，这将部分地取决于怎样测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，本领域每次实践，“约”可以意指I或多于I的标准偏差之内。或者，就组合物而言，“约”可以意指加上或减去最多至20%的范围内、优选地最多10%、更优选最多5%。如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”指统计上地显著的增加。为避免不确定，这些术语通常指所给定的参数增加至少10%，并且可以包括至少20%、50%、75%、100%、150%或更多。术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽部分，这些多肽部分结合抗原或与完整抗体(即，与衍生它们的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。可以通过重组DNA技术或通过酶切割或化学切割完整免疫球蛋白产生结合性片段。结合性片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。术语“凋亡”(“正常”或“程序性”细胞死亡)指在发育和其他正常生物学过程期间借以消除不需要或无用的细胞的生理过程。凋亡是在正常生理条件下出现的细胞死亡模式，并且细胞是其自身死亡的积极参与者(“细胞自杀”)。凋亡最经常出现在正常细胞周转和组织稳态、胚胎发生、免疫耐受性的诱导和维持、神经系统发育和内分泌依赖性组织萎缩期间。凋亡也可以在组织培养条件下培育的细胞中应答于应激而触发。经历凋亡的细胞显示特征性形态学特征和生物化学特征，所述特征可以容易地测量和定量。这些特征包括染色质聚集、胞核和胞质凝结、胞质和胞核分割成含有核糖体、形态完整的线粒体和胞核物质的膜结合囊泡(凋亡体)。在体内，这些凋亡体被巨噬细胞或相邻的上皮细胞迅速识别并吞噬。由于体内移除凋亡细胞的这种高效机制，未激发炎症反应。在体外，凋亡体以及剩余的细胞片段最终膨胀并且最后裂解。体外细胞死亡的这种终末期已经命名为“继发性坏死”。如本文所用，术语“细胞”、“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”、和“宿主细胞”可互换地使用，并且包括植物细胞和动物细胞，并且包括无脊椎动物细胞、非哺乳脊椎动物细胞和哺乳动物细胞。全部此类命名均包括细胞群体和子代。因而，术语“转化体”和“转染子”包括原代实验细胞和源自其中的细胞系，无论转移次数是多少。示例性非哺乳脊椎动物细胞包括，例如，鸟类细胞、爬行动物细胞和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括，但不限于如昆虫细胞，例如毛虫(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))细胞、蚊(埃及伊蚊(Aedesaegypti))细胞、果蝇(黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))细胞、施耐德细胞和家蚕(Bombyxmori)细胞。参见,例如，Luckow等人,Bio/Technology6:47-55(1988)。细胞可以是分化的、部分分化的或未分化的，例如，干细胞，包括胚胎干细胞和多潜能干细胞。另夕卜，根据本发明可以使用源自器官或器官系统的组织样品。示例性哺乳动物细胞包括，例如源自人、非人灵长类、猫、犬、羊、山羊、牛、马、猪、兔，包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的啮齿类及其任何衍生物和子代的细胞。术语“细胞培养”或“组织培养”指在如转瓶、组织培养瓶、平皿、多孔平板等的容器中悬浮培育或附着于多种表面或基材上所培育的细胞。术语“细胞培养”也包括大规模方法，如生物反应器，包括在搅拌的酵罐中附着在微载体上生长的贴壁细胞。另外，不仅可以培养接触依赖性细胞，还可以在要求保护的本发明的方法中使用悬浮培养技术。示例性微载体包括，例如，葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维素和如Butler,Spier和Griffiths,AnimalcellBiotechnology3:283-303(1988)中所述的其他微载体。也可以使用多孔载体，例如Cytoline或Cytopore,以及基于葡聚糖的载体,如DEAE-葡聚糖(CytodexI季胺包覆的葡聚糖(Cytodex)或基于明胶的载体,如明胶包覆的葡聚糖(Cytodex3)。本发明包括用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养方法。可以使用的方法包括，但不限于流体床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养或搅拌罐生物反应器系统，伴以或不伴以微载体，并且可选地以批、补料分批或灌注模式操作。术语“细胞培养液”、“细胞培养基”和“培养基”指用于培育、储存、操作和维持细胞和细胞系的溶液。此类溶液通常包括细胞贴附、生长和细胞环境维持必需的多种因子。例如，常见溶液可以包括基础培养基配方、取决于细胞类型和偶而取决于抗生素的多种补充物。在一些实施方案中，溶液可以包括来自以下分类的一个或多个中的至少一种组分I)能源，通常为碳水化合物形式如葡萄糖；2)全部必需氨基酸和通常一套基础的20种氨基酸外加胱氨酸；3)需要在低浓度的维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定义为一般需要在极低浓度(通常在微摩尔范围内)的无机化合物或天然存在的元素。溶液可以任选地补充有来自以下任何分类的一种或多种组分1)激素和其他生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白、和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如，钙、镁、Tris、HEPES和碳酸氢钠；3)核苷和碱基，例如，腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及4)蛋白质和组织水解物。通常，可以使用任何适合的细胞培养基。培养基可以包含血清，例如胎牛血清、小牛血清等。可选地，培养基可以是无血清的、无动物组分或无蛋白质的。在指干细胞培养物时，术语“细胞系”指细胞类型的全部发育阶段，从最早前体细胞至完全成熟细胞(即，特化细胞)。术语“细胞生存力”或“生存力”指在任何给定的时间随细胞群体一起存在的活细胞和死细胞的相对量。细胞生存力可以通过测量该群体的任何给定样品中活细胞和死细胞的相对数目来确定。细胞生存力也可以通过测量整个群体的细胞增殖速率进行估计，所述细胞增殖速率代表细胞生长速率和细胞死亡速率的总体平衡。细胞生长的速率也可以通过计算细胞数目和通过使用直接评定细胞生长速率的无数市售细胞增殖测定法来直接测量。“条件培养基”指从饲养细胞的培养物获得的细胞培养基，其中干细胞可以依赖所述饲养细胞来培养并且维持在多潜能状态。饲养细胞耗尽了条件培养基的一些组分，但也用细胞衍生物质(可能包括少量生长因子)丰富了这种培养基。如本文所用的术语“饲养细胞因子”意指由饲养细胞释放至条件培养基中的细胞衍生物质。释放至细胞培养基中的细胞因子用于增强干细胞的生长，或用于维持胚干细胞处于多潜能状态。饲养细胞因子可以使用本领域技术人员已知和本文描述的技术进行识别和纯化。短语“保守性氨基酸置换”或“保守性突变”指一个氨基酸由具有共同特性另一个氨基酸置换。定义各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。根据此类分析,可以定义氨基酸的组,其中组内的氨基酸优先交换彼此，并且因此在它们影响总体蛋白质结构方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括“由Glu、Asp、Asn、Gin、Lys、Arg和His组成的“带电荷/极性组”；由Pro>Phe>Tyr和Trp组成的“芳香族或环状组”；和由Gly、Ala、Val、Leu、lie、Met、Ser、Thr和Cys组成“脂族组”。在每个组内部，也可以识别出亚组，例如，带电荷/极性氨基酸组可以进一步划分成以下亚组由Lys、Arg和His组成的“带正电荷亚组”；由Glu和Asp组成的“带负电荷亚组”;和由Asn和Gln组成的“极性亚组”。芳香族或环状组可以进一步划分成以下亚组由PiO、His和Trp组成的“氮环亚组”;和由Phe和Tyr组成的“苯基亚组”。脂族组可以进一步划分成以下亚组由Val、Leu和Ile组成的“大脂族非极性亚组”；由Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族轻微极性亚组”;和由Gly和Ala组成的“小残基亚组”。保守性突变的实例包括取代以上亚组中的氨基酸，例如，Lys取代Arg并且反之亦然，从而可以维持正电荷；Glu取代Asp并且反之亦然，从而可以维持负电荷；Ser取代Thr，从而可以维持游离-OH；Gln取代Asn，从而可以维持游离-NH2。