一种通过慢病毒表达系统高效表达的丙型肝炎病毒非结构蛋白ns3抗原的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过慢病毒表达系统高效表达的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原。所述重组HCVNS3抗原包括完整的1b型HCV非结构蛋白NS3，N端引入分泌信号肽SP（MWTLVSWVALTAGLVAG），C端添加6His标签，以利于目的蛋白的分离纯化。本发明通过构建含有HCVNS3基因序列的慢病毒表达载体，与慢病毒包装辅助质粒PMD2.G和psPAX2共转染293T细胞后可包装成为具有感染活性的重组慢病毒LV-NS3，感染人肝癌细胞株Huh7.5.1后可大量表达与HCV自然感染状态最相近的NS3抗原。该慢病毒介导的HCVNS3抗原表达系统相比之前的大肠杆菌等原核表达系统所表达的NS3蛋白具有特异性强、免疫活性高、稳定性好和安全性高等特点。
【专利说明】一种通过慢病毒表达系统高效表达的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种通过慢病毒表达系统高效表达的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(!fepatitis C virus, HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要通过输血、针刺、吸毒等血液途径传播。据世界卫生组织统计，目前全世界范围内，大约有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒，仅中国就有大约4千万名HCV感染者，感染率约为3.2%，是HCV感染的高流行区。丙型肝炎病毒感染者中50-85%发展成为慢性肝炎，其中10-20%进一步发展为诸如肝硬化等复合慢性肝病，1-5%的病人在二三十年后发展为肝癌。
[0003]丙型肝炎病毒是一种黄病毒科肝病毒属的病毒，其基因组由结构(核心，囊膜)和非结构(蛋白酶，螺旋酶，酶辅助因子)蛋白及非编码区组成。其中丙型肝炎病非结构蛋白NS3具有丝氨酸蛋白酶、解旋酶和NTP酶活性，是HCV病毒复制中重要的功能蛋白之一，其相应抗体出现早，检出率高，因此NS3抗原已成为当今血液筛查诊断试剂的主要原料。
[0004]目前对丙型肝炎病毒感染者的筛查仍缺乏十分有效的快速诊断试剂。我国献血者HCV感染筛查使用的两遍Elisa检测方法符合率仅在50%左右，假阳性率高达30%，对献血者队伍造成极大损害。当前检查方法使用的抗原为重组大肠杆菌表达的core、NS3、NS4和NS5等抗原，存在反应性弱、非特性强的不足，严重影响了 HCV抗体检测的准确性。利用真核表达系统表达HCV抗原，其加工修饰过程更利于氨基酸链折叠为天然构象的蛋白，具有更高的特异性。且真核表达系统表达的蛋白有更低的免疫原性，可降低原核表达系统带来的非特异性。
[0005]慢病毒(Lentivirus，LV)为一类逆转录病毒的亚群。由HIV-1改建而来的慢病毒载体系统以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来研究者们的主要选择。由于LV既能感染处于分裂期的细胞，又能感染处于非分裂期的细胞，而且由LV携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力，使得目的基因可在宿主细胞内的长期而稳定表达。同时，慢病毒感染目的细胞的过程与天然HCV病毒感染细胞的过程比较相似，但慢病毒无法自我复制，具有较高的生物安全性。综上所述，与其他逆转录病毒载体相比，LV具有较高的基因转导效率，蛋白表达具有长期稳定性及较高的生物安全性。因此，以携带重组HCV NS3基因的慢病毒载体为表达载体，包装为重组慢病毒后感染目的细胞促使其大量表达NS3抗原的方法具有重大优势与意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种通过慢病毒表达系统高效表达的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原。
[0007] 本发明所采取的技术方案是:一种通过慢病毒表达系统高效表达的重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原。
[0008]所述的重组HCV NS3抗原包括SEQ ID N0.5所示的NS3蛋白；在NS3蛋白的N端引入分泌型信号肽SPjn SEQ ID N0.1所示；C端添加6His标签。
