本发明属于生物制药和血液制品技术领域，具体涉及血液制品制备中一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法。
背景技术：
人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrate，PCC)来自健康人血浆，是一种传统的血浆蛋白制品，除用于治疗乙型血友病外，还可用于治疗因维生素K缺乏或肝病而引起的出血症等，随着临床医生的逐步认可，PCC使用量也在逐年增加。目前，我国生产PCC的厂家不多，加之原料血浆紧张，PCC出现严重短缺，因此，其生产制备引起了各方面的关注。
目前制备人凝血酶原复合物的经典工艺为荷兰红十字血液中心提出的批式吸附工艺:用弱阴离子交换剂如sephadex DEAE A-50从原料血浆中吸附II，VII，IX，X四种凝血因子，将吸附后的A-50凝胶利用滤网分批捞出，用低离子强度的缓冲液洗涤去除吸附力弱的杂蛋白和黏附的其他成分，然后增加缓冲液的离子强度洗脱所要的蛋白，再作后续加工处理。批式吸附工艺为开放式操作，操作繁琐，且容易引起污染，交叉污染，凝胶泄漏等问题。国内人凝血酶原复合物也有以cohn法的组分Ⅲ为起始原料进行制备的报道,但此方法容易出现凝血酶原激活现象，引起用药者凝血反应，存在较大的安全隐患。
技术实现要素：
本发明提供了一种采用DEAE A-50凝胶从血浆中直接吸附出人凝血酶原复合物，将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗涤和洗脱，洗脱液经S/D灭活，灭活液不经透析浓缩直接稀释至电导值<1000us，然后使用固定床层析柱二次层析纯化得到高纯度人凝血酶原复合物产品的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
提供一种从血浆中制备人凝血酶原复合物的方法，包括以下步骤：
(1)血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液；
(2)凝胶批吸附：血浆温度控制在10-15℃，按照1.0-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE A-50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌，静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用带有压差控制器和固形物自动剥离系统的自冲洗型连续过滤器进行过滤，收集吸附后的A-50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；
(3)装柱洗脱：将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为30-40cm/h，冲洗时间约60-90min。洗涤后的A-50凝胶使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为30-40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤；
(4)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃，灭活6h。灭活后采取添加稀释液稀释的方法将电导值降至800-1000us；
(5)固定床柱层析：将capto DEAE阴离子交换凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡2-5个柱体积，S/D灭活后的稀释液使用蠕动泵层析柱，上样流速为30-40cm/h。上样完成后使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为30-40cm/h，冲洗时间约60-90min。洗涤后的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为30-40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤；
(6)超滤浓缩：使用透析液进行超滤透析，使透析出液端口的电导值低于1000us后进行超滤浓缩，控制浓缩液效价>35IU/ml；
(7)配液：超滤浓缩液使用透析液进行稀释，调节活力为30-40IU/ml，pH7-7.5，使用0.45um滤芯过滤；
(8)分装；
(9)冻干；
步骤(2)中的凝胶吸附后的血浆使用自冲洗型过滤器进行过滤，所述自冲洗型过滤器为带有压差控制器和固形物自动剥离系统的自冲洗型连续过滤器。
步骤(3)中的洗涤液由20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.1-0.5mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠组成，pH为6.8-7.0。所述洗脱液由20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-1.0mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠组成，pH为6.8-7.0。
步骤(3)中的洗脱方式为将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗涤和洗脱。
步骤(4)中的灭活后将电导值降至800-1000us的方式为按1:2的比例添加稀释液稀释。
与现有的技术相比，本发明具有以下的有益效果；
1.目前国内主要为使用sephadex DEAE A-50凝胶批吸附-洗脱-浓缩-二次批吸附-二次浓缩-分装-冻干的方法从血浆中提取人凝血酶原复合物，批式吸附工艺为开放式操作，容易引起污染，交叉污染，凝胶泄漏等问题。本发明将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗涤和洗脱，减少了开放式操作引起的污染，交叉污染，凝胶泄漏等问题。在线洗脱实现了洗脱流量和速度的精确控制，使整个工艺过程更加可控，同时固定床层析系统的在线紫外检测器使洗脱过程中对目的蛋白的收集更为高效，减少了杂蛋白的混入，所得制品纯度更高，IX因子效价可达27IU/ml以上，IX因子比活性达0.8IU/mg蛋白以上。
2.本发明中对加入凝胶后的血浆过滤时采取的方法不同于传统的单一滤网过滤，单一滤网过滤时，随着固形物浓度的升高，过滤的压差会升高，过高的压差会使脆弱的sephadex凝胶被破坏，增加了生产过程中的物料损耗，破裂后的碎胶粒流入血浆罐后会对后续的血浆中静丙和白蛋白的生产造成不利影响。通过改进工艺，采用带有压差控制器和固形物自动剥离系统的自冲洗型连续过滤器对加入凝胶后的血浆进行过滤，大大节省了生产时间成本，同时使整个过滤过程中压差稳定可控，对凝胶颗粒起到了较好的保护作用，过滤过程中流入血浆罐的碎胶粒显著减少，生产过程中的凝胶损耗可降低20％以上。
3.传统工艺中S/D灭活后需经过超滤透析步骤将洗脱液电导值降至800-1000us方可进行层析进样，操作较为繁琐，且超滤膜包耗材成本较高，通过工艺改进，将进样前处理的方式改进为按1:2的比例添加稀释液稀释，去掉了超滤透析的步骤，简化了生产工艺并显著减少了耗材成本。
附图说明
图1为从血浆中制备人凝血酶原复合物的工艺流程图；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】
血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液2kg；
凝胶批吸附：血浆温度控制在10℃，按照1.0g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE A-50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌。凝胶吸附后的血浆使用自冲洗型过滤器进行过滤，收集吸附后的A-50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；
装柱洗脱：将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为35cm/h，冲洗时间约60min。洗涤后的A-50凝胶使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为35cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液140ml，使用0.45um滤芯过滤；
S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃，灭活6h。灭活后加入280ml稀释液将电导值降至800us；
固定床柱层析：将capto DEAE阴离子交换凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡3个柱体积，S/D灭活后的稀释液使用蠕动泵层析柱，上样流速为35cm/h。上样完成后使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为35cm/h，冲洗时间约60min。洗涤后的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为35cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液；
超滤透析：使用透析液进行超滤透析，使透析出液端口的电导值低于1000us后进行超滤浓缩，控制浓缩液效价>35IU/ml，得到人凝血酶原复合物原液75ml。
【实施例2】
血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液2kg；
凝胶批吸附：血浆温度控制在15℃，按照1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE A-50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌，静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用自冲洗型过滤器进行过滤，收集吸附后的A-50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；
装柱洗脱：将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为40cm/h，冲洗时间约70min。洗涤后的A-50凝胶使用蠕动泵泵入洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液170ml；
S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃，灭活6h。灭活后加入340ml稀释液将电导值降至800us；
固定床柱层析：将capto DEAE阴离子交换凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡5个柱体积，S/D灭活后的稀释液使用蠕动泵层析柱，上样流速为40cm/h。上样完成后使用蠕动泵泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为40cm/h，冲洗时间约70min。洗涤后的层析柱使用蠕动泵泵入洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500Au后停止洗脱，收集洗脱液；
超滤透析：使用透析液进行超滤透析，使透析出液端口的电导值低于1000us后进行超滤浓缩，控制浓缩液效价>35IU/ml，得到人凝血酶原复合物原液85ml。分装，冻干得到PCC制品。经检测，所得PCC制品IX因子效价为27IU/ml以上，IX因子比活性达0.8IU/mg蛋白以上。