一种人类乳头瘤病毒（HPV）分型快速检测方法与流程

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种包括样本快速获取，结果直接判读的人类乳头瘤病毒分型快速检测方法。

背景技术：

人类乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，hpv）是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，hpv的宿主为人类。hpv是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，dna限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同，通过对人乳头瘤病毒克隆基因的dna杂交试验及酶谱分析，至今已鉴定出100多种类型人乳头瘤病毒，每一型别都与体内特定感染部位和病变有关。所有hpv病毒的基因组结构相似，迄今已发现多种hpv类型，随着研究的深入，将会鉴定出更多hpv新的类型。大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。至少有10个类型与尖锐湿疣有关（如6，11，16，18及33型，最常见6、11型），而第11，16，18型，则是国外目前研究宫颈癌、外阴癌甚至阴茎癌的最热门的病毒因子，其长期感染与女性宫颈癌的发生有关。依据不同型别hpv与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别hpv，低危险型别hpv包括hpv6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（cini），高危险型hpv包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（cinii/iii）的发生相关，尤其是hpv16和18型。

根据研究，人乳头瘤病毒(hpv)是引发宫颈癌的元凶，其中hpv16型和18型是引发妇女子宫肿瘤的最主要的类别，感染该病毒会至少引发全世界70%以上的宫颈癌病例。在妇女的肿瘤病中,宫颈癌的发生率仅次于乳腺癌,位居第二位。在发展中国家,宫颈癌的发生率是发达国家的6倍,而且80%的患者在确诊时已经发展为浸润癌。

人乳头瘤病毒感染生殖道是一个长期的过程，尖锐湿疣经过治疗后，如果机体免疫能力足够强大时，病毒经过1-2年就会自然消失。

由此可见，加强hpv检测以及长期跟踪预后有十分重要的意义，目前市场上已经出现了比较成熟的hpv分型检测产品有taq-man实时荧光定量法，pcr+分子杂交法，hc2分子杂交捕获法等。

taq-man实时荧光定量技术的核酸检测能够精准的进行hpv分型检测。但该方法有如下不足：1，试剂耗材昂贵；2.需要成批次的大规模检测，适用于大型的医院或体检机构；3，实时荧光定量pcr仪价格昂贵，不适合乡镇等偏远地区推广；4，操作判读过程繁琐，操作人员需要专门培训试剂盒的使用以及配套软件的应用，操作繁琐，不适合快速便捷检测。

pcr+分子杂交法。是利用扩增出的大量目的基因产物，和芯片上固化的不同亚型的核酸单链进行特异性识别，通过判读核酸上携带的放射性标记分子判读样本亚型。该方法能够检测出不同的hpv不同亚型。但由于分子杂交法本身的局限性。操作过程复杂，需要配合特定的仪器耗材，并且分子杂交技术极易出现假阳性。操作繁琐，仪器耗材昂贵，并且操作人员需要专门培训。

hc2核酸杂交捕获法。它利用分子生物学技术在分子（dna）水平直接检测高危型hpv病毒。这项分子elisa技术通过将rna探针与单束hpvdna杂交，随后通过化学发光检测到rna/dna杂交物。该方法与上述分子杂交法类似，无pcr扩增反应，将杨很核酸纯化后，进行分子杂交，再通过信号放大判读样本的感染类型。该方法灵敏度高，但容易造成假阳性。同时，分子杂交过程需要1-1.5h，核酸提取过程需要1h左右，总耗时约3-4h，标记分子信号放大系统属于精密仪器，造价昂贵且不稳定。

技术实现要素：

针对现有hpv检测技术的不足，本发明提供的技术方案为：

一种人类乳头瘤病毒（hpv）分型快速检测方法。

步骤1，根据不同的hpv分型特征基因，设计特异性引物，上下游引物的5’端携带至少两种标记分子。

步骤2，将hpv检测样本进行处理，处理方法使用一管法微量释放，只需5ul样本，置于反应管中，加入释放剂进行裂解，得到核酸样本。

步骤3，将上述特异性引物和样本进行pcr扩增，得到大量的目的基因片段。

步骤4，将得到的带有标记分子的目的基因片段滴于免疫层析试纸条上，5-10min即可判读结果。若样本为阴性，则无目的条带产生，试纸条上值显示一条控制线（6）；若样本为阳性，则试纸条上产生两条线，分别是检测线（7）和控制线（6）。

