一种制备尿激酶的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备尿激酶的方法。

背景技术：

静脉血栓疾病是危害人类健康的主要疾病之一，我国每年心脑血管病例逾千万，治疗费用上百亿元。每年死于血栓性疾病病人达百万以上，目前临床上大多使用溶栓药治疗静脉血栓疾病，溶栓药市场的销售额已达1000多亿美元。

尿激酶作为溶栓药用于治疗静脉血栓已有几十年的历史。目前用于临床治疗的尿激酶一是直接从尿液中提取，二是在大肠杆菌中表达重组的尿激酶。国内广泛应用的尿激酶是从新鲜人尿液中提取的，不仅来源有限，严重抑制产能，存在低效纯度低等问题。而且FDA要求组织器官来源的药品必须检查传染性疾病的病原(HBV，HIV等)，并有逐步取消的可能。

欧美市场上目前广泛用于治疗静脉血栓的尿激酶是在大肠杆菌中表达分离纯化。其优点是可以大量生产且没有传染疾病的病原，但大肠杆菌是原核细胞，表达出的蛋白没有糖基化，和人体自身的尿激酶有结构上的不同，功能上也和自身的尿激酶有区别。并且，表达后从大肠杆菌的裂解液中提取纯化，需要许多步骤才能得到较为纯化的尿激酶。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种制备尿激酶的方法，用于解决从尿中提取尿激酶存在低效、低纯度，大肠杆菌中提取的尿激酶无糖基化、纯化困难的问题。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种制备尿激酶的方法，包括：

a)将尿激酶基因克隆到载体中，得到克隆质粒；

b)将步骤a)得到的克隆质粒转染进Drosophila S2细胞，得到表达尿激酶的Drosophila S2细胞；

c)对步骤b)得到的表达尿激酶的Drosophila S2细胞进行培养，对培养后的细胞进行处理，得到尿激酶。

优选的，步骤a)中所述基因为人尿激酶全基因cDNA，克隆位点为NcoI和XhoI。

所述人尿激酶全基因cDNA末端加上可表达6个组氨酸的cDNA。

优选的，步骤a)中所述载体为pMT/Bip/V5-A。

优选的，步骤a)中所述质粒N-端含有Bip信号序列(Bip-signal sequence)、所述质粒还含有氨苄青霉素和嘌呤霉素抗性基因。

优选的，处理具体为除去细胞培养上清液，加入表达液，对培养瓶进行摇晃，收集上清液，将上清液过柱，洗脱，收集尿激酶。

优选的，所述表达液为含500μM硫酸铜的无血清培养液。

优选的，摇晃条件时间为72h，转速为225r/min。

优选的，所述柱为镍柱。

优选的，所述洗脱液为含咪唑的TBS，pH为7.2。

在一些实施方案中，优选用含10-25mM咪唑、pH为7.2的TBS洗柱，然后用含250mM咪唑、pH为7.2的TBS缓冲液洗脱蛋白，并收集洗脱液。

进一步的，对步骤b)得到的表达尿激酶的Drosophila S2细胞进行筛选，得到高表达尿激酶的稳定的Drosophila S2细胞。

优选的，筛选培养液为含有10％的胎牛血清的Snyder培养液。

优选的，所述培养液添加了氨苄青霉素和嘌呤霉素，氨苄青霉素浓度为50ug/ml，嘌呤霉素浓度为2μg/ml。

进一步的，将步骤c)得到的尿激酶透析进行纯化，得到高纯度的尿激酶；

优选的，透析袋的截留分子量为10KD，透析液为pH7.2的TBS，透析时间为24h。

与现有技术相比，该方法表达尿激酶的产量高、易纯化，表达的尿激酶蛋白糖基化，和人体自身表达的尿激酶结构相似，功能相同。并且，该方法不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量生产和人体相同结构的尿激酶，投入少、产出高，溶栓效果好，无毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1和图2为实施例1中质粒信息；

图3为实施例2中得到的尿激酶纯度分析图，图左是纯化前的电泳图，图右是纯化后的电泳图；

图4为实施例3中使用表面等离子体共振方法测试尿激酶和其受体结合的结果图，图a是不同浓度的uPA与uPAR的相互作用图，图b是阴性对照图；

图5为实施例4中尿激酶激活纤溶酶原产生纤溶酶的SDS/PAGE结果图，其中泳道“+”为加入尿激酶的SDS/PAGE结果图，泳道“-”为未加入尿激酶的SDS/PAGE结果图，complex为复合物，plasminogen为纤溶酶原，anti-plasmin为抗纤溶酶。