术语“细胞毒性”指化学化合物(如化学或蛋白质杂质、去垢剂或毒素)杀死细胞的特性。与坏死和凋亡相反，术语细胞毒性不需要必然指示具体的细胞死亡机制。如本文所用，术语“减少”或相关的术语“减少的”、“降低”或“降低的”指统计上的显著减少。为避免不确定，这些术语通常指给定的参数减少至少10%，并且可以包括至少20%减少、30%减少、40%减少、50%减少、60%减少、70%减少、80%减少、90%减少、95%减少、97%减少、99%或甚至100%减少(S卩,测量的参数是处于零)。如本文所用，术语“发育”、“分化”和“成熟”，作为用来描述干细胞，指细胞从具有分化成至少两个不同细胞谱系的潜能的阶段进展到变成特化并最终变成分化的细胞。为本申请的目的，此类术语可以互换使用。如本文所用的术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞内的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达水平可由基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选择序列编码的所需多肽的量确定。例如，从选择的序列中转录的mRNA可以通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交或通过PCR定量。由选择的序列编码的蛋白质可以通过多种方法定量，所述的多种方法包括，但不限于，例如，ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定、免疫沉淀测定，对这种蛋白质的生物学活性的测定，或通过蛋白质的免疫染色，随后FACS分析来定量。“表达调控序列”是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等等。示例性表达调控序列在Goeddel,GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,Calif(1990)中描述。术语“饲养细胞”指在体外生长并分泌至少一种因子至培养基中，并且可以用来支持培养中的另一种目的细胞生长的细胞培养物。如本文所用，“饲养细胞层”可以与术语“饲养细胞”互换使用。饲养细胞可以包括其中饲养细胞在彼此顶部上生长之前以完整层覆盖培养皿表面的单层，或可以包含细胞簇。术语细胞培养物的“生长期”指其中以恒定速率分裂的细胞指数型生长时期(对数期)。在这个时相期间，将细胞培养一段时间和在细胞生长最大化的此类条件下培养。对特定宿主细胞可确定该宿主细胞生长周期的测定，无需过度实验设想。“一段时间和在细胞生长最大化的此类条件下”等等，指就特定细胞系而言，经确定是用于细胞生长和分裂的那些最佳培养条件。在生长期期间，通常将细胞在约30-40°C，总体上约37°C，在加湿受控的气氛下，在含有必需添加物的营养培养基中培养，从而实现特定细胞系(例如哺乳动物细胞)的最佳生长，例如哺乳动物细胞。术语“同源性”描述基于数学的序列相似比较结果，其用来识别具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，例如，识别其他家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)进行。可以用NBLAST程序，评分=100、字长度=12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对结果，可以使用如Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数。术语“同源的”指拥有“共同进化起源”的两个蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括相同动物物种中来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽等；见Reeck等人，Cell，50:667，1987)。此类蛋白质(和它们的编码核酸)具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论就同一性百分比而言或通过存在的特定残基或基序和保守位置。术语“生长因子”指双调蛋白、血管生成素、B细胞生长因子、(骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-2、人BMP-3、骨形态发生蛋白-4、人BMP-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、人⑶135配体/Flt-3配体、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、人Cripto-Ι、人CTGF(结缔组织生长因子)、人EGF(表皮生长因子)、人EG-VEGF(内分泌腺体衍生血管内皮生长因子)、人促红细胞生成素(EPO)、人FGF(成纤维细·胞生长因子1-23)、人⑶F-11、人⑶F-15、人⑶F-8、人生长激素释放因子(GHRF、GRF、GHRH、生长激素释放激素)、人肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人神经生长因子βI、人胰岛素、人IGF-I(胰岛素样生长因子-I)、人IGF-2(胰岛素样生长因子)、人IGFBP-I(胰岛素样生长因子结合蛋白I)、人IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、肠三叶因子(ITF)、人角质细胞生长因子1&2、人白血病抑制因子(LIF)、人MSP、人肌肉抑制素、人肌肉抑制素、原(肽原)、人NRG1、人NGF、人制癌素M、人成骨细胞特异性因子I(0SF-1、多效蛋白)、人I3D-ECGF(血小板衍生内皮细胞生长因子)、人TOGF、人PIGF、人胎盘生长因子I(PLGFl)、人胎盘生长因子2(PLGF2)、人SCGF_a(干细胞生长因子-a)、人SCGF-b(干细胞生长因子-β)、人干细胞因子(SCF)/⑶117配体、人血小板生成素(ΤΡ0、ΤΗΡ0)、人转化生长因子、人TGF-α(转化生长因子、TGFa)、人TGF-βI(转化生长因子β、TGFb)、人TGF-βI.2(转化生长因子-βI、TGFb)、人TGF-β2(转化生长因子-β2、TGFb)、人TGF-β3(转化生长因子-β3、TGFb)、人VEGF(血管内皮生长因子)、人VEGF-121、人VEGF-165、人VEGF-A。如本文所用，“同一性”意指当排列两个或更多个序列以使序列匹配最大化，即计入空位和插入时，在所述序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可以通过已知方法容易的计算同一'I"生，所述方法包括但不限于在(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编著，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.编著，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著，MStocktonPress,NewYork,1991;以及Carillo,H.,和Lipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)中描述那些方法。设计了确定同一性的方法以产生所检测序列之间的最大匹配。另外，确定同一性的方法编纂于中可公共获得的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序组(Devereux，J.等人，NucleicAcidsRes12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul等人Nuc.AcidsRes.,28:3389-3402(1997))oBLASTX程序是从NCBI和其他来源可公共获得的(BLAST手册，Altschul,S.等人，NCBINLMNIHBethesda,Md.20894；Altschul,S.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。熟知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(本文中可互换使用)一般指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白质，所述链例如由链间二硫键稳定，这种蛋白质具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(本文中可互换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白质，所述链例如由链间肽接头稳定，这种蛋白质具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含有由例如由β_折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含34个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。