本发明涉及分子基因分型领域，具体而言，涉及一种用于鹿科动物亲子鉴定的引物、试剂盒及方法。
背景技术：
微卫星是基因组中的一种短串联重复序列(2-6bp)，由于重复数不同表现出不同的等位基因。与其他鉴定方法相比，用微卫星标记进行亲子鉴定有很多不可比拟的优点。其中，最显著的优点是他的共显性遗传特征，这就使得纯合子和杂合子基因型可以被区分出来，极大地增加了亲子鉴定的准确性。另外，微卫星标记具有较高的多态性，也就是说同一个位点上有多个等位基因，由于非亲子关系的个体不太可能会共享同一个等位基因，所以使用少数高多态性微卫星标记就可以鉴别大量个体的亲子关系。最后，因为微卫星分析使用的是聚合酶链反应(pcr)，所以鉴别时只需要少量的dna，并且高度降解的dna也可以使用，如粪便、头发、羽毛和皮肤中提取的dna。
梅花鹿(cervusnippon)主要分布于东亚，范围从西伯利亚到韩国、中国东部和越南；在日本等西太平洋岛屿也有分布。中国的梅花鹿主要分布在吉林省，而日本的梅花鹿主要分布于北海道。19世纪梅花鹿曾经被猎到几乎绝种，20世纪中开始立法保护，族群在1950年代到1980年代快速恢复。梅花鹿也被引进到澳大利亚、欧洲和美国。原先的目的是作为公园装饰用的动物，但现在许多变成野生。目前，分布于中国和日本的梅花鹿亚种已经被iucn红色名录列为极危或濒危等级，我国的梅花鹿同时也是国家一级保护动物。
目前在人类的其他家畜的亲子鉴定研究中，应用最多的是微卫星分子标记技术，但是由于物种之间其基因组不同所以导致用于其亲子鉴定的微卫星分子标记的引物也不同。目前国内还没有准确的鹿亲子鉴定方法，由于牛的亲缘关系和鹿很相近，有的动物园采用牛的微卫星标记用于鹿上，但其无效基因位点很多，鉴别效率不高。之前有研究利用7个牛的微卫星位点对27只动物园的豚鹿进行了亲子鉴定，这7个微卫星的非父排除率为83.6％，表现出较低的多态性。研究证明只有56％的牛微卫星引物可应用于羊，其中只有42％的微卫星位点在羊上表现出多态性，鉴定效果较差。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明提供了一套用于鹿科动物亲子鉴定的微卫星引物，这套引物共有10对，其累计非父排除率高达99.99％，可应用于鹿的亲子鉴定实践中。
本发明涉及一种用于鹿科动物亲子鉴定的引物，选自下列的至少一个引物对：
seqidno:1和2、seqidno:3和4、seqidno:5和6、seqidno:7和8、seqidno:9和10、seqidno:11和12、seqidno:13和14、seqidno:15和16、seqidno:17和18以及seqidno:19和20。
优选的，本发明所提供的用于鹿科动物亲子鉴定的引物，选自下列引物对任2对、3对、4对、5对、6对、7对、8对、9对或全部。
本发明所使用的微卫星标记全部来源于鹿，是通过简化基因组测序得到的原始数据，之后经过严格筛选得到高多态性微卫星标记，再经过反复在实践中应用，筛选得到的10个稳定的准确性高、多态性高的微卫星标记。
优选的，如上所述的用于鹿科动物亲子鉴定的引物，每对引物的上游引物的5’端被荧光染料标记。
优选的，如上所述的用于鹿科动物亲子鉴定的引物，所述荧光染料选自选自fam、fitc、hex、vic、joe、tamra、tet、rox、cy3、cy5、texas-red、pet、ned、alexafluor、dylight和ftm中的一种或多种。
本发明还涉及一种鹿科动物亲子鉴定试剂盒，其包括如上所述的用于鹿科动物亲子鉴定的引物；
所述试剂盒优选还包括pcr反应缓冲液、dna聚合酶、dntp以及水中的一种或多种。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定试剂盒，所述dna聚合酶选自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶以及klenow片段中的任一种；
在一些实施方式中，所述dna聚合酶为taqdna聚合酶；
更优选为热启动taqdna聚合酶。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定试剂盒，所述水选自双蒸水或去离子水。
本发明还涉及一种鹿科动物亲子鉴定方法，包括：
提取待检测鹿科动物样品的dna并使用如上所述的鹿科动物亲子鉴定的引物对其进行扩增；
检测扩增产物大小，并用软件进行亲子推断。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定方法，用所述的鹿科动物亲子鉴定的引物对进行扩增时，各引物对的退火温度均为58℃～62℃；更优选为59℃～61℃，最优选60℃。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定方法，所述待检测鹿科动物样品包括所述待检测鹿科动物的血液、唾液、精液、骨骼或毛发。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定方法，所述鹿科动物样品的dna的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定方法，其中提取待检测鹿科动物样品的dna并使用如上所述的鹿科动物亲子鉴定的引物对其进行扩增时，所用引物至少为2对以上；
