一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA及其siRNA和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA及其siRNA和应用，该基因cDNA全长为1867bp序列如SEQ.ID.NO.3所示。在获取了其具体的序列之后，并设计siRNA序列进行转染；采用该片段敲低HEC-1-B细胞中该长非编码RAN分子的表达后，发现肿瘤细胞的增殖活性下降。因此该基因的功能可能与癌细胞的增殖能力相关。采用干扰片段siRNA1535敲低基因的表达水平后，肿瘤细胞的增殖活性明显下降，可应用于抗肿瘤药物的制备。
【专利说明】—种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA及其siRNA和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤分子生物学【技术领域】，涉及一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA及其siRNA和应用。
【背景技术】
[0002]子宫内膜癌(endometrialeareinoma, EC)是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20~30%，是最常见的生殖道恶性肿瘤之一，在世界范围内其发病率和病死率均有上升趋势。在某些欧美国家，子宫内膜癌己经成为妇科恶性肿瘤的首位。国内子宫内膜癌发病率也不断升闻。子宫内膜癌发病率的增加可能与人均寿命延长、肥胖者增多、外源性雌激素的应用等因素有关。
[0003]通过比较基因组与蛋白质组学研究，科学家们发现在子宫内膜癌组织中存在大量基因的突变与缺失，并存在大量异于正常组织的基因表达产物。这些结果都揭示了在子宫内膜癌组织中特殊的细胞代谢模式以及基因表达调控方式。[0004]人类基因组并不是由孤立的基因和大量“垃圾DNA”组成的，所谓的垃圾基因实际上非常少。随着分子生物学相关技术的不断发展科学家们发现人类基因组93%的序列都能够转录，其产物就主要为Inc RNA。这是一系列不编码蛋白质，但与基因表达调控，细胞生理过程等生物学事件相关的RNA分子。这一类分子具有特殊的表达模式，分子结构，以及生物学功能。
[0005]研究表明人类的许多疾病都和Inc RNA的表达异常相关，如白血病、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、阿尔茨海默病和糖尿病等。近年来科学家们发现了大量的与肿瘤发生发展密切相关的Inc RNA。H19是最早被发现的与肿瘤相关的长片段ncRNA，其丢失与过表达与肝癌和乳腺癌的肿瘤发生密切相关。MALAT-1 [14]的异常表达与NSCLC (非小细胞肺癌)的转移密切相关。在前列腺癌中DD3是一个非常灵敏的分子标志物，DD3可以在极高的正常细胞背景中指示癌细胞的存在，因此成为前列腺癌治疗与检测的重要的分子标志物。
[0006]然而在子宫内膜癌中具有功能Inc RNA或Inc RNA分子标志物却鲜见报道。因此对子宫内膜癌中Inc RNA分子的研究有助于发现新的肿瘤相关标志物分子及新的治疗靶标。
【发明内容】
[0007]本发明解决的问题在于提供一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA及其siRNA和应用，该基因与癌细胞的增殖能力相关，针对其设计siRNA可应用于抗肿瘤的药物的制备。
[0008]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0009]—种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA,其cDNA序列如SEQ.1D.N0.3所不。
[0010]所述其截短的、能够作为SiRNA作用靶点的cDNA序列如SEQ.1D.N0.4所示。
[0011]所述其合适的siRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示。
[0012]一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的全长cDNA序列的获取方法，包括以下操作:
[0013]I)通过对子宫内膜癌及癌旁组织中长非编码RNA分子表达水平差异进行分析筛选，获得了在子宫内膜癌组织中高表达的长非编码RNA分子信息；
[0014]2)利用 Out Primerl 和 Inner Primerl 进行巢式 PCR 扩增，获得 5’ RACE 的 cDNA序列；
[0015]所述白勺 Out Primerl:agcgcctgag tgggtttcgg ；
[0016]所述的 Inner Primerl:gggggtcata ctccccgaaa gg ；
[0017]3)利用 Out Primer2 和 Inner Primer2 进行巢式 PCR 扩增，获得 3’ RACE 的 cDNA序列；
[0018]所述的 Out Primer2:ttaatagatt aggcacagga tgggt ；
[0019]的 Inner Primer2:caggatgggt gtttaattct cggcaa ；
[0020]4)通过5’RACE及3’RACE序列的重叠区域拼接后，得到该长非编码RNA分子cDNA全长序列。
[0021]一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.6所
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[0022]所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0023]所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA作为作用靶点在抗肿瘤药物中的应用。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0025]本发明提供的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA，是通过长非编码RNA芯片技术对3组子宫内膜癌及其邻近癌旁组织中差异表达的长非编码RNA进行了分析筛选，获得了在子宫内膜癌组织中高表达长非编码RNA分子。在获取了其具体的序列之后，并设计siRNA序列进行转染；采用该片段敲低HEC-1-B细胞中该长非编码RAN分子的表达后，发现肿瘤细胞的增殖活性下降。