专利名称：子宫内膜癌的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的检测方法，尤其是子宫内膜癌的检测方法。本发明的方法适用于大规模筛分，例如在子宫内膜癌风险不断增加的妇女中进行筛分。
背景技术：
目前已经很清楚地知道在一些恶性肿瘤中，肿瘤的侵占性和肿瘤细胞蛋白酶表达之间具有很高的相关性。例如，最近七年中，已经积累了令人信服的证据表明，肿瘤侵染和转移过程与基质金属蛋白酶家族的成员直接相关。
临床医生长期以来一直认为需要研制一种客观标准用于癌症的早期检测，以及当治疗患有恶性肿瘤的病人时，用于评价预后因素。通常判断子宫内膜癌的阶段、侵入子宫肌层的深度、肿瘤的组织学级别和类型以及侵入淋巴管空间的程度对于疾病的侵占性具有某种程度的预测价值。然而，这些因素均不精确，它们均依赖主观判断。例如，通过组织学检查确定肿瘤的类型和级别时，曾报道这种评价在不同病理学家之间可能导致不同数值的几率高达85％(Baak和Oort，1991)。因此目前没有预测个体病人预后的方法。
越来越清楚地了解到子宫内膜癌进程的准确预测，和各种类型治疗后生存的可能性，也都依赖恶性肿瘤细胞的本质特征和它们与宿主的相互作用(Baak，1991)。因此该领域的主要研究目标就在于发现恶性肿瘤细胞的生物学特征，从而确定肿瘤的侵染和转移潜力。
从其它类型癌症的研究中可以知道，涉及肿瘤细胞生物学，例如DNA倍性(Iversen，1986；van der Putten等，1989；Berchuck等，1992；Podratz等，1993；Lukes等，1994)、介导细胞-细胞粘附的E-钙粘蛋白的表达(Sakuragi等，1994)、以及涉及细胞侵入的基质金属蛋白酶(MMP)的分泌(Liotta等，1986；Stetler-Sevenson等，1993)均能够通过提供涉及肿瘤细胞行为的可重现的客观测量方法，提高预后评价和生存预测的准确性。已经表明细胞中DNA含量(倍性)的改变与卵巢、乳房、结肠、肺、前列腺癌(Seckinger等，1989)的生物学行为，以及子宫恶性肿瘤的生物学行为有关(Moberger等，1985；van der Putten等，1989)。通常，具有正常二倍体DNA的癌细胞比具有异常、非整倍体或多倍体DNA的癌细胞的预后更好。因此，确定子宫内膜癌和其它癌症中DNA的倍性，成为评价与疾病再发生有关的预后和生存可能性的有力工具，而且也是比分子或基因标识更有效的预测方式(Lukes等，1994)。
目前已经了解到在一些恶性肿瘤中，肿瘤的侵占性和肿瘤组织中蛋白酶的表达之间具有很高的相关性。例如，最近七年中，不断积累的令人信服的证据表明肿瘤侵染和转移过程与基质金属蛋白酶(MMP)家族成员和组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)直接有关(Stetler-Stevenson等综述，1993)。曾有报道检测生物体液中的MMP，特别是检测MMP与TIMP的复合物，可以用于测定转移性癌(美国专利No 5324634，Zucker)这些酶在生理组织再造(月经)和侵入(胚培植)过程中也可以由正常细胞合成和分泌(Salamonsen，1995，1996)。MMP可以以完全活化型或者以酶活性得以表现之前需要激活的潜伏型存在于组织中。
最近我们已经证明在长尾猴卵巢周期和怀孕早期，MMP释放到子宫腔中(我们尚未公开的结果)。而且，曾报道在一些肿瘤细胞中发现这些酶过量表达，例如，结肠直肠和鳞状细胞癌中的这类酶。
