扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用。该基因为MrLEA2编码基因，来源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或者具有序列表中SEQIDNO.1中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因；或者具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；或者具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNO.2衍生的蛋白质。本发明所获得的基因可用于改良植物和微生物的抗盐、抗冻和耐热性。
【专利说明】扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物基因工程【技术领域】，尤其涉及扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其应用。
【背景技术】
[0002]晚期胚胎发生丰富蛋白(Lateembryogenesis abundant potein, LEA)最早发现于棉花种子中，因其在胚胎发育后期大量积累而得名(Dure et al.，1981)，同时低温、干旱以及盐碱等胁迫，以及脱羧酸(ABA)也会诱导晚期胚胎发生丰富蛋白在植物营养器官中积累。后续研究发现，晚期胚胎发生丰富蛋白不仅存在于植物中，而且在耐辐射球菌(Deinococcus radiodrurana)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、齒虫(Artemia)、线虫以及轮虫(rotifer)中也发现存在晚期胚胎发生丰富蛋白的证据。根据氨基酸序列特征、氨基酸组成上的差异，可将晚期胚胎发生丰富分为不同的类群。
[0003]晚期胚胎发生丰富蛋白在细胞内的功能与细胞脱水保护有关。通过转基因技术，将大麦中的HVAl基因转入小麦和水稻，可提高转基因植株的抗旱性；过量表达小麦PM80和PMA1959能够改善水稻植株的抗脱水胁迫能力；将柑橘中编码晚期胚胎发生丰富蛋白CuC0R19的基因导入到烟草中后能够提高转基因植株的抗冷性；在拟南芥中，将小麦WCS19、拟南芥C0R15A基因单独过量表达，或者将RAB18、CORl7, C0R47、XER02和ERDlO五个基因同时过量表达均能够提高转基因植物抵御冻害的能力；小麦脱水蛋白基因WC0R410(晚期胚胎发生丰富蛋白家族成员之一)过表达能够增强草莓的抗冻性。因此，晚期胚胎发生丰富蛋白可能是包括植物、细菌以及低等动物细胞获得脱水忍耐性的决定性因素之一，尽管其具体的机制尚不清楚。同时，晚期胚胎发生丰富蛋白基因也在植物干旱、低温、高盐等非生物胁迫抗性改良中具有重要的潜在应用价值
除了植物遗传转化试验以外，利用大肠杆菌和酵母等异源表达系统也被广泛用来进行晚期胚胎发生丰富蛋白的鉴定。在酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中小麦晚期胚胎发生丰富蛋白过量表达能够提高渗透胁迫的耐受性；将大麦、轮藻的晚期胚胎发生丰富蛋白引入酵母后可以获得对高盐和冷冻胁迫的耐受性。大豆晚期胚胎发生蛋白在大肠杆菌中过表达，能够提高细菌对盐胁迫的耐受性。因此，利用酵母、大肠杆菌表达系统可以作为鉴定晚期胚胎发生丰富蛋白的高效快速体系。
[0004]扁猜豆(Medicago ruthenica)广泛分布于我国北方地区，具有极强的抗逆境能力，是唯一能够在高海拔极端高寒地区正常越冬的苜蓿属多年生豆科牧草。目前还没有扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因克隆和抗逆性功能鉴定的报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种改良植物和微生物抗盐、抗冻和耐热性的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因。
[0006]本发明所要解决的另一个技术问题是提供基于该基因在植物和微生物抗盐、抗冻和耐热改良方面的应用。
[0007]为解决上述问题，本发明所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于:该基因为MrLEA2编码基因，来源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
[0008]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。
[0009]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所不的氣基酸残基序列的蛋白质。
[0010]所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白质；所述由SEQ ID N0.2衍生的蛋白质的序列与所述等位基因的序列相对应。
[0011]如上所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因在改良植物和微生物抗盐、抗冻和耐热方面的应用。
[0012]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明通过转录组学分析，从而表明扁蓿豆含有晚期胚胎发生丰富蛋白基因。而本发明通过RT-PCR技术，在扁蓿豆中分离到一个新的晚期胚胎发生丰富蛋白基因及其编码基因MrLEA2。用原核表达手段，将MrLEA2基因编码区链接到大肠杆菌表达载体后，将该原核表达载体转入大肠杆菌表达菌株，用IPTG诱导后实现了 MrLEA2蛋白在大肠杆菌中的过量表达，结果显示，MrLEA2蛋白过量表达在逆境胁迫下对大肠杆菌具有保护效果，因此，通过生物技术方法可将该基因用于改良植物和微生物的抗盐、抗冻和耐热性。