[0009]一种特异表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的慢病毒表达系统，其是通过在pHAGE-fulIEFla-MCS-1ZsGreen质粒的多克隆位点正向插入重组HCV NS3基因序列所得，所述重组HCV NS3基因序列包括Nhe I酶切位点、Kozak序列、17个氨基酸的分泌信号肽SP基因序列、Ib型HCV非结构蛋白NS3全长cDNA序列、6His标签蛋白基因序列、终止序列和Xba I酶切位点。
[0010]该慢病毒表达系统的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所不。
[0011]上述慢病毒表达系统在293T细胞内包装成的重组慢病毒LV-NS3。
[0012]一种通过慢病毒表达系统表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原的方法，包括如下步骤:
(1)将上述的慢病毒表达系统与两个辅助质粒PMD2.G和psPAX2共转染293T细胞，通过293T细胞包装成具有感染活性的携带有HCV NS3基因的重组慢病毒LV-NS3 ；
(2)将重组慢病毒LV-NS3感染Hun7.5.1细胞，特异性促进Huh7.5.1细胞大量表达HCVNS3抗原。
[0013]上述的重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原、慢病毒表达系统、重组慢病毒LV-NS3在制备丙型肝炎诊断试剂、预防或治疗丙型肝炎药物中的应用。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性效果:本发明中使用了真核表达系统替代原有的原核表达系统，由此克服了大肠杆菌表达系统所表达的HCV NS3蛋白免疫原性高、反应性弱及非特性强等缺点。Huh7.5.1细胞系来源于人肝癌细胞系，是用于体外HCV相关研究的主要细胞系，相比于其他组织细胞更易于表达HCV相关蛋白，且加工折叠后的蛋白更接近天然蛋白的构象与活性，可用于HCV NS3蛋白的大量表达。与此同时，携带有NS3 cDNA序列的慢病毒感染Huh7.5.1后表达NS3抗原的方式非常接近于HCV天然病毒感染Huh7.5.1过程，且慢病毒不能自主复制。因此，利用慢病毒感染真核细胞表达的HCV NS3抗原具有安全性高、天然活性强、稳定性好和特异性强等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:慢病毒载体 pHAGE-fulIEFl a -MCS-1ZsGreen 质粒图谱；
图 2:NS3 重组抗原表达载体 pHAGE-fulIEFl a -NS3-MCS_IZsGreen 示意图；
图3:pHAGE-fullEFl a -NS3-MCS_IZsGreen载体酶切鉴定结果示意图；
图 4:pHAGE-fullEFl a -NS3-MCS_IZsGreen 载体测序结果示意图；
图5:绿色荧光标签蛋白ZsGreen分析图；
图6:目的蛋白NS3免疫荧光分析图；
图7:目的蛋白NS3 Western-blot分析图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。[0017]以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]实施例1构建NS3蛋白表达载体
(1)根据NS3基因的编码序列，设计上、下游引物，在上游引物前依次添加保护碱基、酶切位点Nhe 1、Kozak序列及信号肽MWTLVSWVALTAGLVAG (SEQ ID N0.1)的基因序列，在下游引物添加6His Tag标签、终止序列、酶切位点Xba I和相应保护碱基。
[0019]上游引物:
5’ -CTAGCTAGCGCCACCATGTGGACCCTGGTGAGCTGGGTGGCCTTAACAGCAGGGCTGGTGGCTGGAGCGCCCATCACGGCC- 3，(SEQ ID N0.2)
下游引物:
5’-CTAGTCTAGATTAATGGTGATGGTGATGGTGATGATGGGTGACAAC-3’ (SEQ ID N0.3)
(2)取QG质粒(accessionN0.:KF285485)(由本实验室李婷婷博士提供。地址:广州市广州大道北1838号南方医科大学生物技术学院输血医学系。E-mail:1itingtinglttigmail.com)，采用PCR方法从中扩增HCV病 毒完整NS3非结构蛋白基因片段(如SEQ ID N0.4所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示)，其电泳回收后与pMD19T-simple (购自Takara)载体连接得到连接产物pMD19T_NS3载体，连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，均匀涂布到含氨苄青霉素的LB培养基平板上，于37°C培养12h。从培养板上挑取4个单菌落培养保存，各取0.5ul菌液用扩增NS3基因的引物做菌液PCR初步鉴定，将菌液PCR鉴定阳性的重组载体送Invitrogen广州分公司测序。