更优选的，所用引物为3、4、5、6、7、8、9或10对。
优选的，如上所述的鹿科动物亲子鉴定方法，使用全部10对引物对进行亲子鉴定；
在扩增完成后，检测扩增产物大小时，按如下引物对的扩增产物进行分组：
第一组：seqidno:1和2、seqidno:3和4；
第二组：seqidno:5和6、seqidno:7和8；
第三组：seqidno:9和10、seqidno:11和12；
第四组：seqidno:13和14、seqidno:15和16；
第五组：seqidno:17和18；
第六组：seqidno:19和20；
优选的，同一组内的引物对所带有的荧光染料标记颜色不同；
使用如上所述的分组方法进行扩增，根据扩增产物的大小进行分组，可使得扩增进行的更为经济简便。
优选的，在上述的鹿科动物亲子鉴定的引物、鹿科动物亲子鉴定试剂盒以及鹿科动物亲子鉴定方法中，所述鹿科动物包括鹿亚科、麂亚科、獐亚科和美洲鹿亚科动物；
更优选的，所述鹿科动物包括花鹿属、鹿属、黇鹿属和麋鹿属动物；
更优选的，所述鹿科动物包括马鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律宾黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物对能在鹿科动物的样本中扩增出的条带清晰、多态性高的微卫星dna条带，且累计非父排除率高达99.99％，鉴定方法简便，鉴定结果可靠。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
1.引物合成
合成用于鹿亲子鉴定的10对微卫星引物，引物5’端带不同荧光标记(fam，hex，tamra)。具体的信息如下表：
表1用于鹿亲子鉴定的10对微卫星引物及其分组
2.对待检测的梅花鹿进行基因组提取
取梅花鹿血液300ul，用biotake血液提取试剂盒提取梅花鹿基因组，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性，酶标仪测定dna浓度和纯度，-20℃储存备用。
3.以待检测的梅花鹿基因组为模板，用pcr方法扩增上述10个微卫星位点。
pcr扩增体系和条件见表2和表3。
表2pcr反应体系
表格3pcr反应程序
4.毛细管电泳的方法检测pcr产物的大小。
pcr产物采用abi3730遗传分析仪进行大小的检测，然后用genescan和genotyper(abi)软件进行基因分型。
5.基因分型结果采用cervus3.0软件进行多态性和亲子关系的分析。
(2)技术效果
我们用来自4个家系的16个梅花鹿个体验证了本发明的10个微卫星的亲子鉴定效果。结果中，所有的子代均与其亲生父本相匹配(f1的子代是z2，z3，z4；f5的子代是z6，z7，z8；f9的子代是z10，z11，z12；f13的子代是z14，z15，z16)。lod若是正数则可确信为成功匹配，且数值越大越可信，若是负数则说明匹配不可信，如表4中f1和f5无亲缘关系的匹配lod值是负数，其他正确匹配的lod都是正数：
表4亲子鉴定个体验证结果
表510个微卫星值的非父排除率和其他参数值
locus：位点的名称；k:等位基因数；n:位点的基因型数；hobs:观测杂合度；pic:多态信息含量；pe1:只有一个候选亲本时的单个位点非父排除率；pe2:：已知一个亲本，推测另一个亲本时的单个位点非父排除率；pe3:推测一对父母时的单个位点非父排除率；i:两个无关个体间的单个位点个体识别率；si:两个有亲缘关系个体间的单个位点个体识别率；cpe1:只有一个候选亲本时的累计非父排除率；cpe2：已知一个亲本，推测另一个亲本时的累计非父排除率；cpe3:推测一对父母时的累计非父排除率；ci:两个无关个体间的累计个体识别率；csi:两个有亲缘关系个体间的累计个体识别率.
其累计非父排除率为：
在双方父母都未知的情况下为95.45％
在一方父母已知的情况下为99.66％
在双方父母已知的情况下为99.99％
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>中国农业科学院特产研究所
<120>用于鹿科动物亲子鉴定的引物、试剂盒及方法
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<170>patentinversion3.3
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