检测恶疫霉菌的特异性引物及PCR检测方法和应用与流程

本发明属于农作物病害预警检测、鉴定及防治技术领域，涉及一种分子快速检测的方法与应用，具体涉及一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。

背景技术：

恶疫霉(Phytophthora cactorum Schroet)是世界范围内广泛分布的重要植物病原菌之一，能侵染约60个科、50个属中的200多种植物，所引起的植物病害分布广泛，是导致多种经济作物（如草莓、苹果、梨和人参等）发生疫病的重要病原菌，如恶疫霉引起的草莓果腐病，是草莓结果中后期的一种常见病害，果实受害率一般在5%-15%，严重的甚至达到30%以上，对草莓的产量影响很大。恶疫霉菌通常以菌丝体和卵孢子在病残体和土壤中越冬，在条件适宜时菌丝直接侵染寄主，或形成大量游动孢子囊传播到地上部侵染寄主，其侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的土传毁灭性病害。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。所以建立恶疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。

恶疫霉菌的传统分类鉴定是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等对菌株进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状时行判定。传统方法在恶疫霉菌检测中发挥了重要作用，但传统分类鉴定方法费时费力、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，最重要一点是不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着分子生物学技术的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的途径，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功案例已越来越多。目前，国内外研究人员主要利用rDNA/ITS基因、elicitin基因、β-tubulin基因、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等作为检测靶标序列，根据基因序列在不同病原菌种之间的差异位点，设计检测对象（病原菌）的特异性PCR引物来进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌不同种之间在形态学和基因序列上相性以很大，有的分子PCR检测靶标基因序列在疫霉属的近缘种之间变化很小。例如，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的疫霉种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，首先应筛选出在疫霉菌不同种之间序列差异较大的基因作为检测靶标，然后再进行引物设计和检测。

近期已有研究表明，疫霉属中的Ypt1基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定，目前尚无针对该靶标基因设计的特异性引物PCR检测恶疫霉菌的报道。本发明以Ypt1基因为恶疫霉菌检测靶点，设计特异引物并与PCR技术相结合，建立特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法。该方法在恶疫霉菌的种类鉴定、监测和病害及时防控等方面具有一定的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用，针对现有技术中对恶疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用，本发明可以直接从发病的植物组织和带菌土壤中检测出恶疫霉菌。本发明所述的恶疫霉菌快速分子检测方法可用于恶疫霉菌引起病害的早期诊断及病菌的监测和鉴定中，本发明对恶疫霉菌检测可达到准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠的目的。

实现本发明的上述目的，本发明采用下列步骤（技术方案）予以实现：

1. 通过测定恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）和其它疫霉菌（Phytophthora spp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对恶疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：

上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，

下游引物PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'；

对恶疫霉菌特异性扩增出211bp的产物。

2. 恶疫霉菌特异PCR检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组DNA。

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB 法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100ng/µL待用。

用于检测植物组织中存在恶疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增；

用于检测土壤样品中存在恶疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。

（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PCAF/PCAR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

（3）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约211bp的单一条带，即可判断所述的检测样品中存在恶疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在该菌。

本发明与现有的恶疫霉菌鉴定方法相比，具有以下的技术优势和有益效果：

1.特异性强、准确性高：本发明是根据疫霉菌Ypt1基因含有多个外显子和内含子，且其基因序列保守区和进化区相互间隔的特点，设计了对恶疫霉菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的恶疫霉菌和携带恶疫霉菌的植物组织和土壤进行了测试验证，只有恶疫霉菌和携带该病菌的样品能特异性地扩增出一条211bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。

2.灵敏度高：病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与Ypt1基因通用引物联合起来进行巢式PCR扩增后，对恶疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测提高了10000倍，确保了样品中恶疫霉菌的检出；

3.实用性好、应用范围广：恶疫霉菌的快速检测、鉴定，具有重要的实际应用价值。传统的恶疫霉菌的检测方法一般是在病害出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对植株组织及土壤中是否携带恶疫霉菌进行检测，如果能特异性地扩增出211bp的单一电泳条带，说明样品中存在恶疫霉菌，因此本发明可用于恶疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性。恶疫霉菌是全世界范围内广泛分布的重要植物病原菌之一，能侵染约60个科、50个属中的200多种植物，所引起的植物病害分布广泛，是导致多种经济作物（如草莓、苹果、梨和人参等）疫病的主要病原菌。本发明可在恶疫霉菌引起多种植物病害应用，具有广泛的应用范围；

4.操作简便、快速：应用本发明方法，对待测样品基因组DNA进行提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间。

附图说明

图1为利用本发明设计的特异引物的PCR扩增结果，图中：泳道M为2000bp Marker，泳道1-4为恶疫霉菌，泳道5-7分别为辣椒疫霉菌、晚疫病菌和豇豆疫霉菌，泳道8为阴性对照。

图2为本发明引物对恶疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对恶疫霉菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对恶疫霉菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1为100 ng，泳道2为10 ng，泳道3为1 ng，泳道4为100 pg，泳道5为10 pg，泳道6为1 pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为1 fg，泳道10为100ag，泳道11为阴性对照，泳道12为阳性对照。