以hpv18型为例，所述步骤1)中作为优选的引物序列为。

上游引物(hpv-f):5’-fam-attgattagttacctctatgctga-3’。

下游引物(hpv-r):5’-hex-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

步骤2中所述的一管法微量释放核酸样本，使用微量核酸释放剂、促释放剂、封闭剂；微量核酸释放剂含有5~500mm的kc1、0.5~20%tritonx-100、1~100mg/ml的蛋白酶k、1~20mm的naoh，ph值5~8的dmso、终浓度0.5~10%的bsa。具体操作方法：取微量核酸释放剂5µl加入等体积的样本，用移液器吹打混匀10次，每管加入30µl的封闭剂；进行95℃，10min温浴处理，然后降温4℃2min（此步骤可以在pcr仪上进行）即获得模板样本。将反应液加入反应管，盖好管盖。振荡混匀，瞬时离心，进pcr反应。

所述步骤3中作为优选的pcr扩增方法为普通热循环pcr扩增法，也可以使用等温扩增pcr法等其他方法。

所述步骤4中的试纸条构成：优选的方案为金垫包含的示踪分子为连接了hex抗体的胶体金颗粒，检测线（t线）处固定的捕获分子为fam抗体。若样本为阴性，则无目的条带出现，试纸条上显示一条控制线（c线）（6）；若样本为阳性，则试纸条上显示两条线，分别是检测线（t线）和控制线（c线）。

本发明有益效果体现在以下方面。

（1）减少交叉污染。

已有的hpv核酸检测方法，是使用磁珠法或者柱提法提取样本核酸样本。配合使用提取试剂，进行提取纯化核酸。该过程非常容易受到污染，并且耗费时间。一般的核酸纯化试剂盒的提取过程需要1h左右，而本发明使用的一管法微量释放剂，可以在15min完成核酸获取，不需要繁琐的操作过程，取样到获得样本可以做到“一室化”，从而避免了样本处理过程中的交叉感染。

（2）便于推广使用。

已有的hpv检测方法为实时荧光定量pcr方法，需要使用配套的荧光定量pcr仪，这种仪器属于精密仪器，造价昂贵。需要专门培训，结果的判读需要一定的经验。而本发明使用的pcr+免疫层析法，则不需要特殊仪器，普通控温pcr仪即可使用（若使用等温pcr技术，则只需要水浴），肉眼即可判读结果，结果直观可读，操作者不需要专业培训。

（3）提高了检测效率。

已有的hpv核酸检方法，需要收集够足量的hpv样本，从而进行批量试验。通过核酸提取纯化，至荧光定量pcr法检测，过程约4-5h，不适合基层医疗单位的快速诊断。本发明公布的一种hpv分型检测方法，则可以大大缩短检测时间，并且对于单份样本也可以操作，总体耗时约1-1.5h。

该方法的局限性：只能做定性筛选，无法做定量分析。

附图说明

图1免疫层析试纸结构。

图2实施例1hpv-18型和hpv-16型检测结果，图上出现两条线的为阳性，一条线的为阴性。

图3实施例3hpv-16/18组合检测结果，显示三条线的为hpv-16/18复合感染，检测线2显色为hpv-18型感染，检测线1显色为hpv-16型感染。

具体实施例

下面根据说明书做进一步说明。以令领域技术人员能够根据说明书文字实施。

实施例1。

采集阴道拭子样本21份，11份样本为高危hpv-18型感染，10份样本为hpv-16型感染。以上样本由北京军区总医院提供。

步骤1，设计标记分子修饰的引物组合。

（hpv-18-f）:5’-fam-attgattagttacctctatgctga-3’。

（hpv-18-r）:5’-hex-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

（hpv-16-f）:5’-fam-cgacgtttgcgaaaccgcaag-3’。

（hpv-16-r）:5’-hex-aatgcattgaccgctcctaac-3’。

步骤2，取样本5µl，置于pcr反应管，加入5µl微量核酸释放剂，吹打混匀10次。加入30µl封闭剂封闭。微量核酸释放剂含有5~500mm的kc1、0.5~20%tritonx-100、1~100mg/m1的蛋白酶k、1~20mm的naoh,促释放剂含有ph值5~8的dmso、终浓度0.5~10%的bsa。

