本发明涉及一种易于纯化回收的重组脂肪酶的生产和提取。(二)
背景技术：
：脂肪酶，全称为三酰基甘油水解酶，它能够在脂-水界面上催化酯键水解，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶广泛存在动植物和微生物中，由于微生物种类多、分布广、适应性强、进化快，在微生物中的脂肪酶往往具有比动植物来源的脂肪酶具有更广的作用温度、pH和底物特异性等优势。微生物是工业用脂肪酶的主要来源。脂肪酶在工业生产中被广泛应用。如在食品工业中脂肪酶被用于肉类脱脂、面粉改良、油脂改性、奶酪加工、酿酒和酱料加工。在饲料工业中，脂肪酶与其他碳水化合物降解酶复配成复合酶作为饲料添加剂，可以有效提高饲料利用率。脂肪酶还被广泛应用于医药和精细化工工业中的手性化合物的生物拆分。在造纸工业中，脂肪酶可以实现木浆中松脂的酶法去除。在生物柴油工业中，脂肪酶可以用于催化油脂与断链醇的酯交换反应，用于酶法合成生物柴油。在洗涤工业、皮革加工和纺织工业中脂肪酶也被大量应用。随着脂肪酶生产成本降低、生产规模扩大、脂肪酶应用工艺的提升，工业生产中对脂肪酶的需求正在不断扩大。目前工业用脂肪酶主要依靠微生物发酵获得，微生物发酵法的生产工艺和下游提纯工艺复杂，对生产设备和运输储存也有严格的要求，生产规模扩张难度大，因此脂肪酶生产成本高，产能有限。脂肪酶的回收重复使用是降低用酶成本有效方法，为提高脂肪酶回收效率、降低回收成本，科学工作者展开了对固定化酶的广泛研究。并尝试各种不同的载体和固定方法，希望能够在最大限度保持酶活性的同时提高固定化酶的回收效率。因此开发具有高活性、容易回收纯化的脂肪酶在工业应用中具有重要的价值。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种能够快速提取和回收的重组脂肪酶大规模生产方法。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种脂肪酶提取方法，所述方法为：将油体蛋白、蛋白连接肽与脂肪酶依次连接构成重组脂肪酶，然后将重组脂肪酶转化水稻，获得含有重组脂肪酶基因的水稻种子，将所述的水稻种子脱壳匀浆，再在匀浆液中加入油脂，收集油层，获得脂肪酶提取液。进一步，所述油体蛋白、蛋白连接肽与脂肪酶依次连接构成的重组脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其中第1-117位氨基酸为油体蛋白，118-157位氨基酸为蛋白连接肽，158-474位氨基酸为脂肪酶。进一步，所述重组脂肪酶基因与终止子和水稻胚乳特异启动子一起连入pCAMB1300载体的T-DNA，然后转化水稻；所述水稻胚乳特异启动子核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。本发明构建了水稻遗传转化载体，在水稻遗传转化载体的T-DNA中含有由水稻胚乳特异性启动子介导的重组脂肪酶表达框和植物转化筛选标记。通过农杆菌侵染法转化水稻，将带有种子特异性启动子的重组脂肪酶表达框整合到水稻基因组中，筛选和培养出含有上述基因的转基因水稻，获得表达有重组脂肪酶的转基因水稻种子。进一步，所述水稻种子脱壳后，加入pH8.0、20mMTris-HCl缓冲液中匀浆处理，匀浆后振荡提取2小时，静置后取上清液，在上清液中加入植物油脂，充分混合，收集上层油层，获得重组脂肪酶，即为固定在油脂上的固定化重组脂肪酶。将含有重组脂肪酶的转基因水稻种子用Tris-HCl缓冲液水磨，在水磨液中加入动物或植物油脂，将油水混合物在磁力搅拌器上匀浆后静置分层，收集油层得到脂肪酶提取液。该提取液可以直接应用于工业生产，也可以根据需要进行进一步的浓缩纯化重组脂肪酶。进一步，所述缓冲液体积用量以脱壳后水稻种子质量计为20ml/g。所述植物油脂为油菜油或棕榈油，所述植物油脂加入量为上清液体积的5-10％。本发明重组脂肪酶中的油体蛋白具有特异的疏水性能，能使重组脂肪酶锚定在油体中，并将脂肪酶暴露在油体表层，形成有脂肪酶活性的油体液滴。本发明利用蛋白连接肽将油体蛋白和脂肪酶融合，使得脂肪酶的结构不受油体蛋白影响，脂肪酶可以充分暴露在油体表面，酶活性不受蛋白固定的影响。本发明的有益效果：本发明提供了一种可简单提取的重组脂肪酶，降低重组酶提取成本，提高重组脂肪酶的重复使用的次数。本发明可实现大规模生产重组脂肪酶，降低脂肪酶生产成本。(四)附图说明图1是本发明水稻的转化T-DNA载体pCAMB1300-GT1-CalB的示意图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：水稻转化T-DNA载体pCAMB1300-GT1-rCalB的构建将油体蛋白、蛋白连接肽与脂肪酶依次连接构成重组脂肪酶，由上海生工公司(上海，中国)人工合成含有重组脂肪酶基因(编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，其中第1-117位氨基酸为油体蛋白，118-157位氨基酸为蛋白连接肽，158-474位氨基酸为脂肪酶)和35S终止子的核苷酸，其序列为SEQIDNO.2所示。利用PCR引物GT1-F(5’AAGCTTGAGATTCATCAATATGAGAAAAC，下横线是HindⅢ位点)；和GT1-R(5’TCTAGACTGGGCTAGGGAGCCATCGCAC，下横线是XbaⅠ位点)从水稻(OryzasativajaponicaL.)