[0013]2、通过对本发明中的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因进行RT-PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳(如图1，图4-7所示)，可以看到扁蓿豆具有1.2kb的蛋白质条带，因此，表明在扁蓿豆中有晚期胚胎发生丰富蛋白基因表达。
[0014]3、通过将本发明中的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因的编码区连接到大肠杆菌表达载体，经过酶切鉴定后(如图8所示)，转化大肠杆菌表达载体，经含有如上述构建的MrLEA2基因的原核表达载体的大肠杆菌经过IPTG诱导后，对培养物菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果显示诱导后的大肠杆菌培养物种具有一条与预期分子量相近的蛋白条带(如图9所示)，因此扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2能够在大肠杆菌中过量表达。
[0015]4.通过对过量表达本发明中的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2在大肠杆菌在含有高盐胁迫、热胁迫和冻融处理，观察如上所述大肠杆菌的生长存活情况，结果显示MrLEA2蛋白过量表达能够提高大肠杆菌宿主对高盐胁迫、热胁迫和冻融处理的耐受性(如图l(Tll所示)，因此MrLEA2蛋白在高盐胁迫、热胁迫和冻融处理下对细胞具有保护效果。
[0016]5、本发明的基因结构特征:
本发明根据对扁蓿豆转录组测序结果，设计PCR引物，其中引物P1+P2用于扩增含有5’ -和3’ -非翻译区和编码区的MtLEA2基因序列(图1-2)，引物P3+P4扩增MrLEA2基因编码区核苷酸序列，用于原核表达鉴定克隆基因的功能活性。
[0017]用引物P1+P2，扁蓿豆cDNA为模板进行扩增，得到约1.2kb的条带(图1)。测序后获得MrLEA2基因1181bp如图2和序列表SEQ ID N0.1所示的含有5’-和3’-非翻译区和编码区的MtLEA2基因序列，其中57-1025位为翻译区。由SEQ ID N0.1序列推导出的氨基酸序列如图2和序列表SEQ ID N0.2所示。该氨基酸序列显示，蛋白质产物由322个氨基酸残基组成，其中天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸分别占氨基酸残基总数的11.8%，分子量为36.1kD,等电点为 4.55,平均疏水性(Grand average hydropathy, GRAVY)指数为-0.4276,具有较强的亲水性。Pfam数据库(http://pfam.janelia.0rg)数据库对MrLEA2编码的氨基酸序列的结构域进行搜索表明，MrLEA2蛋白属于LEA_2蛋白家族，存在两个保守的分别位于81位到174位之间和205位到299位氨基酸之间的LEA_2蛋白结构域(图3)。在NCB数据库中利用BLAST对MrLAE2编码蛋白质的氨基酸序列和其它物种蛋白质氨基酸序列比较(图3)发现与截型苜猜(Medicago truncatula)氨基酸序列一致性(identity)最高,为96%。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019]图1为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白RT-PCR克隆产物电泳图谱。
[0020]图2为本发明MrLEA2基因cDNA序列及其所编码蛋白质的氨基酸序列。
[0021]图3为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2和其它物种LEA_2蛋白氨基酸序列的比对分析；其中MtLEA14 (XP_003617191.1)来自截型苜蓿(Medicago truncatula), TcLEA2 (E0Y06968.1)来自可可(Theobroma cacao), GmT,RA2(NP_001241079.1)来自大 ? (Glycine max), At2g44060 来自拟南芥(Arabidopsisthaliana).下划线LEA_2蛋白示两个保守区段。
[0022]图4为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因在模拟脱水胁迫处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析，actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。
[0023]图5为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因在模拟NaCl胁迫处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析，actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。
[0024]图6为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因在ABA处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析，actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。
[0025]图7为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因在低温处理下基因表达水平的半定量RT-PCR分析，actin为用于内标的扁蓿豆肌动蛋白基因。
[0026]图8为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2的原核表达载体pET_MrLEA2的酶切鉴定图谱。其中”B/S”为BamH I和Sac I双酶切消化处理的pET_MrLEA2载体，”B”为BamH I单酶切消化处理的pET_MrLEA2载体，”S”为Sac I单酶切消化处理的pET_MrLEA2载体，” P”为未做酶切消化处理的pET-MrLEA2载体。