将上述反应管进行95℃,10分钟温浴处理，然后降温4℃2min（此步骤可以在pcr仪上进行）即获得模板样本。

步骤3，使用步骤1设计的引物配制pcr反应体系。

。

将反应液加入到步骤2得到的核酸样本中。轻微振荡混匀，置于离心机上瞬离，去除反应体系中的气泡。后使用普通pcr仪运行以下程序。

。

步骤4，以hpv18型为例，吸取全部扩增反应液滴于胶体金试纸样品垫上，样品会随着层析作用，朝向吸水垫移动，通过金垫时，核酸一端携带的fam被结合了金颗粒的anti-fam识别，并与之结合。随着层析作用，核酸片段牵引着金颗粒向吸水垫方向层析。核酸产物另一端的hex被检测线固定的anti-hex识别并结合，从而金颗粒在检测线上汇集显色。完成检测判读。

实施例1的操作时间为70分钟，阳性检出率为100%。

具体实施例2

在高危hpv感染中，除了hpv16/18型与宫颈癌发生高度相关之外，还有hpv31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等分型，为了进一步提高检测效率，可将剩余的11种亚综合检测，根据这11类hpv病毒亚型共有的保守序列，设计hpv高危型分型通用引物，在确定具体的亚型之前，检测样本是否存在其他hpv高危型感染。

通用引物设计。

5’-tamara-atctcgggctaattacgtaatcc-3’。

5’-hex-cctatgggtatcccgtcgaac-3’。

其他样本和试验过程与实施例一类似。区别是配合通用引物使用的胶体金试纸，样本垫为金颗粒与tamra抗体的复合物。试验操作时间为70分钟，阳性检出率为100%。

具体实施例三。

在一张试纸条上，可以设计使用两种及两种以上的检测线，可以将不同分型的特异性引物进行组合，从而增加了效率。节约了检测成本。

针对hpv16型/18型设计引物如下。

hpv16型：f:5’-fam-cgacgtttgcgaaaccgcaag-3’。

hpv16型：r：5’-hex-aatgcattgaccgctcctaac-3’。

hpv18型：f：5’-hex-attgattagttacctctatgctga-3’。

hpv18型：r：5’-cy5-gtatgctgacggtagtcattagcc-3’。

样本进行一管法微量释放处理。见实施例一步骤2。

反应液配制：在实施例1基础上，将hpv-16/hpv-18引物同时加入反应体系。进行pcr扩增反应，举例配液如下。

。

胶体金检测，参照实施例一步骤（4），将扩增产物加于样品垫上。样品垫铺设连接胶体金颗粒的hex抗体，检测线1固定anti-fam抗体，检测线2固定anti-cy5抗体。若样本为hpv-16阳性，则检测线2出现显色；若样本为hpv-18阳性，则检测线1出现显色；若样本为hpv-16/18混合样本，则两条检测线都出现显色（见附图3）。

本实验过程从试验准备到读取实验结果，时间为70分钟，检出率为100%。

以上本发明实施例是对一种人类乳头瘤病毒分型快速检测方法进行详细介绍，该方法可以大大缩短hpv核酸检测的时间，降低了检测的成本，更重要的是，本方法不依赖昂贵的专业仪器，不需要对操作人员进行专门培训，配合一管法核酸微量释放，最大限度的减少了环境对反应的影响。可用于临床诊断，核酸检测等领域，非常适合在基层医疗单位推广。

本文应用了具体个例对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上实施例说明只用于帮助理解本发明的核心思想和方法，帮助本领域的技术人员了解实施。此外，本领域技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

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