基因组DNA扩增获得水稻胚乳特异启动子，长908bp，核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。将水稻种子特异性表达启动子和重组脂肪酶基因一起连入pCAMB1300(GenBank:AF234296.1)载体的T-DNA中，获得水稻转化载体pCAMB1300-GT1-rCalB。利用电击转化法将转化载体pCAMB1300-GT1-rCalB导入农杆菌(LBA4404)细胞中，获得含有T-DNA载体pCAMB1300-GT1-rCalB的农杆菌转化株系。实施例2：含有重组脂肪酶基因的转基因水稻的获得转基因水稻的获得方法是采用农杆菌侵染法，根据Zhao等报道的方法和培养基配方(AgriculturalSciencesinChina,2011,10(9):1307-1312)进行转化，具体步骤：选取成熟饱满的“秀水134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取实施例1含T-DNA载体pCAMB1300-GT1-rCalB的农杆菌在含有50mg/mL卡那抗性的YEP平板上划线培养，挑单菌落接种到YEP液体培养基，28℃培养至OD660为0.5。将待转化的水稻愈伤组织放入OD660为0.5的含有40mg/mL乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，28℃，水平摇床120rpm震荡1小时，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，26℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤组织，转移到含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养筛选两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到分化培养基，14小时28℃光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，每块抗性愈伤分化生根获得的转基因水稻为独立转化株系(见表1)，分别收取每个独立转化株系的水稻种子作为鉴定材料。实施例3：水稻种子中重组脂肪酶提取将实施例2获得的转基因水稻种子脱壳，取脱壳后的种子5g加入100mLpH8.0、20mMTris-HCl缓冲液中匀浆处理，匀浆后振荡提取2小时，静置后取上清液，在100ml上清液中加入10mL油菜油，充分混合，收集油层即为含有固定化重组脂肪酶的提取液。实施例4：水稻种子中重组脂肪酶的活性测定脂肪酶活性测定原理：脂肪酶在一定条件下水解底物对硝基苯丁酸酯，生成对硝基苯酚和脂肪酸，在一定范围内对硝基苯酚的量和反应液颜色深浅成正比，在405nm波长处测定其吸光度，从而计算出脂肪酶酶活。其中1个酶活力单位定义为每分钟释放1纳摩尔的对硝基苯酚所需的酶量。以对硝基苯丁酸酯(PNPB)为底物通过分光光度法测定rCalB的活性。对从不同转基因水稻转化株系中提取获得的重组脂肪酶进行酶活性测定。脂肪酶活性测定体系为：360μL的反应缓冲液(含150mMNaCl、0.5％(v/v)TritonX-100的浓度为20mM磷酸盐缓冲液pH8.0)加入4μL反应底物(50mM的对硝基苯丁酸酯的乙腈溶液)，加入36μL脂肪酶提取液，充分混匀，37℃静置5分钟，用可控温分光光度计测定所释放的对硝基酚在405nm波长处的吸收值来计算重组脂肪酶的活力。测定结果显示转基因水稻种子中脂肪酶活性为2832-5890U/g(按种子重量计)。表1转基因水稻种子中脂肪酶活性实施例5：水稻种子中重组脂肪酶提取率分析取脂肪酶表达量最高的转化株系rCalB-6用于进行脂肪酶提取效率分析。取rCalB-6种子5克，加入100mL20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)匀浆后振荡提取2小时，静置后取50mL上清液中加入5mL油菜油，充分混合，收集油层即为含有固定化重组脂肪酶的提取液。以对硝基苯丁酸酯(PNPB)为底物通过分光光度法测定rCalB的活性。对分析油菜油提取前的种子上清液、油菜油提取后的油层和水层中脂肪酶的活性进行分析。脂肪酶活性测定体系为：360μL的反应缓冲液(含150mMNaCl、0.5％(v/v)TritonX-100的浓度为20mM磷酸盐缓冲液pH8.0)加入4μL反应底物(50mM的对硝基苯丁酸酯的乙腈溶液)，加入36μL含脂肪酶样品，充分混匀，37℃静置5分钟，用可控温分光光度计测定所释放的对硝基酚在405nm波长处的吸收值来计算重组脂肪酶的活力。重组酶提取结果显示，利用油菜油可以快速提取酶液中80％以上的重组脂肪酶表2。