最近，论证卵巢癌细胞，而非正常卵巢上皮细胞，超水平分泌类似于MMP-2和MMP-9的基质金属蛋白酶，该酶直接降解基底膜蛋白质(Moser等，1994；Salamonsen，1996)。这种蛋白质水解能力与子宫恶性肿瘤的侵入潜力有关。而且，应用单克隆抗体的免疫组织化学已经用于将MMP-2定位于各种瘤细胞(包括子宫内膜癌)的细胞质和原生质膜，同时TIMP-2主要定位于这些组织的基质(Hoyhtya等，1994)。除此之外，关于MMP和TIMP在子宫内膜癌中的表达知道的很少。这类信息对于研究控制子宫内膜癌和其它类型恶性肿瘤的生物学行为的方法是至关重要的。
现在我们出乎意料地发现，从子宫内膜癌患者的子宫洗液中可以检测到基质金属蛋白酶，但对照妇女的子宫洗液没有检测到。这一发现可能实现以最小的侵入进行灵敏的诊断试验，以及可以用于筛分风险人群或普通人群的筛查试验，或者用于推测治疗(putative treatment)的临床试验。该试验也适用于监测治疗效能和检测癌的复发。
发明概述本发明一方面提供一种分析子宫内膜癌存在和/或风险的方法，包括以下步骤从子宫内膜癌的高风险受试者或怀疑患子宫内膜癌的受试者体内获取子宫洗液样品；测定洗液中基质金属蛋白酶(MMP)的水平。
为了本说明书的目的，“子宫内膜癌的检测”这种表示方法应当广义地理解，它包括对癌症可能存在还是不存在的检测，或者对癌前期状态下的细胞或癌症发展早期时的细胞的检测。因此本发明不仅包括活化子宫内膜癌的检测，还包括发展成为该活化癌的风险的检测。
可以使用任何合适的溶液输入子宫腔，然后回收和收集该溶液，得到子宫洗液，用于检测。上述合适的溶液对本领域技术人员是显而易见的，包括任何不干扰MMP检测的无菌无毒溶液。合适溶液的一个例子是无菌盐水。输送和回收洗液可以使用任何方法，作为例子常规使用注射器和导管。洗液可以以回收的方式收集，或者转移到另一个容器中。输送、回收和收集的方法通常选择对病人和临床医生都能提供舒适和方便的方法。
本发明的方法中可以使用任何合适的方法测定洗液中的MMP水平。例如，合适的方法包括基于测定酶活性的方法、和/或基于测定酶的存在或存在水平的方法。可以测定总MMP，包括潜伏的、活化的、和TIMP-结合的MMP。本领域技术人员将很容易就能够确定一种方法是否合适，如果必要可以使用阳性和阴性对照样品。例如，明胶酶谱分析法适用于检测MMP-2和MMP-9的所有形式。任选地，酶谱分析法可以与光密度分析法联合，以便提供各种酶类型和形式(即潜伏或活化)酶的半-定量评价方法。也可以用基于底物的活性分析法分析活化酶。
可以测量子宫洗液存在的总明胶分解活性；虽然这种方法不能分辩存在的MMP的不同类型，但它的确提供了一种快速评价总MMP活性的方法。然而，优选测定MMP-2和/或MMP-9的活性水平。
或者，可以用例如ELISA、荧光分析法、化学发光分析法、或放射免疫分析法测定总酶水平。特别优选ELISA或化学发光分析法，因为它们快速、灵敏、专属性强，并且在用于大规模分析时容易自动化。这些方法也可以进行定量测定。Barrett(1995)详细描述了很多测定这类酶的适当方法。
任选地，也可以测定洗液中的组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的水平，例如通过反相酶谱分析法或ELISA。
在本发明的另外一个实施方案中，在获取子宫洗液的同时，还收集了子宫内膜表层细胞样品，例如，将一个子宫刷插入子宫腔，子宫内膜细胞用于细胞学检查，确定倍性和细胞核形态测量，上述确定的MMP水平与DNA倍性相关，当存在子宫内膜癌时，将它作为子宫内膜癌预后的一个指标。