根据在“恒定区”多类别成员的结构域内部相对缺少序列变异的情况下，或根据在“可变区”多类别成员的结构域内部的显著变异，结构域在本文中还称作“恒定的”或“可变的”。在本领域中抗体或多肽“结构域”经常可互换称作抗体或多肽“区域”。抗体轻链的“恒定区”可互换地称作“轻链恒定区”、“轻链恒定域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定区”可互换称作“重链恒定区”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变区”可互换称作“轻链可变区”、“轻链可变域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变区”可互换称作“重链可变区”、“重链可变域”、“VH”区或“VH”结构域。免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的并且可按单体或多聚体形式存在，例如，以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。术语“片段”指抗体或抗体链中比完整或完全抗体或抗体链包含更少氨基酸残基的局部或部分。片段可以通过化学处理或酶处理完整或完全抗体或抗体链获得。也可以通过重组手段获得片段。示例性片段包括Fab、Fab'>F(ab')2、Fabc和/或Fv片段。用来描述本文中公开的细胞培养组分或热休克蛋白时，术语“分离的”意指已经识别过并且与其自然环境的组分分开和/或从中同收的蛋白质。其自然环境的杂质组分是一般会干扰这种蛋白质的研究、诊断性或治疗性用途，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，蛋白质将被纯化到至少95%均一性，该均一性通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选地使用银染的SDS-PAGE所评估。分离的蛋白质包括在重组细胞内的原位蛋白，因为目的蛋白的自然环境的至少一种组分将不存在。然而，将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。如本文所用的“标记”是在目的细胞中差异性表达的核酸或多肽分子。在这种情境下，差异表达意指增加的阳性标记水平和减少的阴性标记水平。与其他细胞相比，标记核酸或多肽的可检测水平在目的细胞中是足够的更高或更低的，从而可以使用本领域已知的多种方法中任一种识别目的细胞并且与其他细胞区分。表达“胰内分泌谱系标记”的细胞指具有转录因子PDX-I和以下转录因子中至少一种的阳性基因表达的细胞NGN-3、NRx2.2、NRx6.l、NeuroD、Isl_l、HNF-3@、MAFA、Pax4和Pax6。表达胰细胞谱系特征性标记的细胞包括胰β细胞。如本文所用，表达“内胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞sox-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cerl、NodaI、FGF8、短尾蛋白、Mix样同源框蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C_Kit、CD99或0TX2。表达限定性内胚层谱系特征性标记的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和限定性内胚层细胞。通过本发明方法衍生的表达多潜能性标记的细胞表达选自以下多潜能性标记的至少一种ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、0ct4、S0X-2、Nanog,hTERT、UTF-I、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60和Tral-81。如本文所用，表达“中胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、S0X-17、DKK4、HNF-3P、GSC、FGF17、GATA-6。如本文所用，表达“外胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞BMP_4、Noggin、Chordin、0tx2、FoxJ3、Nestin、p63/TP73L、β-III微管蛋白。如本文中可互换使用的术语“有效连接”和“有效连接的”指将两个或更多个核苷酸序列或序列元件以允许它们按照预期方式发挥作用的方式安置。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子包括与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的一个或多个DNA元件。在其他实施方案中，核酸分子可以额外地包括一个或多个核苷酸序列，其选自(a)能够提高翻译的核苷酸序列；(b)促进重组蛋白分泌于细胞外部的核苷酸序列；和(c)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接。通常但不一定，有效连接的核苷酸序列是连续的，并且根据需要，是在阅读框内的。然而，虽然，有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列上游；但是它不需要与该核苷酸序列连续。通过本领域熟知的重组方法，例如使用PCR方法，通过在适宜的限制性位点处连接或通过复性，完成多种核苷酸序列的有效连接。如果合适的限制性位点不存在，可以根据常规惯例使用合成的寡核苷酸接头或衔接子。本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸分子”指任何长度的聚合物形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生化核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基(如一般可以在RNA或DNA中找到)或修饰或取代的糖或磷酸基。此外，双链多核苷酸可以通过合成互补链并且使该链在适宜的条件下复性，或通过使用DNA聚合酶以适宜的引物从头合成互补链，而从化学合成的单链多核苷酸产物获得。核酸分子可以有许多不同的形式，举例来说，基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)与核苷酸类似物、尿喃唳(uracyl)、其他糖及连接基团如氟代核糖(fIuororibose)与硫代酯(thioate),和核苷酸分支(nucleotidebranches)。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括以下情况的任一者这些碱基的类似物或修饰形式如甲基化核苷酸、核苷酸间修饰如不带电荷的连接和硫代酯、糖类似物的使用、修饰的和/或可替代的骨架结构如聚酰胺。术语“多潜能干细胞”包括从胚、胚胎或成体组织获得的干细胞。在一个优选的实施方案中，多潜能干细胞是胚干细胞。在另一个实施方案中，多潜能干细胞是胎儿干细胞，如原始生殖细胞。在另一个实施方案中，多潜能干细胞是成体干细胞。如本文所用，术语“多潜能”指能够至少发育成外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞之一的细胞。如本文所用，术语“多潜能”包括全能细胞和多能细胞。如本文所用，术语“全能细胞”指能够发育成全部细胞谱系的细胞。术语“多能”指最终不分化的细胞。“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3'方向)编码序列转录的DNA调节区。如本文所用，启动子序列由转录起始位点结合到其3'末端并且向上游(5'方向)延伸以包括为高于背景的可检测启动转录水平所需要的最少数目的碱基或元件。转录起始位点(通过用核酸酶SI作图便利地限定)可以存在于启动子序列以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)内部。真核启动子可以经常，但是不总是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外,原核启动子还含有Shine-Dalgarno序列。本领域已熟知有来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型动子。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且源自这些来源的合适启动子是轻易可获得的，或可基于在线或例如从保藏中心如ATCC以及其他商业或个人来源可公共获得的序列以合成方法产生。