具体实施方式

实施例1

将人尿激酶全基因cDNA，以NcoI和XhoI的位点克隆到可以在Drosophila S2细胞表达的载体pMT/Bip/V5-A中，并在尿激酶cDNA的末端加上可表达6个组氨酸的cDNA(CAT CAT CAC CAT CAC CAT)便于纯化。质粒N-端含有Bip-signal sequence，使得表达后的尿激酶可以出细胞便于纯化；含有氨苄青霉素和嘌呤霉素抗性基因，便于筛选。质粒信息如图1、图2所示。

实施例2

将实施例1得到的质粒转染进Drosophila S2细胞中，具体操作为：将Drosophila S2细胞置于70-90％的转染混合液，稀释Reagent的转染试剂于培养基(1:1比例稀释)，稀释质粒于培养基。将稀释的质粒加入稀释的2000试剂，然后孵育45min，将该混合液加入细胞中。

转染48小时后用含2μg/ml嘌呤霉素和50μg/ml氨苄青霉素的10％胎牛血清的Snyder培养液进行筛选。没有转染成功细胞在该培养液中1-2d内凋亡裂解，转染成功的细胞在该培养液中能够存活并传代。每四天更换一次培养基，经过3周的筛选，得到可以表达尿激酶的Drosophila S2细胞。

将可以表达尿激酶的Drosophila S2细胞传代扩增，经过一周扩增，细胞达到1L、浓度为2×10⁶个/ml时，去掉细胞培养上清液，将细胞置于1L含500μM硫酸铜的无血清培养液的表达液中，将培养瓶以225r/min的转速摇晃72h。之后，离心收取含有尿激酶的上清液，将含有尿激酶的上清液缓慢通过用特异组氨酸肽链的胶粒(effective Ni-NTA resin)装备的柱中，使尿激酶通过末端的6个组氨酸和特异组氨酸肽链的胶粒结合留在柱子中，其它杂质因没有6个组氨酸不能结合留在液体中。用1升洗液(Tris-buffer saline(TBS)pH 7.2,含10-25mM咪唑)洗柱，低浓度的咪唑洗去没有和胶粒结合的非特异性蛋白，然后用含有高浓度的咪唑(250mM)洗脱液将蛋白从胶粒上分离到洗脱液中。将洗脱液置于透析袋中在透析液(Tris-buffer saline(TBS)pH 7.2)中透析24h，收集透析后的洗脱液得到纯化的尿激酶。用SDS胶分析得到的尿激酶纯度，结果如图3所示。

实施例3

在BIAcore 2000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)中通过表面等离子体共振(SPR)分析实施例2得到的uPA与其受体uPAR之间的相互作用。根据制造商的说明书，使用胺偶联将uPAR固定在CM5芯片(BIAcore AB)的羧甲基葡聚糖表面。对于固定程序，使用pH 5.5的乙酸钠缓冲液将uPAR稀释至2.5μg/ml的终浓度。将uPAR在10μl/min的流速下在分开的流动池中固定在表面7分钟，在剩余的两个流动池中通过胺偶联活化然后立即失活制备参考表面。动力学测量时，注射6种不同浓度的uPA 3分钟，然后是10分钟解离相。在每个循环的末端，通过1分钟注射1M NaCl，然后用0.02M 6-氨基己酸注射1分钟，以及用磷酸盐/盐水缓冲液短暂洗涤步骤，使表面再生。实验在含有0.1M NaCl的0.04M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中以30μl/min的流速进行。假设在双分子反应模型中的1:1化学计量，使用BIA评估软件(版本3.1)通过全局曲线拟合分析所获得的uPA浓度系列的传感图的结合和解离相。Chi2分析支持该模型，在不同时间的uPA分析揭示约±20％的变异性。试验结果如图4所示，和阴性对照相比，反应值超过100，说明实施例2得到的尿激酶可以和其受体相结合。

实施例4

使用纤溶酶原激活的动力学分析实施例2得到的尿激酶的活性。被催化的纤溶酶原的浓度为其估计的活性指数的3.0倍，在0.05M赖氨酸存在下温育。通过加入尿激酶启动活化，并在37℃下在分光光度计中跟踪405nm处的吸光度变化。1分钟后，通过加入50％冰醋酸终止反应，并相对于参照空白测量405nm处的吸光度。通过SDS/PAGE研究抗纤溶酶与由uPA激活的纤溶酶形成稳定复合物的能力。试验结果如图5所示，纤溶酶原经尿激酶的激活形成纤溶酶，纤溶酶和抗纤溶酶结合形成复合物，在SDS胶上可以看到大分子复合物，说明实施例2得到的尿激酶可以激活纤溶酶原产生纤溶酶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。