图3为本发明检测方法对苹果果实组织和土壤样品带菌检测结果电泳图，图中泳道M为2000bp Marker，泳道1-2为发病的苹果果实，泳道3-4为携带恶疫霉菌的土壤，泳道5-8为健康苹果果实，泳道9-10为高压灭菌土壤，泳道11为阴性对照，泳道12为阳性对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例 1：恶疫霉菌特异性检测引物的设计及引物对恶疫霉菌的特异性验证

1.供试菌株基因组DNA的提取

采用CTAB 法提取恶疫霉菌及其它供试菌株的基因组 DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900 µL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 µL SDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000 r·min^-1离心15 min；取上清液700 µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000 r·min^-1离心9 min；取上清液500 µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1离心5 min；取上清液350 µL，加入1/10体积3 mol·L^-1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1离心5 min；弃去上清液，加入700µL 冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 µL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测 DNA 浓度并稀释至100 ng/µL待用。

2.检测靶标Ypt1基因扩增及测序

利用Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）对供试恶疫霉菌的Ypt1基因进行扩增，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F / Yph2R引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

3.恶疫霉菌特异引物的设计

将测序得到的恶疫霉菌（P. cactorum）的Ypt1基因序列与GenBank中疫霉属18个不同种的Ypt1基因序列进行同源性比较分析，根据恶疫霉菌与其它种间的差异位点（在BioEdit中比对），用Primer Primer5软件设计了恶疫霉菌（P. cactorum）的特异性引物，上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

4.恶疫霉菌PCR检测方法的建立及引物特异性PCR验证

在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的恶疫霉菌PCR检测方法，PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45S、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。以供试的恶疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，采用已建立好的恶疫霉菌PCR检测扩增体系和扩增程序对恶疫霉菌引物（上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：PCAR：5'-TACACACGTTG- GACGCACCT-3'）的特异性进行验证。取5 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据DNA条带的有无及大小对恶疫霉菌引物的特异性进行验证。

5.引物特异性验证结果

PCR扩增结果表明，引物PCAF/PCAR只能特异性地从供试的恶疫霉菌基因组DNA中扩增出大小约为211bp的单一条带（图1），而其它病原菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将恶疫霉菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于恶疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：特异引物对恶疫霉菌基因组DNA的灵敏度检测

1.常规PCR扩增

用无菌超纯水对恶疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物PCAF/PCAR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对恶疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

2.巢式PCR扩增

用无菌超纯水对恶疫霉菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）为外引物，本发明所述的特异引物PCAF/PCAR为内引物对恶疫霉菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物PCAF/PCAR通过巢式PCR对恶疫霉菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增：以Ypt1基因通用引物（ph1F：5'-CGACC ATTGGCGTGGACTTT-3'和Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'）作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下：PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。第二轮PCR扩增：待第一轮PCR扩增结束后，取1.0μl 第一轮PCR产物为模板与引物PCAF/PCAR组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，第一轮PCR产物1.0μl，用无菌超纯水补足至25 µL。扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1 min、60℃退火45 S、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。

常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物PCAF/PCAR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到100pg DNA 25μl^-1反应体系（图2中的a）。进一步以Ypt1基因通用引物ph1F /Yph2R进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以PCAF/PCAR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品（10pg、1 pg、100fg、10fg/25μl反应体系）产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到10fg DNA 25μl^-1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。

实施例3：发病组织中恶疫霉菌的检测

苹果果实人工接种：将苹果（品种：红富士）果实用70%的乙醇表面消毒，果实表面用无菌打孔器（Φ5mm）打深约5mm的孔，每孔内接种一块直径5mm、厚约2mm的恶疫霉菌丝块，用无菌湿棉团覆盖接种处。接种的果实置于25℃下保湿，待果实发病后，取发病组织备用。

发病果实组织基因组DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL 0.5 mol/L NaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000 rpm离心6 min，取上清液5 µl加入495µL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

PCR扩增检测：利用本发明所述引物PCAF/PCAR进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

检测结果：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约211bp的产物，即可判断发病组织中带有恶疫霉菌。检测结果（图3）表明，人工接种发病的果实中可检测出恶疫霉菌，而健康组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于植物组织中恶疫霉菌的快速分子检测。

实施例4：土壤中恶疫霉菌的检测

携带恶疫霉菌土壤的制备：将供试的恶疫霉菌菌株培养于黑麦培养基平板上，待菌丝长满平板后，用适量的无菌水将平板中的菌丝及卵孢子洗下，双层纱布过滤去除菌丝，得到的滤液为恶疫霉菌卵孢子悬浮液，将卵孢子悬浮液与适量土壤混合，混合后的土壤在室温下风干，得到携带恶疫霉菌土壤。

带菌土壤基因组DNA的提取：采用Sigma公司的土壤DNA提取试剂盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的总DNA，取1.0 µL作为PCR模板进行扩增。

PCR扩增检测：利用本发明所述引物PCAF/PCAR进行PCR扩增。PCR反应体系25 µL，包括2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10 µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA 模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25 µL；扩增参数为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

检测结果：取PCR扩增产物5.0 µL用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为4-5V/cm，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约211bp的产物，即可判断土壤样品中存在恶疫霉菌。检测结果（图3）表明，携带恶疫霉菌的土壤中均可检测出恶疫霉菌，而高压灭菌的土壤及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于土壤中恶疫霉菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 检测恶疫霉菌的特异性引物及PCR检测方法和应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttctcgc aggcgtatct 20