启动子可以是单向的(即，以一个方向启动转录)或双向的(即，以3'或5'方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统，pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子、稻胚乳特异性谷蛋白(Gtl)启动子、CaMV35S病毒启动子。诱导型启动子包括Tet系统(美国专利5，464，758和5，814，618)、蜕皮激素诱导系统(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8):3346-3351;T-REX系统(InvitrogenCarlsbad,CA)，LacSwitch(Stratagene,(SanDiego,CA)和Cre_ERT他莫西芬诱导的重组酶系统((Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22):4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23)e99；美国专利号7，112,715;以及Kramer和Fussenegger，MethodsMol.Biol.(2005)308:123-144)或本领域已知适于在所需细胞中表达的任何启动子。术语“目的蛋白”指可以用于研究、诊断或治疗目的的任何蛋白质。目的蛋白可以包括哺乳动物蛋白质或非哺乳动物蛋白质，并且可以任选地包括受体或配体。示例性目的蛋白包括，但不限于分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白W-I-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和vonWillebrands因子；抗凝血因子如蛋白C;心钠素；肺表面活性剂；组织型纤维蛋白溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；TNF和TNF受体(TNFR)家族的成员，如肿瘤坏死因子-α和-β、CD40配体、Αρο-2配体、DR4、DR5、DcRUDcR2、DcR3、OPG,Fas配体；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒氏管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺促素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE;细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4;抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体；蛋白A或D;类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4,NT-5或NT-6)、或神经生长因子如NGF-β;血小板衍生的生长因子O3DGF);成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，其包括TGF-βI、TGF-β2、TG-β3、TGF-β4或TGF-β5;胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-1和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白KD蛋白如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19和⑶20;促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP);干扰素如干扰素-α、_β和-Y;集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF,GM-CSF和G-CSF;血小板生成素(TPO);白介素(IL)、例如，IL-I至IL-10;超氧化物歧化酶；Τ-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如，AIDS包膜蛋白gpl20的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM;肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及以上任意多肽的变体和/或片段；以及针对多种蛋白质抗原如CD蛋白如CD3、CD4、CD8、⑶19、CD20和CD34的抗体；ErbB受体家族的成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子如LFA-1、Macl、ρ150·95、VLA-4、ICAM-I、VCAM和包括α或β亚基(例如，抗CDlla、抗CD18或抗CDllb抗体)αν/β3整联蛋白;生长因子如VEGF；IgE;血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4;蛋白C;Apo_2L受体如Apo-2(DR5)、DR4、DcRUDcR2、DcR3；以及以上确定的抗体的变体和/或片段等。在本发明的一个实施方案中，目的蛋白将包括自身能够在体外或体内哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中诱导凋亡的蛋白质，如Apo-2配体/TRAIL、Fas配体或TNF-α。术语细胞培养物的“生产期”指在细胞生长已经达到停滞期时的时间段。在生产期期间，对数细胞生长已经结束并且主要是蛋白质生产。在这个时间段期间，通常对培养基补充以支持持续的蛋白质产生并获得所需的蛋白质产物。术语“重组蛋白”或“重组多肽”指相对于产生多肽的细胞而言，外源即异源或外来多肽。在凋亡或细胞培养的背景下，术语“应激”指组织培养的非最佳条件，包括以下情况的任意组合；存在毒素、养分或生长因子耗尽或撤除、缺氧、热应激(与优选的范围相比，温度太高或太低)、细胞-细胞接触丧失、病毒感染、渗透性应激(与优选的范围相比，摩尔渗透压浓度太高或太低)、氧化应激、细胞密度(与优选的范围相比，细胞密度太高或太低)，和PH应激(与优选的范围相比，pH太高或太低)。术语“转化”指将一个或多个核酸分子转移至宿主细胞或生物体中。将核酸分子导入到宿主细胞中的方法包括，例如，磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、微量注射、阳离子脂类介导转染、电穿孔、划痕荷载、射弹导入或病毒或其他感染介质感染。“经转化”、“经转导”、“转基因的”和“重组”指已经导入有重组或异源核酸分子(例如，一个或多个DNA构建体或RNA或siRNA对应物)的宿主细胞或生物体。核酸分子可以稳定地表达(即，以有功能的形式在细胞中维持超过约三个月)或以有功能的形式在细胞中不稳定地维持不足三个月，即，瞬时表达。例如，“转化的”、“转化体”、和“转基因”细胞已经经历转化过程并且含有外来核酸分子。术语“未转化的”指未曾经历转化过程的细胞。术语细胞培养物的“过渡期”指在占用生产阶段的培养条件的时间段。在过渡期期间，环境因素如pH、离子浓度和温度可以从生长状况转向生产状况。术语“序列相似性”指在可以或可以不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或一致性的程度(见Reeck等人，上文)。然而，在常见用途中和在本申请中，术语“同源的”，当用副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同进化起源。在具体实施方案中，如已知的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNAStrider、CLUSTAL等所确定，当至少约85%和更优选地至少约90%或至少约95%核苷酸在限定长度的核酸序列范围内匹配时，两个核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。这种序列的实例是本发明特定基因的等位基因或物种变体。也可以通过杂交识别出基本上同源的序列，例如在DNA印迹杂交实验中，例如相对于这个特定系统所定义的严格条件下。类似地，在本发明的实施方案中，当多于80%的氨基酸残基相同时，或当多于90%的氨基酸残基相似时(即，是功能上相同的)，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地,通过使用，例如GCG(GeneticsComputerGroup,第7版,Madison,Wis.)pileup程序或使用上述任何程序和算法比对，识别相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法,采用默认值空位产生罚分=_(l+l/k),k是空位延伸数目，平均匹配=1，平均错配=-0.333。如本文中所用，并在所附的权利要求书中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另有说明。