专利名称：一种人乳头瘤病毒的分型方法
技术领域：
本发明涉及一种人乳头瘤病毒的分型方法，利用寡核苷酸探针的溶解曲线和特定的荧光标记实现HPV亚型的分型检测。
背景技术：
宫颈癌是妇女高发的恶性肿瘤之一，几乎所有的宫颈癌标本中可检出HPV DNA, HPV阴性者几乎无罹子宫颈癌之忧，因此，HPV被确认为子宫颈癌发生的必要条件。人乳头状瘤病毒(HPV)型别有80多种，按其感染部位分为皮肤型和生殖道型HPV。大约有35种型别与生殖道感染有关，约20种与肿瘤相关。依据与癌发生关系,分为低危型HPV(如6、11、42,43和44型等可引起外生殖器湿疣、宫颈上皮内低度病变等)和高危型HPV(如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型与子宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关)。而HPV16和18型感染率最高，即HPV16占所有型别的50%，其病理类型主要为子宫颈癌鳞状上皮细胞癌；HPV18占14%，在子宫颈腺上皮细胞癌占主要地位；HPV45占8% ; HPV31占5% ;其他型别占23%。所以针对HPV分型的检测对于宫颈癌的预防十分有必要。 由于目前尚无有效的技术手段能够在体外培养HPV，所以目前为止没有有效的HPV血清学分型方法。传统的诊断方法主要是形态学检查方法，包括巴氏涂片、液基薄层细胞检查、阴道镜等；免疫学检查，主要是酶联免疫反应。这些传统的技术手段，存在较高假阳性和假阴性率，由于这些不足，分子生物学技术被引入HPV的临床检测，它们包括，原位杂交、杂交捕获、PCR、PCR反向点杂交等技术，其中杂交捕获是目前美国FDA唯一批准可用于临床检测的试剂盒，但这些方法有个共同的缺点就是操作复杂，耗时长大大制约了临床的应用。
荧光定量PCR检测技术是1990年诞生的技术，从一开始就受到广泛的关注和应用，以荧光定量PCR仪为平台，给种革新的技术层出不穷，主要包括，sybrgreen染料法、 Taqman探针法、分子信标、FRET等技术，他们各有优缺点和各自不同的应用领域。随着荧光定量PCR技术越来越普及，荧光定量PCR仪成为了医院检验科室不可缺少的仪器。
荧光定量PCR技术中，有一个大的技术类型，称为溶解曲线分析。原理简述如下 荧光定量PCR仪通过对反应体系逐渐增加温度，同时监测每一个温度变化中的荧光信号的强弱，得出曲线。对于染料法的荧光定量PCR实验(例如采用sybrgreen)因为随着反应体系中双链DNA变性，荧光染料或者又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰(Tm，DNA双链解链50% 的温度)；对于基于荧光标记的探针的荧光定量PCR实验(例如分子信标，FRET，Eclipse探针)，探针上标记了不同荧光和粹灭基团，当这些探针与其互补的DNA链随着反应体系温度的改变，发生变性和复性的过程，从而使荧光强度发生变化，同样用荧光信号改变的一次导数与温度作图，反应了探针与模板杂交时的特征峰，反应了探针的Tm值。
由于临床常见HPV亚型超过20种，有些亚型与宫颈癌关系不大例如6、11型，有的与宫颈癌关系密切，例如16、18型，有些亚型与宫颈癌关系还不确切，例如53亚型。所以对患者进行HPV亚型分型的诊断很有必要，目前可用于HPV亚型的分型试剂盒大都采用PCR反向点杂交技术，但是这个方法操作时间长，过程繁琐，需要在PCR扩增完毕后，打开PCR 反应管进行操作，所以极易造成PCR污染，而且结果通过显示反应表示，带有很大的主观因素。荧光定量PCR技术可以解决这些问题，但是由于荧光通道受局限，目前常用荧光定量 PCR仪最为常用的检测通道是FAM和Vic荧光通道，所以最为常用的Taqman探针的荧光定量PCR技术，对于HPV亚型分型检测不是非常合适，应为一个亚型就需要一种荧光，如果仅用Fam和Vic这两个通道，完成23个常见的HPV亚型检测，就需要12个PCR反应管，这显然不利于临床的应用。我们利用荧光定量PCR技术中探针的溶解曲线这一技术途径，因为探针可以根据各个亚型的序列人工设计，所以探针的Tm值也可认为设定，根据不同的Tm值， 也可以区分不同的亚型，即使只使用Fam和Vic这两个检测通道，也可以实现一个PCR反应管中最少4个HPV亚型的检测。
我们在实验中选用的是Quenched FRET技术，它是FRET技术的一个衍生，传统的 FRET技术又称为双杂交探针，或者LightCycle探针。FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成(距离l_5bp)，上游探针的3'端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5'端标记受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和受体基团紧密相邻， 激发供体产生的荧光能量被受体荧光基团吸收，使得检测探头可以检测到受体荧光基团的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到受体荧光基团的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。Quenched FRET技术利用粹灭性基团，例如BHQ (Black Hole Quenchor)系列、Tamra Dabcyl> Eclipse等,标记在一条探针的3'端,突光基团标记在另一条探针的5,端。当探针同时杂交与模板时，粹灭基团与荧光基团互相靠近导致反应体系中的荧光减弱，当变性时两探针游离导致荧光恢复。利用quenched FRET的方法可避免传统FRET的方法对荧光染料选择的局限，理论上各种荧光定量PCR常有的探针标记用的有机染料都可以使用。