可以使用标准图象细胞记数法和自动设备确定倍性和细胞核形态。
第二方面，本发明提供了一种评价子宫内膜癌预后的方法，包括以下步骤对接受子宫内膜癌手术的病人进行手术前，获取子宫洗液测定其中的MMP活性；获取所述病人的子宫内膜细胞样品；获取肿瘤细胞样品和临近的正常子宫内膜样品，进行组织学检查；关联MMP活性、DNA倍性和肿瘤级别和类型，作为预后的指标。
如果因为某种原因，不能手术切除子宫，子宫内膜癌的初步治疗方法可以使用放疗、化疗、子宫内膜部分切除(例如，使用光动态疗法、或刮除术，而不是子宫切除术)的保守疗法；某些情况下，刮除术与其它方法联合使用。对接受上述保守治疗的病人进行癌症复发的追踪和检测特别重要。
第三方面，本发明提供了一种监测子宫内膜癌治疗效能的方法，包括以下步骤从接受这种治疗的病人体内获取子宫洗液样品；测定洗液中的MMP水平。这种方法也适用于监测推测治疗的效能。
第四方面，本发明提供了一种对接受保守治疗的原发子宫内膜癌患者检测其子宫内膜癌复发的方法。包括以下步骤从上述患者体内获取子宫洗液样品；测定洗液中的MMP水平。
优选使用上述定量光密度酶谱分析法或ELISA测定MMP-2和MMP-9的活性。
本发明的方法适用于筛分无症状或健康妇女，或者风险人群，例如糖尿病妇女或接受绝经期后激素替代治疗的妇女。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，用于分析子宫内膜癌的存在和/或风险，含有(a)一种冲洗子宫腔的合适溶液，和(b)输送、回收和收集子宫洗液的装置，优选的试剂盒还包括(c)测定所述洗液中MMP水平的试剂，试剂盒还可以进一步任选包括一种或多种(d)获取子宫内膜上皮细胞样品的装置，
(e)一个或多个显微镜载玻片，(f)装有组织固定剂的容器。
在一个优选实施方案中，试剂盒含有(a)冲洗子宫腔的无菌生理可接受溶液，(b)无菌注射器，(c)无菌输液管或导液管，(d)装子宫洗液的容器，和任选地(e)子宫刷，和/或(f)一个或多个显微镜载玻片。
另外，试剂盒还优选含有一个装有组织固定液的容器；更优选固定液是4％的多聚甲醛。
为了本说明书的目的，应当清楚地理解“包含”这个词意味着“包括但不限于”，并应理解“含有”也具有相应的意思。
附图简述
图1表示子宫内膜癌患者的子宫洗液样品进行连续稀释后的酶谱结果。
图2比较了子宫内膜癌患者的一系列子宫洗液样品得到的结果，其中在特异性MMP活性抑制剂缺乏(凝胶的左半边)或存在(凝胶的右半边)情况下进行酶谱分析。
图3比较了子宫内膜癌患者的子宫洗液样品(图3a)和对照受试者样品(图3b)得到的酶谱结果。对照样品以四倍于癌症患者样品的浓度装载。
图4比较了子宫内膜癌患者子宫洗液样品(第3道)和各种对照受试者样品的酶谱结果。第5道和第7道，第6道和第8道分别来自同样的受试者；然而第7道和第8道的样品浓度是第5道和第6道样品浓度的四倍。
图5和图6各自表示来自子宫内膜癌患者的一系列不同样品，以同样的浓度跑凝胶，以便在各样品间进行直接比较。
图7表示MMP-9的ELISA分析结果，所示为微滴培养板各孔的光密度。
图8显示了代表微滴培养板中颜色反应的灰度。
发明详述患者下面将以仅参考下列非限制性实施例和附图的方式详细描述本发明。
研究组包括几乎所有在皇家妇女医院接受外科治疗的子宫内膜癌患者(表1)。
对照组包括因为其它疾病接受外科治疗或诊断的妇女，并且她们同意接受子宫冲洗。