[0020]用Axygen Plasmid Mini Kit 提取测序正确的 pMD19T_NS3 质粒后用 Nhe I 和Xba I双酶切，进行电泳回收目的重组DNA片段。
[0021]另取慢病毒载体pHAGE-ful IEFl a -MCS-1ZsGreen质粒(质粒图谱如图1所不，质粒详细信息见:http://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetai1.do?vectorid=2330由南方医科大学肿瘤研究所史俊文博士提供。地址:广州市广州大道北1838号南方医科大学肿瘤研究所。E-mail: 952158621@qq.com)，用Nhe I和Xba I进行双酶切，回收去除Nhe I和Xba I两位点间的DNA片段，并与所述重组DNA片段连接，得到NS3慢病毒表达载体pHAGE-fulIEFla-NS3-MCS-1ZsGreen (图2)。将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5a中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，于37°C培养12h。从培养板上挑取6个单菌落培养保存，各取0.5ul菌液用NS3基因的引物做菌液PCR初步鉴定，表明5号和6号单菌落能成功扩增出NS3基因，接着提取5号和6号质粒，用Nhe I和Xba I双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，表明5号质粒酶切鉴定正确，将5号质粒送Invitrogen广州分公司测序。
[0022]测序结果显示pHAGE-fullEFl a -NS3-MCS_IZsGreen 完全正确(图 4)，序列如 SEQID N0.6 所示。
[0023]将之前保存菌液按1:1000接种20ml LB培养基，37°C 220rpm培养12小时，用Axygen Endo-Free Plasmid Mini Kit 提取 pHAGE-fullEFl a-NS3-MCS_IZsGreen 质粒。
[0024]实施例2慢病毒的包装培养293T细胞，转染前24小时传代状态良好的293T细胞至T25cm2培养瓶中，3X IO6个/瓶。转染前30min，将待转染细胞的培养液更换为3 ml Opti_MEM。取无菌1.5ml EP管，加入 430 μ I Opt1-MEM，重组表达质粒 pHAGE-fullEFl a -NS3-MCS_IZsGreen 2.67 μ g,包装辅助质粒PMD2.G2 μ g及脂质体转染试剂X-tremeGENE HP 17ul(购
自Roche Applied Science)。加入所有成份后,轻弹管壁充分混匀，室温放置20min。简短离心收集管壁液体后，将其逐滴加入至含有细胞培养瓶中。约60小时后，收集含有重组慢病毒LV-NS3的细胞培养上清。3000rpm 4°C离心15min。弃沉淀，收集离心后的上清，分装LV-NS3病毒上清于1.5ml EP管，每管Iml病毒上清，于一 80°C冻存。利用有限稀释法测定包装后的LV-NS3病毒滴度，为2X IO6 TU/ml
实施例3慢病毒转导293A细胞与Huh7.5.1细胞
培养293A和Huh7.5.1细胞，传代状态良好的293A和Huh7.5.1细胞到T25cm2培养瓶中，IX IO6个/瓶。12小时后密度约为50%，用DMEM培养基两倍稀释LV-NS3病毒后分别感染两种细胞，24小时后补加适量培养基促进细胞生长，约60小时后观察感染病毒后293A和Huh7.5.1细胞的绿色荧光标签蛋白(ZsGreen)的表达情况并传代(图5)。
[0025]实施例4目的蛋白表达的检测与鉴定
1、免疫荧光测定目的蛋白的位置与活性
连续培养3代后，分别将生长状态良好，感染了 LV-NS3病毒的293A和Huh7.5.1稀释至I X IO5个/ml，加入96孔板，100 μ I/孔，使其贴壁。各设置两个复孔，设置阴性对照。60h后，弃原培养基。每孔加入100μΙ预冷的100%甲醇，于-20°C固定20min。弃甲醇，每孔加入 100 μ I IF Buffer (PBS, 1%BSA, 2.5Mm EDTA)，室温孵育 I h。一抗为抗 NS3 单克隆抗体2E12 (由本实验室边奕鑫博士提供)按1:500稀释。弃IF Buffer，每孔加入100 μ 1，4°C孵育过夜。弃抗体，每孔加入100 μ I PBS，重复洗三遍。荧光素标记二抗Alexa Fluor594-conjugated goat ant1-mouse secondary IgG (H+L)(购自 Invitrogen)按 1: 1000 稀释。每孔加入100 μ 1，37°C孵育I h。弃抗体，每孔加入100 μ I PBS，弃PBS，重复洗三遍。在荧光显微镜下观察染色结果(图6)。