[0027]图9为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的SDS-PAGE鉴定。其中pET和LEA分别表示含有pET_30a(+)和pET_MrLEA2载体的总蛋白，和“ + ”分别表示IPTG诱导前和诱导后的总蛋白，实心三角符号指示诱导表达的MrLEA2目的蛋白条带。
[0028]图10为本发明扁猜?晚期胚胎发生丰g蛋白MrLEA2在大肠杆囷中表达后对宿主菌的逆境胁迫保护效果的菌液滴板试验。其中NaCl和KCl为高盐胁迫、Heating和冷冻Freezing分别为50°C热胁迫和冻融处理，pET和LEA分别表示含有pET_30a(+)和pET-MrLEA2载体的BL21 (DE3)大肠杆菌菌株。
[0029]图11为本发明扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2在大肠杆菌中表达后对宿主菌的逆境胁迫保护效果的菌落计数统计结果。其中NaCl和KCl为高盐胁迫、Heating和冷冻Freezing分别为50°C热胁迫和冻融处理，pET和LEA分别表示含有pET_30a(+)和pET-MrLEA2载体的BL21 (DE3)大肠杆菌菌株。
【具体实施方式】
[0030]实施例1扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，该基因为MrLEA2编码基因，来源于扁蓿豆，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
[0031]一、扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白MrLEA2基因的克隆。
[0032]1、扁蓿豆幼苗低温胁迫处理与转录组测序:
⑴扁蓿豆低温胁迫处理: 将扁蓿豆种子用浓硫酸处理IOmin后，用自来水冲洗去除残余硫酸。上述经过处理的种子置于铺有双层滤纸培养皿，在21°C、16h/8h光周期条件下发芽；14d以后，将幼苗移栽到蛭石中继续在上述条件下培养，每周用不含1/2MS营养液浇灌一次；14d以后将幼苗转移至-4°C光照培养培养箱进行低温处理24h，在低温处理前和处理后，取整株幼苗，清洗干净根部，用吸水纸洗净剩余水分后液氮速冻，-80 V保存。
[0033]⑵转录组测序:
将低温处理前和处理后的幼苗，送深圳华大基因科技服务有限公司进行总RNA提取和转录组测序。
[0034]2、引物设计:
根据转录组测序结果设计PCR引物，具体如下:
Pl 5， -CTCTCTCTCTCTCTCTCATCACTG-3，
P2 5’ -CTGACTGAACGGACATACTCACT-3’
3、总RNA提取与cDNA第一链合成:
将上述低温胁迫处理的样品在液氮中研磨成粉末后，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)按照其说明书提取总RNA。总RNA用501 μ L DEPC水溶解，调整浓度为IOOng/ μ L。
[0035]cDNA第一链合成反应使用PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)(Takara,大连)试剂盒按照其说明书进行。
[0036]4、MrLEA2 基因 cDNA 序列扩增:
PCR 反应体系由 10 yL 2X Buffer Ι,16μ L dNTPU μ I Pl (10 μ Μ)、1 μ I Ρ2(10 μ Μ),0.1 μ I L LA Taq DNA 聚合酶(Takara 产品)、0.1μ1 Pyrobest DNA 聚合酶(Takara产品)、I μ I cDNA第一链合成产物组成，并用ddH20(重蒸水)加至终体积为20 μ I。
[0037]其中:2X Buffer I为与LA Taq DNA聚合酶配套缓冲液。
[0038]dNTP由dATP (三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dTTP (脱氧胸苷三磷酸)、dGTP (脱氧鸟苷三磷酸三钠)和dCTP (脱氧胞苷三磷酸)组成；dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为2.5mM。
[0039]PCR反应体系按下列程序进行:
【权利要求】
1.扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于:该基因为MrLEA2编码基因，它具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.1第I位到1181位中因一个或多个碱基的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。
3.如权利要求1所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所不的氣基酸残基序列的蛋白质。
4.如权利要求3所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因，其特征在于:所述基因具有序列表中SEQ ID N0.2第I位到322位所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.2氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白质；所述由SEQ ID N0.2衍生的蛋白质的序列与所述等位基因的序列相对应。
5.如权利要求1、2、3或4所述的扁蓿豆晚期胚胎发生丰富蛋白基因在改良植物和微生物抗盐、抗冻和耐热方 面的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103911385SQ201410166211
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】王海庆, 马超, 沈迎芳, 窦全文, 陈志国 申请人:中国科学院西北高原生物研究所