为了更迅速地积累研究人群的数目，在Mercy医院接受子宫癌治疗的患者也包括在内。
第一组研究人群包括正在接受子宫出血调查的绝经期后期和绝经期前后的妇女。对这些患者进行诊断性子宫镜检以及进行子宫扩张术和刮除术之前，先进行子宫腔的真空冲洗。
第二组研究人群包括正在接受子宫内膜癌手术治疗的妇女。该组中，开始手术的时候首先冲洗子宫腔。
第三组人群包括无症状妇女，她们于上述研究组在同样的年龄范围内，她们作为对照将接受子宫冲洗和子宫内膜上皮的细胞学检查。
对所有癌症患者收集下列样品用于进行下文描述的研究(1)子宫洗液的无细胞上清液，用于通过酶谱分析其中的分泌酶(MMP)和其抑制物(TIMP)。目前为止已经利用明胶酶谱(表1)、ELISA、和免疫印记对MMP-2和MMP-9进行了检查。我们用酪蛋白酶谱进行的MMP-1和MMP-3的测定表明这些酶不分泌到子宫中，或者分泌水平非常低。
(2)用于测定DNA倍性的子宫内膜细胞每个病人的这种细胞得自于子宫洗液的细胞沉淀；子宫刷获取到的子宫内膜上皮细胞；和恶性肿瘤或显微镜载玻片的接触印痕。每种方式制得的细胞都用于倍性分析，应用上述三种方式得出一致的结果。倍性测定已有报道，其中提供了评价癌症患者预后的客观和可重现的参数。
(3)肿瘤块和附近正常子宫内膜在Carnoy固定液和多聚甲醛中固定。利用免疫组织化学法研究这些组织的组织切片是否存在MMP，利用原位杂交研究这些酶(MMP)和其抑制物的基因转录。也对部分病人的肿瘤和附近正常组织的样品进行冷冻，用于后续深入研究，例如，对组织中的MMP进行直接分析。
子宫液和子宫细胞的收集装有5ml盐水的注射器与输液管连接。输液管通过子宫颈插入子宫，冲洗子宫腔，收集回注射器的液体转移到一支试验管中。另将一个子宫刷插入子宫腔，收集子宫内膜表层细胞用于细胞学分析。
子宫液以3000rpm离心10分钟。收集上清液部分，并于-80℃贮藏用于后续MMP/TIMP分析。子宫内膜细胞沉淀和使用子宫刷得到的子宫内膜细胞样品在2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(AAS)涂布的载玻片上制片。在4％多聚甲醛中固定这些细胞载玻片，然后用Feulgen染色，利用成像细胞记数法评价DNA倍性。
子宫内容物的处理对于癌症和对照研究组，立即以3000rpm离心子宫洗液10分钟，以沉淀细胞，然后冷冻上清液用于后续MMP和TIMP研究。用下述的成像细胞记数法测定两组细胞沉淀的DNA倍性。对接受子宫内膜癌手术切除的患者，制备下列样品。在打开切除的子宫后，至少接触肿瘤表面两次获取样品，用与细胞沉淀同样的方法进行DNA倍性测定。另外，在处理剩余的子宫进行组织病理学检查之前，首先切下恶性肿瘤组织样品，特别是侵入区的恶性肿瘤组织样品，以及与正常子宫内膜组织相邻的肿瘤组织样品，用于免疫组织化学和原位杂交研究。后者包括侵入子宫肌层深度的评价，以及肿瘤级别和类型的评价。另外还确定有否淋巴结和附件转移。
DNA倍性研究将从子宫洗液中得到的脱落的上皮细胞沉淀分散、用培养基清洗、重悬浮，然后用60μm的尼龙网滤器过滤。通过细胞旋转离心分离作用将细胞悬浮液固定到聚赖氨酸涂布的载玻片上。一种装备了计算机的光学成像分析系统用于对这些制片和子宫肿瘤的接触印痕片进行定量Feulgen DNA染色。该设备用已知DNA量的细胞(鼠肝细胞)校准，该已知DNA量的细胞与试验样品一起分别在载玻片的一端染色。选择分析200-300个细胞。分别扫描每一个细胞核，制备每个细胞中DNA含量的直方图，在这些直方图的基础上，根据主峰和次级峰的定位，确定DNA倍性(二倍体DNA的指数1.0±0.1)。