[0026]2> Western blot鉴定目的蛋白表达量
连续培养5代后，分别收集未感染病毒的293A细胞、Huh7.5.1细胞、感染了 LV-NS3的293A细胞、感染了 LV-NS3的Huh7.5.1细胞，感染了 JFHl的Huh7.5.1细胞各I瓶，去培养基，用 PBS 洗 3 次，加入 200ul 细胞裂解液和 50ul 5 X SDS-PAGE Sample Loading Buffer,100°C变性lOmin，进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭3h,分别加入抗NS3单克隆抗体2E12和内参抗β-tubulin单克隆抗体(购自CellSignaling)，4°C孵育过夜。TBST洗膜3次，每IOmin一次，再分别加入羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗，室温孵育lh，TBST洗膜3次，每IOmin 一次。加入Western blot化学发光试剂后进行成像分析，结果如图7所示:以β-tubulin为内参，结果表明LV-NS3感染Huh7.5.1细胞后表达量比同样感染的293A细胞有明显提高；LV-NS3感染Huh7.5.1细胞后表达量与天然JFHl病毒感染Huh7.5.1相当。
【权利要求】
1.一种通过慢病毒表达系统高效表达的重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原。
2.根据权利要求1所述的重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原，其特征在于，所述的重组HCV NS3抗原包括SEQ ID N0.5所示的NS3蛋白；在NS3蛋白的N端引入分泌型信号肽SP，如SEQ ID N0.1所示；C端添加6His标签。
3.一种特异表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的慢病毒表达系统，其是通过在pHAGE-fulIEFla-MCS-1ZsGreen质粒的多克隆位点正向插入重组HCV NS3基因序列所得。
4.根据权利要求3所述的的特异表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的慢病毒表达系统，其特征在于，所述重组HCV NS3基因序列包括Nhe I酶切位点、Kozak序列、17个氨基酸的分泌信号肽SP基因序列、Ib型HCV非结构蛋白NS3全长cDNA序列、6His标签蛋白基因序列、终止序列和Xba I酶切位点。
5.根据权利要求3所述的特异表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的慢病毒表达系统，其特征在于，该慢病毒表达系统的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
6.由权利要求3~5任一项所述的慢病毒表达系统在细胞内包装成的重组慢病毒LV-NS3。
7.—种通过慢病毒表达系统表达重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原的方法，包括如下步骤: (1)将权利要求3~5任一项所述的慢病毒表达系统与两个辅助质粒PMD2.G和psPAX2共转染293T细胞，通过293T细胞包装成具有感染活性的携带有HCV NS3基因的重组慢病毒 LV-NS3 ； (2)将重组慢病毒LV-NS3感染Hun7.5.1细胞，特异性促进Huh7.5.1细胞大量表达HCVNS3抗原。
8.根据权利要求1或2所述的重组丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原、权利要求3~5任一项所述的慢病毒表达系统、权利要求6所述的重组慢病毒LV-NS3在制备丙型肝炎诊断试剂、预防或治疗丙型肝炎药物中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103951735SQ201410166080
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】赵烁贤, 黎诚耀, 李婷婷 申请人:南方医科大学