表2转基因水稻种子中脂肪酶提取率分析样品总活性(U/g)酶活比例(％)提取前上清液28500±610.2100提取后水层3700±121.812.98提取后油层22980±485.280.63最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>浙江大学<120>一种脂肪酶提取方法<130><160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>474<212>PRT<213>unknown<220><223>人工序列<400>1AlaLeuLysThrValThrAlaAlaThrAlaGlyGlySerMetLeuVal151015LeuSerGlyLeuIleLeuAlaGlyThrValIleAlaLeuThrValAla202530ThrProValLeuValIlePheSerProValLeuValProAlaAlaIle354045AlaLeuAlaLeuMetAlaAlaGlyPheValThrSerGlyGlyLeuGly505560ValAlaAlaLeuSerValPheSerTrpMetTyrLysTyrLeuThrGly65707580LysHisProProGlyAlaAspGlnLeuAspHisAlaLysAlaArgLeu859095AlaSerLysAlaArgAspIleLysGluAlaAlaGlnHisArgIleAsp100105110GlnAlaGlnAlaSerProGlyGlyAlaProSerAsnArgSerThrThr115120125SerArgValSerProThrThrSerArgSerSerSerValThrProPro130135140ProGlySerThrThrThrArgValAsnAsnGlyGluPheLeuProSer145150155160GlySerAspProAlaPheSerGlnProLysSerValLeuAspAlaGly165170175LeuThrCysGlnGlyAlaSerProSerSerValSerLysProIleLeu180185190LeuValProGlyThrGlyThrThrGlyProGlnSerPheAspSerAsn195200205TrpIleProLeuSerThrGlnLeuGlyTyrThrProCysTrpIleSer210215220ProProProPheMetLeuAsnAspThrGlnValAsnThrGluTyrMet225230235240ValAsnAlaIleThrAlaLeuTyrAlaGlySerGlyAsnAsnLysLeu245250255ProValLeuThrTrpSerGlnGlyGlyLeuValAlaGlnTrpGlyLeu260265270ThrPhePheProSerIleArgSerLysValAspArgLeuMetAlaPhe275280285AlaProAspTyrLysGlyThrValLeuAlaGlyProLeuAspAlaLeu290295300AlaValSerAlaProSerValTrpGlnGlnThrThrGlySerAlaLeu305310315320ThrThrAlaLeuArgAsnAlaGlyGlyLeuThrGlnIleValProThr325330335ThrAsnLeuTyrSerAlaThrAspGluIleValGlnProGlnValSer340345350AsnSerProLeuAspSerSerTyrLeuPheAsnGlyLysAsnIleGln355360365AlaGlnAlaValCysGlyProLeuPheValIleAspHisAlaGlySer370375380LeuThrSerGlnPheSerTyrValValGlyArgSerAlaLeuArgSer385390395400ThrThrGlyGlnAlaArgSerAlaAspTyrGlyIleThrAspCysAsn405410415ProLeuProAlaAsnAspLeuThrProGluGlnLysValAlaAlaAla420425430AlaLeuLeuAlaProGluAlaAlaAlaIleValAlaGlyProLysGln435440445AsnCysGluProAspLeuMetProTyrAlaArgProPheAlaValGly450455460LysArgThrCysSerGlyIleValThrPro465470<210>2<211>1666<212>DNA<213>unknown<220><223>人工序列<400>2tctagactggctgccctcaagaccgtgaccgccgccaccgccggcggctccatgctcgtg60ctctccggcctcatcctcgccggcaccgtgatcgccctcaccgtggccaccccggtgctc120gtgatcttctccccggtgctcgtgccggccgccatcgccctcgccctcatggccgccggc180ttcgtgacctccggcggcctcggcgtggccgccctctccgtgttctcctggatgtacaag240tacctcaccggcaagcacccgccgggcgccgaccagctcgaccacgccaaggcccgcctc300gcctccaaggcccgcgacatcaaggaggccgcccagcaccgcatcgaccaggcccaggcc360tccccgggcggcgccccgtccaaccgctccaccacctcccgcgtgtccccgaccacctcc420cgctcctcctccgtgaccccgccgccgggctccaccaccacccgcgtgaacaacggcgag