子宫洗液中MMP和TIMP的分析通过明胶酶谱(MMP-2、MMP-9)或酪蛋白酶谱(MMP-1、MMP-3、MMP-7)分析子宫洗液中的酶活性。样品在含明胶或酪蛋白(各1mg/ml)的10％丙烯酰胺凝胶上，在非还原条件下，进行SDS-PAGE。凝胶在含50mmol/LTris-HCl，5mmol/L CaCl2，NaN3，0.02％(w/v；pH7.5)和1％Triton X-100的缓冲液中冲洗后，在无Triton的同样缓冲液中37℃保温2-24小时，然后用考马斯亮蓝染色。明胶酶或酪蛋白酶的活性通过凝胶的阴性染色显示出来。潜伏MMP和活化MMP都可以通过这种方法检测出来，因为SDS可以激活潜伏MMP。保温期间(5mmol/L EDTA和2.5mmol/L对-菲咯啉)，可以将MMP抑制物加入适当的地方。定量检测时，为了补偿个体间子宫洗液中蛋白质含量的较大差异，装载的体积应当与子宫洗液的总体积相关，由此可以评价每个个体子宫内腔中MMP的相对浓度。利用适应凝胶描记要求的HP桌面扫描仪，应用Deskscan软件和NIH成像程序1.54版，对上述凝胶进行光密度分析，所述分析是通过测量目标酶或者个体样品由泳道图谱描记出来的峰下面积进行的。在一块凝胶上或一套凝胶上平行进样和电泳，进行定量比较研究。每块凝胶至少含有两种稀释度的标准品，每套凝胶含四种稀释度的上述标准品。目标酶活性非常高的泳道，进一步稀释样品重新电泳。作为定量技术的酶谱的应用已有报道(Kleiner和Stetler-Stevenson，1994，其中列出了参考文献)。该技术非常灵敏，检测限比例如ELISA(检测限为每种样品ng范围)等方法低很多，对于MMP-2和MMP-9其检测限均为每种样品2pg的数量级(1nM)。
明胶酶活性分析该分析涉及样品与14C-标记的胶原底物共同保温。底物从荷兰猪的皮肤中获取出来，然后透析、用14C标记，使用之前，60℃加热20分钟变性，从而转化成为可以被MMP-2和MMP-9消化的14C-明胶的形式。
通过底物与100μg/ml的胰蛋白酶共同保温，测定总明胶分解活性。样品或者不经处理，或者预先与氨基苯酚乙酸汞保温，以便激活潜伏的MMP。分析样品在37℃保温4-24小时，加入30％三氯乙酸/1％鞣酸停止反应。所有未消化的底物形成沉淀。通过对消化的并释放到上清液中的标记底物的量进行记数测定所有的酶活性。通过这种分析系统，计算各样品的特异性活性成为可能；一单位的活性定义为在37℃每分钟能够降解1μg底物的酶量。该分析方法不仅对定义样品中已经激活的酶活性有用，而且对定义潜伏酶激活后具有的潜在活性有用；在生理学领域，它代表样品中的酶降解胞外基质成分的速率。该分析方法仅测量总明胶酶活性；它不能分辩明胶酶例如MMP-2和MMP-9活性之间的差异。特异性MMP可以由酶谱分辩出来。
免疫组织化学和原位杂交分析MMP和TIMP的专属试剂和方法已有文献描述(例如，Rawdanowicz等，1994；Jeziorska等，1996；Salamonsen和Woolley，1996)。目前，抗血清已有商业提供(例如Biogenesis Ltd，U.K.，Triple Point Biologics，Oregon U.S.A.，The Binding Site，U.K.)，纯化酶和TIMP也有提供(Calbiochem，Cambridge MA，U.S.A.)。已经克隆了所有相关基因，公开了其序列，并是公众可得到的。