因而，例如，对“一个分子”的指称包括一个或多个此类分子，对“一种试剂”的指称包括一种或多种此类不同的试剂，对“一种抗体”的指称包括一种或多种此类不同的抗体，并且对“该方法”的指称包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法的指称，所述等效步骤和方法可以修改或替换为本文所述的方法。除非另有说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。在文献中解释了此类技术。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,第2版，1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等人(1995年和定期增补内容；CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9、13和6章，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.Polak和James0'D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；0xfordUniversityPress;M.J.Gait(编者)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress;D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I编者EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(编者)，DavidLane(编者)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-3,4-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编著(2001,NewYork，N.Y.,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)JPLabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers编著，2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。这些通用教材的每一部都被引入本文作为参考。除非另有规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法、组合物、试剂、细胞相似或等效的任意方法、组合物、试剂、细胞可以用于实施或检验本发明中，然而在此描述优选的方法和材料。将本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份单独的出版物或参考文献通过引用方式并入本文，作为完全阐述。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式以针对出版物和参考文献所描述的上述方式完整并入本文。上文所讨论的出版物仅是为了揭示在本申请的申请日之前的出版物而提供的。本文中任何内容均不得解释为承认由于在先发明而使得本发明不早于这种公布。I使用本发明补充物的方法要求保护的补充物对广泛应用的组织和细胞培养以及重组蛋白生产是有用的，其中它们在组织培养期间在防止凋亡和改善细胞生存力方面并且尤其在应激反应方面，提供显著的改善。凋亡包括一系列导致特征性细胞形态和死亡的生物化学事件。这些变化包括，细胞膜的变化，如膜的非对称性和附着作用的丧失、细胞空泡化、细胞皱缩、核破碎、染色质浓缩和染色体DNA片段化。凋亡过程受种类多样的细胞信号控制，所述细胞信号可以源于细胞外(外源诱导物)或胞内(内源诱导物)。细胞外信号可以包括可以在组织培养基中不同程度地存在的毒素、激素、生长因子、一氧化氮、细胞因子。这些信号可以正向地(即，触发)或负向地(即，阻抑、抑制或消弱)影响凋亡，并且因此影响总细胞生存力。众多胞内组分，包括ATP含量、钙水平和众多凋亡基因和抗凋亡基因，也帮助调节凋亡。细胞可以应答于可能引起细胞自杀的应激而启动胞内凋亡信号。在组织培养期间遭遇的应激诱导介质包括例如与组织培养组合物相关的毒素如内毒素和从塑料器具浸出的重金属、转染试剂(例如，Lipofectamine和相似的基于脂质的转染试剂)、病毒转化、与无血清培养相关的营养和生长因子缺乏、或与生物反应器中高密度培养相关的细胞分化协议缺氧和氧化应激、和增加的胞内钙浓度，例如，因去垢剂和电穿孔引起膜损伤所致。在细胞死亡的实际过程发生之前，凋亡信号必须克服调节蛋白，该调节蛋白起监督凋亡途径活化的看门人的作用。在体内，这个步骤允许终止该过程，细胞不再需要死亡。但在这个步骤中涉及几种蛋白质，尽管已经识别两个主要调节机制并且包括那些与线粒体功能性相关的蛋白质，和那些直接通过衔接蛋白参与转导信号至凋亡机制的蛋白质。如上文所述，在细胞培养条件下培育的细胞可以经历与常规组织培养过程相关的细胞应激，所述细胞应激可以触发凋亡信号并增加细胞对凋亡的易感性。例如，与无血清培养相关的营养缺乏、与生物反应器中高密度生长相关的氧化应激、与DNA转染试剂相关的细胞毒化合物的使用、和与冷冻保存相关的热应激，可能会使细胞进入凋亡。通过增强细胞在此类信号下生存的能力，可以在这些过程期间通过防止细胞发生细胞死亡而改善细胞生存力，从而提高这些方法的成功和效用。近来，已经在真核细胞中识别到抑制凋亡开始或减少其影响的众多基因。其中一些基因抑制细胞中的caspase依赖性凋亡途径，并且实际上，用抗凋亡基因转染细胞可有助于延长在生物学需要的条件下培育的转染细胞的寿命和生产率。(美国专利号6，586，206；7,531，327;美国专利申请US2009/0170165；US2009/0181426)。另外，在一些情况下，外源热休克蛋白的添加已经显示在多种条件下改善培养细胞的存活。(Novoselova等人，J.Neurochem.94597-606(2005)；Tidwell等人，CellStress&Chap9(1)88-90(2004);Guzhova等人，CellStress&Chap.3(I)67-77(1998)；Hounenou等人，CellStress&ChapI(3)161-166(1996);Johnson等人，InvitroCell.Dev.Biol.,29A807-812(1993)。本发明部分地基于以下展示在添加至培养基中培育的哺乳动物细胞时，植物衍生的重组细胞培养组分蛋白令人惊讶地增强培养下培育的哺乳动物细胞的生长和生存力。具体而言，此类补充物导致培养物生存力的提高、细胞存活的延长、细胞生长速率的改善和从组织培养生物反应器产生的重组蛋白产率的提高。因为这些补充物显示出乎意料地改善活性和稳定性，所以它们提供与使用标准重组或纯化的蛋白质相比更显著的改善。本申请中公开的方法，例如，用于改善细胞生存力和加速在培养下所培育细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高从细胞培养物中产生的重组蛋白的产量。下文详细描述由本发明提供的进一步改善。在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，所述方法包括在转染之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善冷冻保藏后的细胞的生存力的方法，所述方法包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的干细胞的细胞生长速率或生存力的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加本发明的补充物至细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。在一个实施方案中，本发明包括一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加包含重组白蛋白的补充物至培养基。在这些方法的任一种中，通过增加培养下(和发酵期间)的宿主细胞生存力，本发明的补充物提供简单和成本-效果合算的方法以增加功能性重组蛋白的产率和或纯度、生物活性、稳定性和装配。另外，通过减少或抑制细胞培养中的细胞凋亡，本发明的补充物可以减少培养基中有害蛋白酶的数目或存在并且保护表达的目的蛋白免遭蛋白酶降解，从而提高产生的目的蛋白的质量，以通过增加活性蛋白的量和增加完整蛋白质的产量所证实。另外，申请人已经发现，本发明的补充物可以保护细胞免受培养组合物中存在的物质(如去垢剂、重金属和内毒素杂质)的潜在副作用，或保护细胞免遭转染或冷冻保存期间引入到细胞的有毒试剂影响。在所要求保护的方法的任一种中，本发明的补充物可以在任何便利时间，例如在改变培养基、细胞传代时或以低密度铺种细胞时，直接添加至或混合至培养基。任选地，补充物在细胞培养过程开始时(在开始时，第O日)添加至培养基。在一个方面，本发明的补充物可以在预期的应激事件之前(例如在冷冻保存、转染或血清撤除之前，等等)添加。