探针由各自的TM值(DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度)。 所以Quenched FRET的数据是由荧光强度和TM值组成的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种人乳头瘤病毒的分型方法，检测结果准确。
本发明是通过以下的技术方案实现的
一种人乳头瘤病毒的分型方法
(I)扩增样品选用通用HPV扩增引物，上游引物是MY11、PGMY11或上述混合引物组，GP5、GP5+、SPF1或上述混合引物组；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物组，GP6、 GP6+、SPF2或上述混合引物组；
(2)溶解曲线分析在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是10-500nM，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序是温度为20-95°C，温度上升或下降梯度O. 1-5°C，每个梯度保持时间 O.5-60S。
所述步骤(I)中上游引物浓度50-1000nM，下游引物浓度50_1000nM，反应体系中镁离子浓度的可选范围1. 5-5mM。
本发明的有益效果为可以利用探针不同的荧光标记，和探针Tm值对HPV分型检测，这样可以用一种荧光通道检测不同亚型的HPV。
图1是本发明HPV18FAM检测结果图
图2是本发明HPV33FAM检测结果图
图3是本发明HPV35FAM检测结果图
图4是本发明HPV53FAM检测结果图
图5是本发明HPV58FAM检测结果图
图6是本发明HPV39FAM检测结果图
图7是本发明HPV43FAM检测结果图
图8是本发明HPV45FAM检测结果图
图9是本发明HPV56FAM检测结果图
图10是本发明HPV59FAM检测结果图
图11是本发明HPV66FAM检测结果图
图12是本发明HPV68FAM检测结果图
图13是本发明HPV73FAM检测结果图
图14是本发明HPV83FAM检测结果图
图15是本发明HPVMM4FAM检测结果图
图16是本发明HPVB-globinFAM检测结果图
图17是本发明HPV6FAM检测结果图
图18是本发明HPV11FAM检测结果图
图19是本发明HPV16FAM检测结果图
图20是本发明HPV44FAM检测结果图
图21是本发明HPV51FAM检测结果图
图22是本发明HPV52FAM检测结果图
图23是本发明HPV42FAM检测结果图
图24是本发明HPV18FAM检测结果图具体实施方式
以下结合附图，对本发明做进一步说明。
第一扩增样品(如果病毒有足够的拷贝数，或者实验要求对灵敏度不高这步可省略)，选用通用HPV扩增引物，上游引物可以是MY11、PGMYll (混合引物组)、GP5、GP5+、 SPFl (混合引物组);下游引物可以是MY09、PGMY09 (混合引物组)、GP6、GP6+、SPF2 (混合引物组)。这些引物核酸序列已被相关文献发表证实，它们可以很好的扩增HPV LI区域的 MY11/09区间。相关引物序列参见相关文献。上下游引物可以组合使用，选取扩增效率符合要求的引物对使用，申请人利用评价了各种组合，认为使用MYll和PGMY09时扩增效率最高。扩增反应条件是
权利要求
1.一种人乳头瘤病毒的分型方法，其特征在于是通过以下的步骤实现的(1)扩增样品选用通用HPV扩增引物，上游引物是MY11、PGMYll或上述混合引物组， GP5、GP5+、SPFl或上述混合引物组；下游引物是MY09、PGMY09或上述混合引物组，GP6、 GP6+、SPF2或上述混合引物组；(2)溶解曲线分析在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入需要检测亚型的探针， 可选用的浓度范围是10-500nM，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序是温度为20-95°C，温度上升或下降梯度O. 1_5°C，每个梯度保持时间O. 5-60S。
2.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒的分型方法，其特征在于所述步骤(I)中上游引物浓度50-1000nM,下游引物浓度50_1000nM,反应体系中镁离子浓度的可选范围1.5_5mM0
全文摘要
本发明公开了一种人乳头瘤病毒的分型方法，首先进行样品扩增，选用通用HPV扩增引物，上游引物可以是MY11和PGMY11混合引物组，GP5、GP5+、SPF1的混合引物组；下游引物可以是MY09、PGMY09的混合引物组，GP6、GP6+、SPF2的混合引物组；然后进行溶解曲线分析，在HPV的DNA或者上一步的PCR产物中加入，需要检测亚型的探针，可选用的浓度范围是(10-500nM)，在荧光定量PCR仪上需要相应的荧光检测通道，设置的溶解曲线程序进行分析。本发明可以用一种荧光通道检测不同亚型的HPV，我们的附图中提供了一个荧光检测通道检测3个HPV亚型的实例。
文档编号G01N21/64GK102994645SQ20111027822
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者潘振华, 孙朝辉 申请人:潘振华