利用上述抗血清和碱式磷酸酶/抗-碱式磷酸酶(APAAP)检测系统(Serotec)(Salamonsen等，1991；Salamonsen等，1993；Rawdanowicz等，1994)对Carnoy’s固定的或多聚甲醛、蜡包封的组织进行免疫组织化学分析。多聚甲醛固定通常更为常规，能够使小样品得出较好的结果。原位杂交使用异羟洋地黄毒苷-标记的DNA或RNA探针。
实施例1 MMP释放到接受子宫内膜癌研究的患者的子宫腔中对从52位子宫内膜癌患者和40位接受子宫出血或其它妇科疾病诊断程序的对照病人中得到的样品，用酶谱检查其中的MMP-2和MMP-9，并用图象细胞记数检查子宫内膜表层细胞的DNA倍性。对于发现患有子宫内膜癌的患者，评价其恶性肿瘤的级别。MMP-2和MMP-9进一步分为下列假设的分析类型潜伏MMP-2、活化MMP-2、二聚体MMP-9、糖基化前MMP-9和活化MMP-9。潜伏和活化MMP-2和MMP-9的鉴别按照后面实施例的描述，随后确定。
结果在表1和表2中概述。另外，用酪蛋白酶谱对MMP-1、MMP-3和MMP-7进行了测定，但无论是对照中还是子宫内膜癌患者的子宫洗液都没有发现可以检测到的水平。
表1概述了从各种级别的子宫内膜癌患者得出的酶谱结果，与改组其它临床和病理指标的关系。明胶酶酶谱分为两种分子形式的MMP-2和三种分子形式的MMP-9。到目前为止，在子宫内膜癌患者的子宫洗液中发现可检测到的最弱的明胶裂解活性是代号为J.O.的患者体内的一种形式的MMP-2(赋予+)和两种形式的MMP-9(均赋予+)。如果三个加号的总数，即所有MMP部分水平总和的积分，作为诊断子宫内膜癌阳性所需要的最低水平，表2所列出的对照中，没有一个可以诊断为假阳性。到目前为止，子宫内膜癌组也没有遇到假阴性结果(缺乏所有的MMP活性)。对于个体癌症患者的子宫洗液，观察到明胶裂解活性水平在3-22个加号之间。
表1子宫内膜癌患者各参数比较的最新结果摘要MMP表现型*患者 年 级 DNA倍 恶性级别 淋巴结涉 血管侵子宫肌层 潜伏活化 推测的二聚 前 活化姓名 龄 别 性状况 入状况 入状况侵入深度 MMP-2 MMP-2体MMP-9 MMP-9 MMP-9B.F. 58 1 多倍体0.93 无 无＞1/3(通常2mm) ++ ++ +++ ++++++++M.R. 50 1 二倍体0.34 无 有表层(5/27) +++ +++++ ++++++++S.H. 57 1 二倍体0.03 无 有＜1/3+ -++++ +B.M. 59 1 二倍体0.26 无 无表层(1/10) ++ +++++ +++++ +++W.B. 72 1 多倍体1.39 无 无距浆膜2.8mm +++++ +++ ++++ +++++ +++V.Q. 58 1 二倍体0.17 无 有表层 +++++++ +++ +++++A.K. 58 1 二倍体0.48 无 有7/8 +++ ++ ++++++C.H. 54 1 二倍体0.16 无 无4/13(内侧第三层) ++ +++++ +++++++J.E 62 1 二倍体0.29 无 无5/15 + +++ +++ +A.K. 65 1 二倍体0.13 无 无内侧一半 +++ ++++ +++++ ++++C.M. 67 1 二倍体0.34 无 有2/3 +++++ +++ ++++++++++ +++J.Q. 57 1 二倍体0.21 有 有8/22 ++++-++ +++++N.K. 73 1 二倍体0.05 无 无1/32 ++ -+++ -Z.K. 53 1 二倍体0.07 无 无1/11 ++ +++ +S.S. 49 1 二倍体0.09 有 无5/32 +++ ++++ -D.R. 67 1 多倍体0.53无无表层(2/3) + ++ +++++ ++M.T. 73 1 多倍体3.00无无表层 + + - ++ -G.M. 67 1 二倍体0.16无无距邻近的子宫肌+ ++++ ++ -层1mmT.O’ 84 1 多倍体0.48无有12/15 +++ - + +++++TR.F. 64 1 二倍体0.02- 无7/26 ++ + +++++ +++++ +++L.H. 62 1 - - - 无0 ++++++++ ++++ ++++++++++C.T. 73 1 二倍体0.08- 无4/18 -- + ++ +L.C. 53 2 多倍体1.72无无＜内侧第三层 +++ - ++ +++++J.O. 55 2 多倍体0.54无无0 +- + + -V.D. 60 2 二倍体0.16无无5/13 ++ - ++ +++ ++D.S. 55 2 二倍体0.13无有表层 ++ - ++++++ +P.T. 65 2 多倍体0.58有有距浆膜2.8mm +++ + ++++ +++++ +A.B. 60 2 二倍体0.17无有全部厚度 ++ + ++ +++ +J.B. 72 2 多倍体1.55有无＞2/3 ++++ ++++++++++ ++B.R. 55 2 二倍体0.05无无＜1/3 +++ ++++ +++++ ++++D.W. 63 - 多倍体1.57无无2/13 +++ ++++ +++ +I.F. 68 2 多倍体0.77无无11/27++ +++- ++ -D.M. 54 2 多倍体2.31- 有8/24 ++ ++++ ++++E.H. 75 2 - - 有无浆膜内5mm+++++ +++++ +++++ +++C.C. 51 2 二倍体0.72无无9/19 ++ ++ - + -M.S. 73 2 多倍体＞3 无无5/13 + ++++ + ++++ -D.S. 63 2 - - 无 无 1/21 +++- +++ + +D.K. 57 2 多倍体＞3 有有＞内层2/3++ + +++++++++ +++E.L. 61 2 二倍体0.03有有12/21++ - +++++ +++++ +++L.R. 62刮除时为2级 ++ - +++ ++++ +C.G. 63 2 二倍体0.28有有17/16++++ ++++++++++++ +++C.S. 60 2 多倍体2.07- 有表层(2/11) ++ - ++ ++ ++++K.K. 64刮除时为3级 - ++ - + -C.S. 68 3 二倍体0.03无无＞内层1/3(最小) - ++ - + -R.B. 76 3 多倍体2.44无无2/12 + +++- ++ -L.D 63 3 二倍体0.36无有10/17++ - - +++++T.B. 94 子宫刮片显示原位鳞状细胞瘤，偶尔有碎片显示侵入性鳞状细胞 ++ ++ + ++ -瘤.考虑到患者的年龄和整体健康没有进行TAH.O.L. 79 - 多倍体0.4 多倍体横纹肌肉瘤++ - - ++++A.J. 58 3 多倍体＞3 无无表层(4/17) ++++ +++ +++++ +L.S. 79 3 二倍体0.53无无内层一半+++ +++++++++++ ++++I.F. 54 3 二倍体0.25无有内层一半+ -+++ +H.M. 68 3 二倍体0.35- 有0/15+++++ +-+++ -*所有子宫洗液样品均稀释1∶40；酶谱结果基于与酶带的大小和密度有关的打分系统无(-)，非常低(+)，低(++)，中等(+++)，高(++++)，非常高(+++++)。
