本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种复发性流产易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因水平评估复发性流产发病的风险级别，并作为预防和治疗复发性流产的方向指导。
背景技术：
复发性流产连续发生2次或2次以上的自然流产者称为复发性流产(rsa)。流产是指妊娠28周以前终止、胎儿体重在1000克以下者。1977年，世界卫生组织(who)将流产定义为妊娠20周以前终止、胎儿体重在500克以下者。
引起复发性流产的危险因素很多，复发性流产的患者中能够识别其病因的仅占50％，主要包括染色体异常、母体生殖道异常、母体内分泌异常、免疫功能异常、生殖道感染、宫颈机能不全及血栓形成倾向等。
最近的研究表明，复发性流产的发生与tnf-α、ctla4、mthfr三个遗传易感基因密切相关。tnf-α基因编码肿瘤坏死因子-α，它能显著增强巨噬细胞抑制细菌生长的能力，还能诱导产生多种细胞因子，从而间接调节免疫细胞的活性，增强特异性免疫保护功能。tnf-α基因g308a突变能使得肿瘤坏死因子α含量增多，产生过强炎性反应，母-胎间免疫应答水平上升，对妊娠产生不良影响。
mthfr基因编码亚甲基四氢叶酸还原酶，是叶酸代谢过程中的关键酶，维持正常的同型半胱氨酸水平。mthfr基因c677t和a1298c突变，使编码的亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低，叶酸代谢能力下降，血液中同型半胱氨酸水平上升，加重血栓形成倾向，损伤母体及胎儿。
ctla4编码细胞毒性t淋巴细胞抗原，负向调节t淋巴细胞免疫应答，影响着多种自身免疫性疾病的易感性。该基因a49g突变编码的蛋白量下降，对免疫信号的下调作用降低，导致免疫信号失控，引发母胎损伤。
综上所述，鉴于tnf-α、ctla4、mthfr基因与复发性流产的发生有着重要的关联关系，可以做为预测和筛查复发性流产的潜在指征，通过这些复发性流产易感基因的检测，能在预防和治疗复发性流产以及降低复发性流产发生率等方面起到不容忽视的重要作用。
技术实现要素：
本发明基于tnf-α基因上单核苷酸多态性位点g308a(rs1800629)，ctla4基因上单核苷酸多态性位点a49g(rs231775)，mthfr基因上单核苷酸多态性位点c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)基因型可作为评估复发性流产发病的危险因子的基础上，研制一种复发性流产易感基因检测试剂盒。
该试剂盒包括：
检测tnf-α基因上单核苷酸多态性位点g308a(rs1800629)，ctla4基因上单核苷酸多态性位点a49g(rs231775)，mthfr基因上单核苷酸多态性位点c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及dna测序引物；
pcr反应组件(包括taq酶、dntp混合液、反应缓冲液、ddh2o等)；
pcr产物纯化组件(包括sap酶、exoi酶、ddh2o等)；
dna测序反应组件(包括bigdyemix，edta溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、hidi溶液、ddh2o等)。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
pcr反应体系：10×pcr反应缓冲液2.5ul；25mmdntp混合液0.2ul；5u/ultaqdna聚合酶0.125ul；20um特异性引物对(每条引物各0.25ul)；ddh2o19.175ul。
pcr产物纯化体系：1u/ulsap酶0.75ul；10u/ulexoi酶0.375ul；ddh2o3.875ul。
测序反应体系：25％bigdyemix1ul；3.2umdna测序引物1ul；125mmedta溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；hidi溶液8ul；ddh2o2ul。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.检测试剂盒的使用
1、抽提dna模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组dna。
2、pcr扩增反应
使用检测试剂盒中的pcr反应组件，其中，含有下列引物对：
(1)tnf-α(g308a)正向引物：5′gaggcaataggttttgaggggcatg3′
tnf-α(g308a)反向引物：3′ggacggggttcagcctccagggtcc5′
(2)ctla4(a49g)正向引物：5′cagcggcacaaggctcagctgaacctggct3′
ctla4(a49g)反向引物：3′ccaggacctggccctgcactctcctgtttt5′
(3)mthfr(c677t)正向引物：5′ttgaaggagaaggtgtctgcgggag3′
mthfr(c677t)反向引物：3′cgatttcatcatcacgcagcttttc5′
(4)mthfr(a1298c)正向引物：5′tggggggaggagctgaccagtgaag3′
mthfr(a1298c)反向引物：5′aagtgtctttgaagtctttgttctt3′
pcr扩增的反应体系为：10×pcr反应缓冲液2.5μl；25mm的dntp混合液0.2μl、5u/ultaq酶0.125μl、dna模板1μl(12-15ng左右)、20um正向引物反向引物各0.25μl、ddh2o19.175μl；
反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性1min，50℃1min退火，72℃延伸50s，35个循环后，72℃延伸10分钟。
3、pcr扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的pcr产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含pcr产物20ul，1u/ulsap酶0.75ul，10u/ulexoi酶0.375ul，去离子水3.875ul。在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。
4、dna测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列dna测序引物：
(1)tnf-α(g308a)测序引物：5′gaggcaataggttttgag3′
(2)ctla4(a49g)测序引物：5′cagcggcacaaggctcagctg3′
(3)mthfr(c677t)测序引物：5′ttgaaggagaaggtgtctg3′
(4)mthfr(a1298c)测序引物：5′tggggggaggagctgaccag3′
反应的体系为总体积5ul，包含pcr纯化产物1ul，25％bigdyemix1ul，3.2umdna
测序引物1ul，去离子水2ul。
在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，进行25个循环的
96℃30s，55℃30s，60℃4min。
反应结束后加入125mmedta溶液1ul和100％乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min；在4℃，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入hidi溶液8ul，放入测序仪中。
5、基因型分析
熟悉dna测序技术的本领域技术人员能够通过辨识dna测序图谱确定所检测的snp位点的基因型。
实施例2.筛查复发性流产风险人群的基因无创检测服务
1.无创采样
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔粘膜上皮细胞取样，样本用细胞保存液常温保存。
2.dna抽提
采用酚氯仿法对采集到的口腔粘膜细胞进行dna抽提。
3.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组dna的tnf-α基因上单核苷酸多态性位点g308a(rs1800629)，ctla4基因上单核苷酸多态性位点a49g(rs231775)，mthfr基因上单核苷酸多态性位点c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4个单核苷酸多态性位点分别进行dna测序，确定这4个snps位点的基因型。
4.复发性流产发病高危人群生物信息学分析及风险评估
通过对受检者snps基因型的生物信息学分析和风险评估模型鉴定，出具复发性流产易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者tnf-α基因上单核苷酸多态性位点g308a(rs1800629)，ctla4基因上单核苷酸多态性位点a49g(rs231775)，mthfr基因上单核苷酸多态性位点c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4个snp位点基因检测信息、复发性流产风险评估结果和防治方案。根据受检者的风险等级，由医师向受检者详细说明并解读复发性流产易感基因无创检测报告单。