480ttcctcccgtccggctccgacccggccttctcccagccgaagtccgtgctcgacgccggc540ctcacctgccagggcgcctccccgtcctccgtgtccaagccgatcctcctcgtgccgggc600accggcaccaccggcccgcagtccttcgactccaactggatcccgctctccacccagctc660ggctacaccccgtgctggatctccccgccgccgttcatgctcaacgacacccaggtgaac720accgagtacatggtgaacgccatcaccgccctctacgccggctccggcaacaacaagctc780ccggtgctcacctggtcccagggcggcctcgtggcccagtggggcctcaccttcttcccg840tccatccgctccaaggtggaccgcctcatggccttcgccccggactacaagggcaccgtg900ctcgccggcccgctcgacgccctcgccgtgtccgccccgtccgtgtggcagcagaccacc960ggctccgccctcaccaccgccctccgcaacgccggcggcctcacccagatcgtgccgacc1020accaacctctactccgccaccgacgagatcgtgcagccgcaggtgtccaactccccgctc1080gactcctcctacctcttcaacggcaagaacatccaggcccaggccgtgtgcggcccgctc1140ttcgtgatcgaccacgccggctccctcacctcccagttctcctacgtggtgggccgctcc1200gccctccgctccaccaccggccaggcccgctccgccgactacggcatcaccgactgcaac1260ccgctcccggccaacgacctcaccccggagcagaaggtggccgccgccgccctcctcgcc1320ccggaggccgccgccatcgtggccggcccgaagcagaactgcgagccggacctcatgccg1380tacgcccgcccgttcgccgtgggcaagcgcacctgctccggcatcgtgaccccgtaatag1440atgccgaccggatctgtcgatcgacaagctcgagtttctccataataatgtgtgagtagt1500tcccagataagggaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaa1560acccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaa1620aaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaggtaccg1666<210>3<211>908<212>DNA<213>unknown<220><223>人工序列<400>3aagcttgagattcatcaatatgagaaaacagagaatggacaaccctccttctgtagtaca60gacaaaactaaaagtaatgaaagaagatgtggtgttagaaaaggaaacaatatcatgagt120aatgtgtgagcattatgggaccacgaaataaaaagaacattttgatgagtcgtgtatcct180cgatgagcctcaaaagttctctcaccccggataagaaacccttaagcaatgtgcaaagtt240tgcattctccactgacataatgcaaaataagatatcatcgatgacatagcaactcatgca300tcatatcatgcctctctcaacctattcattcctactcatctacataagtatcttcagcta360aatgttagaacataaacccataagtcacgtttgatgagtattaggcgtgacacatgacaa420atcacagactcaagcaagataaagcaaaatgatgtgtacataaaactccagagctatatg480tcatattgcaaaaagaggagagcttataagacaaggcatgactcacaaaaattcacttgc540ctttcgtgtcaaaaagaggagggctttacattatccatgtcatattgcaaaagaaagaga600gaaagaacaacacaatgctgcgtcaattatacatatctgtatgtccatcattattcatcc660acctttcgtgtaccacacttcatatatcataagagtcacttcacgtctggacattaacaa720actctatcttaacatttagatgcaagagcctttatctcactataaatgcacgatgatttc780tcattgtttctcacaaaaagcattcagttcattagtcctacaacaacatggcatccataa840atcgccccatagttttcttcacagtttgcttgttcctcttgtgcgatggctccctagccc900agtctaga908当前第1页1 2 3