在另一个方面，在细胞培养期间补充物在细胞凋亡的诱导一般发生的时点之前添加至培养基。例如，在大规模细胞培养期间，可以在培养的约第3日或第4日观察到凋亡的诱导，并且因此，补充物将优选地在第3日或第4日之前添加。任选地，所需量的补充物在细胞培养自始至终或在其持续期添加，例如，基于整个发酵过程的每日持续。例如，对于5日培养，补充物可以在第O日添加，并且此后每24小时添加直至培养终止。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至生物反应器来改善生物反应器中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在一个实施方案中，生物反应器包含细菌细胞。在另一个方面生物反应器包含酵母细胞。在另一个方面生物反应器包含植物细胞。在另一个方面生物反应器包含哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善细菌细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善酵母细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善植物细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善昆虫细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过在细胞培养系统的生产期之前或在其期间添加本发明的补充物至细胞培养系统，增加细胞培养系统的生产期的产率并且从而增加生物反应器的生产率的方法。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约10%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约20%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约30%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约40%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约50%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约60%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约70%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约80%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约90%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约100%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约200%。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约500%。在另一个实施方案中，本发明提供了与生产目的蛋白的正常生长条件相比在升高的温度产生这种蛋白质的方法，所述方法包含添加本发明的补充物至表达目的蛋白的细胞。在另一个实施方案中，本发明提供一种通过倾向于聚集目的蛋白来减少细胞培养表达系统中形成的聚集物量的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，因而减少蛋白质的聚集状态。在另一个实施方案中，本发明提供一种通过防止重组蛋白变性和聚集而增加由细胞表达的目的蛋白的活性的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞，因而增加目的蛋白的比活性。在另一个实施方案中，本发明提供一种改善易聚集、引起沉淀发生或本身对细胞有毒的蛋白质在细胞培养表达系统中表达的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，因而增加目的蛋白的表达。在另一个实施方案中，本发明提供一种改善糖基化蛋白质的糖基化模式的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，由此糖基化的程度增加和/或糖基化模式的获得是更接近于人的。这些方法的任一种中添加的补充物的量将取决于多种因素，例如，宿主细胞类型、细胞密度、目的蛋白和培养条件，等等。确定待添加至培养基的补充物的所需浓度处于本领域技术范围内并且可通过常规优化而无需过多实验经验地确定。技术人员将容易地理解，不同的细胞类型将对本发明的补充物具有不同幅度的反应，并且这将某种程度上由补充物中HSP的量或类型决定。另外，不同密度的细胞将要求适当调节添加至培养物的补充物总量及HSP浓度以解释增加的细胞数目。另外，以悬浮培养或贴壁培养而培育的细胞将具有可用于HSP进入的不同膜表面积并且通常表现出不同的响应速率和程度。因此，应当选择引起充分抑制凋亡、或增加生存力或净细胞生长的浓度。通常本发明的补充物将添加至终浓度为约O.I%、约O.5%、约I%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约11%、约12%、约13%、约14%、约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、约20%、约25%、约30%、约40%或约50%Wt/wt或wt/体积。通常有一个补充物浓度的上限范围，超过所述上限范围，细胞存活的进一步增加不出现。如下文实施例中所述，申请人已经发现，以约200mg/L约2g/L、或更优选地约200mg/L约1000mg/L、或更优选地约250约500mg/L的浓度添加至细胞培养物时，本发明的补充物可以抑制凋亡。II.补充物在一个方面，本发明的补充物包含一种或多种植物衍生的重组细胞培养组分。在本发明的一个实施方案中，一种或多种重组细胞培养组分独立地选自白蛋白和乳铁蛋白或其混合物。在本发明的另一个方面，补充物含有选自转铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶或生长因子的一种或多种额外因子。在本发明的另一个方面，生长因子独立地选自胰岛素、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子1-23(FGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF)、角质细胞生长因子I和2(KGF)，和白血病抑制性因子(LIF)。在本发明补充物的一个方面，重组细胞培养组分的至少一种是白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约2%的聚合白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约1%的聚合白蛋白。在本发明补充物的一个方面，重组细胞培养组分的至少一种包含白蛋白和乳铁蛋白的混合物。在另一个方面，白蛋白包含少于约2%的聚合白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约I%的聚合白蛋白。在另一个方面，本发明的补充物包含重组白蛋白和稻热休克蛋白。在另一个方面，本发明的补充物包含重组白蛋白和稻hsp70同源物。在一个方面，稻hsp70同源物选自HSP70、Bip和稻基质蛋白。在一个实施方案中，本发明的补充物包含共纯化的重组白蛋白和稻hsp的制备物，所述制备物还基本上不含则将会掩蔽或抑制hsp的积极影响的去垢剂和内毒素。在一个方面，本发明的补充物具有小于约IEU内毒素，并且所述白蛋白是至少约95%纯的。在这些方法的任一种中，本发明的补充物可以通过共纯化来制备，或将细胞培养组分连冋热休克蛋白在水溶液中混合来制备。术语“白蛋白”指全部天然存在形式和合成形式的白蛋白。优选地，术语“白蛋白”指重组白蛋白。在一个方面，白蛋白来自脊椎动物。在一个方面，白蛋白来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，白蛋白是人的。在另一个方面，重组白蛋白从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组白蛋白从转基因稻(Oryzasativa)中产生。下表Dl中列出不同物种的白蛋白的代表性物种和Genebank登录号。----■■■_示例性白-白基因_物种_GeneBank登录++号__A__NP000468.1里|t!程(Pantroglodytes)__XP517233.2_家犬(Canislupusfamiliaris)XP855557.1_t-(Bostaums)__NP851335.1_小家fti(Musmusculus)NP033784.1揭家fei(Rattsnorvegicus)NP5991S3.1_Jlji(Callusgallus)__NP990592.1_应当理解，对于在不同物种中重组产生白蛋白而言，一般需要将基因的核酸序列对所讨论的宿主生物进行密码子优化。