因此该基因的功能可能与癌细胞的增殖能力相关。 [0026]本发明提供的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA,其设计起始位点为1535nt，对长非编码RNA表达的干扰敲低效果达到了 50%以上，采用干扰片段siRNA1535敲低基因的表达水平后，肿瘤细胞的增殖活性明显下降，可应用于抗肿瘤药物的制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为5’ RACE琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0028]图2为3’ RACE琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0029]图3为全长截短片段琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0030]图4为ORF Finder序列分析比对结果；
[0031]图5为siRNA敲低效率结果；
[0032]图6为siRNA作用下子宫内膜癌肿瘤细胞增殖活性曲线。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0034]本发明通过对子宫内膜癌及癌旁组织中长非编码RNA分子表达水平差异进行分析筛选，获得了在子宫内膜癌组织中高表达的长非编码RNA分子信息。根据UCSC中公布的该分子的部分序列设计实施5’ RACE及3’ RACE的巢式PCR引物，获得了长非编码RNA分子5’及3’末端的序列信息。并通过5’ RACE及3’ RACE序列的重叠区域拼接后，得到该长非编码RNA分子cDNA全长序列。基于全长cDNA序列设计引物，获得了全长的截短序列。并根据全长的截短序列信息设计筛选出有效的siRNA片段。采用该片段敲低了长非编码RNA分子在子宫内膜癌细胞HEC-1-B中的表达水平，使癌细胞的增殖活性降低。
[0035]本发明通过以下技术方案实施。
[0036]1、标本采集
[0037]于术中采集子宫内膜癌及癌旁组织标本，生理盐水清洗后保存于液氮或-80°C超低温冰箱中。
[0038]组织标 本于2010年6月-2011年3月，在西安交通大学第一附属医院手术室，由翟文采集。
[0039]2、芯片分析
[0040]选取3对子宫内膜癌与癌旁组织标本Trizol冰浴匀浆，干冰运输。由上海康成生物公司提取RNA并进行芯片杂交检测，数据分析并提供报告。
[0041]具体采用了 Arraystar公司的IncRNA芯片，该芯片覆盖所有来自Refseq，UCSCKnown Gene, NRED,RNAdb,H-1nvDB,Fantom3等权威数据库注释为IncRNA的转录本,并在此基础上收录了相关文献中报道的IncRNA，是目前覆盖最为全面的IncRNA芯片。利用IncRNA芯片筛选标本中存在差异表达的IncRNA。
[0042]根据芯片分析及标本验证结果，发现了一个在子宫内膜癌组织中高表达的长非编码RNA分子(其对应芯片当中的位置信息为chr1: - 28777638~-28782082)，其分析结果肿瘤组 vs 对照组:fold change>3 ;p_value〈0.05,称其为 EUlncRNAl。
[0043]3、引物设计
[0044]根据位置信息为chrl在UCSC(Mar.2006)中查找该长非编码RNAEUlncRNAl的部分序列信息，并根据获取的序列信息采用Primer Premier5.0设计了 EUlncRNAl的5’RACE及3’ RACE巢式PCR引物。具体如表1所示。
[0045]表15 ’ RACE 及 3 ’ RACE 巢式 PCR 弓丨物
[0046]
【权利要求】
1.一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA，其特征在于，其cDNA序列如SEQ.1D.N0.3所示。
2.如权利要求1所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA，其特征在于，其截短的、能够作为siRNA作用靶点的cDNA序列如SEQ.1D.N0.4所示。
3.如权利要求1所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA，其特征在于，其合适的siRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示。
4.一种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的全长cDNA序列的获取方法,其特征在于，包括以下操作: 1)通过对子宫内膜癌及癌旁组织中长非编码RNA分子表达水平差异进行分析筛选，获得了在子宫内膜癌组织中高表达的长非编码RNA分子信息；2)利用OutPrimerl和Inner Primerl进行巢式PCR扩增，获得5’ RACE的cDNA序列；
所述的 Out Primerl:agcgcctgag tgggtttcgg ；
所述的 Inner Primerl:gggggtcata ctccccgaaa gg ；3)利用OutPrime r2和Inner Primer2进行巢式PCR扩增，获得3’ RACE的cDNA序列；
所述的 Out Primer2:ttaatagatt aggcacagga tgggt ；
所述的 Inner Primer2:caggatgggt gtttaattct cggcaa ； 4)通过5’RACE及3’ RACE序列的重叠区域拼接后，得到该长非编码RNA分子cDNA全长序列。
5.—种与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA,其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.6 所示。
6.权利要求5所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.权利要求1或2所述的与子宫内膜癌相关的长非编码RNA作为作用靶点在抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK103937798SQ201410166296
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】陈葳, 李旭, 翟文, 薛梅, 吴文婧 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院