此类密码子优化可以通过所讨论宿主生物的优选密码子使用的标准分析并通过标准DNA合成法合成优化的核酸来完成。众多公司基于收费服务提供此类服务并且包括例如，DNA2.O(CA，USA)和OperonTechnologies.(CA，USA)。白蛋白可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同等位变体，所述等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、取代或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括白蛋白的天然存在的化学修饰形式，包括白蛋白的翻译后修饰和降解产物，包括例如，白蛋白的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。天然或合成白蛋白序列的片段也可以具有从它们衍生的这些序列以及可在本发明的任何方法中使用的肽的所需的功能特性。如本文所用的术语“片段”因而包括白蛋白的片段，前提是这种片段保留了完整分子的生物学活性或治疗有益活性。例如，白蛋白含有至少2个对众多生理重要的金属离子(包括铜、锌、镉和镍)的高亲和力、多金属结合位点。(Carter等人，AdvancesinProteinChemistry45153-203(1994);Bai等人，J.InorgBiochem70(I)33-39(1998)，Blindauer等人，JBiolChem.284(34)23116-24(2009);美国专利号6，787，636)。由于这些痕量的金属一般存在于白蛋白的重组生产中，故而显著量的这些金属离子可以与这种蛋白质螯合。当作为组织培养组分添加至细胞时，这些离子结合，并且特别镉和镍结合于重组白蛋白与这种蛋白质的细胞毒性相关。因此，在一个方面，术语“白蛋白”可以包括白蛋白片段，该片段包括参与白蛋白的多金属结合位点的一个或多个氨基酸的缺失。在一个方面，通过在成熟蛋白的N端缺失一个或多个氨基酸产生白蛋白片段。在另一个方面，白蛋白可以包含参与白蛋白的N端金属结合位点的任何氨基酸的一个或多个缺失或突变。在一个方面，待缺失或突变的氨基酸独立地选自序列5'DAHKSEVAH3'(SEQIDNO.I)。如本文所用的术语“衍生物“因而指与天然序列相比已经被修饰的白蛋白序列或其片段。此类修饰可以是一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。这些修饰可以是连续或非连续的。代表性变体可以包括与表Dl中所列的任何基因相比，具有I20个、或更优选地I15个、I10个或者I5个氨基酸置换、插入和/或缺失的那些变体。置换的氨基酸可以是任何氨基酸，特别是熟知的20种常规氨基酸(Ala(A)；Cys(C)；Asp(D)；Glu(E)；Phe(F)；Gly(G)；His(H)；Ile(I)；Lys(K)；Leu(L)；Met(M)；Ash(N)；Pro(P)；Gin(Q)；Arg(R)；Ser(S)；Thr(T)；Val(V)；Trp(W);和Tyr(Y))的一种。白蛋白的任何此类变体或衍生物可以用于本发明的任何方法中。因而，本发明的白蛋白可以在白蛋白的任何功能性结合结构域中包含氨基酸缺失、插入或突变。在一个方面，白蛋白可以在白蛋白的结合结构域中包含突变。在一个方面，突变的结合结构域是如美国专利号5，780,593中概述的参与结合阿斯匹灵、华法令、地西泮、洋地黄毒式、度洛贝特(dlofibrate)、布洛芬或AZT的结构域,或如Blindauer等人，J.Biol.Chem.284(34)23116-24(2009)中概述的多金属结合位点。因而，可以在本发明的任何方法中使用的白蛋白可以具有与天然白蛋白氨基酸序列(例如与表Dl中所列的任何天然白蛋白基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种白蛋白可以具有与表Dl中所列的白蛋白具有至少30%优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的白蛋白是与成熟的分泌型人血清白蛋白(SEQIDNO.2)至少80%相同，如下文加下划线部分所示(Swiss-ProtP02768)MKffVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAffAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQIDNO.2)也包括白蛋白与其他蛋白质的融合蛋白，并且这些融合蛋白可以增强活性、靶向性、稳定性或效力。天然白蛋白结构的化学修饰，其保留或稳定白蛋白活性或生物学半衰期，也可以随本文所述的任何方法一起使用。此类化学修饰策略包括，而不限于PEG化、糖基化和酰化(见Clark等人J.Biol.Chem.271(36):21969-21977,1996；Roberts等人Adv.Drug.Deliv.Rev.54(4):459-476,(2002)；Felix等人Int.J·Pept.Protein.Res.46(3-4)253-264，(1995)；GarberDiabetesObes.Metab.7￠)666-74(2005))，也可以包括C-端和N端保护基团和拟肽单位。可以将天然L-氨基酸的异构体例如D-氨基酸掺入到以上形式的白蛋白的任一者中，并且用于本发明的任何方法中。白蛋白的全部此类变体、衍生物、融合蛋白或片段均包括在本文所公开或要求保护的任何方法中并且可以用于其中，并且均归于术语“白蛋白”。术语“转铁蛋白”指全部天然存在形式和合成形式的转铁蛋白。在一个方面，术语“转铁蛋白“指重组转铁蛋白。在一个方面，转铁蛋白来自脊椎动物。在一个方面，转铁蛋白来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，转铁蛋白是人的。在另一个方面，重组转铁蛋白从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组转铁蛋白从转基因稻(Oryzasativa)产生。下表D2中列出不同物种的转铁蛋白的代表性物种和Genebank登录号。表D2.权利要求1.一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。2.一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至无血清培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。3.一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。4.一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。5.一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。6.一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。7.一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至无血清培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。8.一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。9.一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。10.一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。11.一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，包括在转染之前、期间或紧随之后添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。12.一种用于改善冷冻保存后的细胞的生存力的方法，包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。13.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。14.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。15.一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。16.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。17.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。18.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。19.一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。20.一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；其中所述重组白蛋白在植物中产生；其中所述补充物具有小于约IEU内毒素/mg白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2%的聚合白蛋白。21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中培养细胞的生存力增加。22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是组织培养细胞。23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。24.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是杂交瘤细胞。25.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是vero细胞。26.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由流式细胞术分选。27.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。28.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是干细胞。29.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是B细胞衍生的。30.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是T细胞衍生的。31.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞或是B细胞衍生的。32.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞或是T细胞衍生的。33.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由流式细胞术分离。34.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由微流体装置分离。35.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由单细胞亚克隆法分离。36.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述产物是蛋白质、疫苗、细胞结合的细菌或病毒。37.根据权利要求13至21、4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。38.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是重组蛋白。39.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是单体。40.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是多聚体蛋白。41.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体是全长的。42.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.01%wt/wt的热休克蛋白。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白是稻热休克蛋白。45.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白选自稻HSP70基因和稻胚乳管腔结合蛋白。46.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白选自稻(gb|ACJ54890.1|)、EEC69073/0sI_37938和AAB63469。47.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.01%wt/wt的HSP70。48.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.04%wt/wt的HSP70。49.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.06%wt/wt的HSP70。50.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.08%wt/wt的HSP70。51.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.1%wt/wt的HSP70。52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约IOOmg/L和约200mg/L之间的终浓度。53.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约200mg/L和约400mg/L之间的终浓度。54.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约400mg/L和约600mg/L之间的终浓度。55.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约600mg/L和约800mg/L之间的终浓度。56.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约800mg/L和约1000mg/L之间的终浓度。57.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约1000mg/L和约2000mg/L之间的终浓度。58.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约2000mg/L和约5000mg/L之间的终浓度。59.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约5000mg/L和约10000mg/L之间的终浓度。60.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约10000mg/L和约20000mg/L之间的终浓度。61.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于10%。62.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于15%。63.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于20%。64.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于25%。65.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于30%。66.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于40%。67.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于50%。68.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于60%。69.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于70%。70.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于80%。71.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于90%。72.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于100%。全文摘要本发明涉及有益于培养的真核细胞的组合物及其用途，以及它们用于促进细胞生长、生存力和重组蛋白表达的方法。本申请中公开的方法，例如用于改善细胞生存力和加速在培养下所培育细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高来自细胞培养物的重组蛋白的产率。文档编号C07K14/76GK102812121SQ201180014615公开日2012年12月5日申请日期2011年1月24日优先权日2010年1月25日发明者迈克尔·巴尼特,马修·S·克罗根申请人:文特里亚生物科学公司