#恶性肿瘤级别代表0.01-3.0范围内的一个分值。涉及低恶性级别(在0.01-1.0之间)的肿瘤与高存活率有关，恶性级别在1.1-1.9之间的肿瘤具有中等存活率，而高恶性级别(2.0-3.0之间)的肿瘤具有较短的平均存活时间。Bocking A等，DNA-细胞光密度诊断和恶性肿瘤分级的计算规则。定量分析细胞学(Anal.Quant.Cytol.)，6(1)1-8，1984。
表2概述从对照患者(无临床可检测的子宫内膜癌)得到酶谱结果，以及该组的其它临床和病理学参数。明胶酶谱显示5个患者存在非常低水平的潜伏MMP-2，一个患者存在非常低水平的120kDa明胶酶(推测是MMP-9)。迄今为止在稀释用于酶谱分析的子宫洗液中没有检测到其它形式的MMP。大多数对照病人的子宫洗液中缺乏可检测到的明胶分解活性，或者单分子形式的MMP活性非常低，打分最大值为一个加号，表明当子宫洗液中检测到几种MMP部分时，可以特异和灵敏地诊断为子宫内膜癌。
表2对照组中各参数比较的最新结果摘要患者姓名 年龄 DNA倍 临床记录 MMP表现*性状况 潜伏活性推测的二聚体 前- 活性-MMP-2 MMP-2 MMP-9 MMP-9 MMP-9F.O. 46- 子宫内膜异位症；无残留的发育异常- - - - -D.R. 37二倍体 糊状斑块表明发育不良- - - - -S.S. 52- 异常椎形糊状斑块；仅退化性改变 - - - - -N.A. 54- ^CINII，由激光手术切除 - - - - -J.F. 50二倍体 固形卵巢块；一次偶发绝经后出血 + - - - -V.S. 60倍体- 绝经后出血；未诊断出癌症- - - - -D A. 39- 原位子宫颈瘤；无发育异常或恶性症状 - - - - -E.P 45二倍体 起初诊断子宫内膜癌进行刮除术，但复查后为阴性- - - - -C.N. 32- ^CINIII，由激光手术切除 - - - - -N.T. 52- ^CINII，由激光手术切除 - - - - -F.S. 35二倍体 ^CINIII，之后活检，未观察到^CIN - - - - -J.I. 22- 右侧卵巢囊肿- - + - -A.H. 24- 实施扩张术和刮除术；使用微丸+ - - - -D.E. 59- ^CINIII，之后活检，未观察到^CIN - - - - -J.F. 24实施扩张术和刮除术 - - - - -K.F.26二倍体实施扩张术和刮除术- - - - -A.V.36二倍体^CINIII斑块；活检时未观察到发育异常 - - - - -M.D.43二倍体^CINI斑块；椎状、扩张、切除术 - - - - -D.W.25- 扩张和切除，子宫镜检 - - - - -M.B.48- NIDDM；月经过多；扩张和切除术，子宫镜检 + - - - -S.D. - 月经周期不规律；诊断为II型糖尿病(NIDDM) - - - - -J.F.34- ^CINIII斑块；椎状活检 - - - - -J.O.26- 原位子宫颈瘤；椎状活检- - - - -L.M.32- ^CINI；发育不良程度较低；停止避孕 - - - - -J.K.23- 扩张和切除术；子宫切开，肾盂检查 - - - - -A.O.48- ^CINIII和月经周期不规律；椎状活检 - - - - -C.A.47- 原位子宫颈腺癌；椎状活检 - - - - -A.K.70- 服用他莫昔芬；绝经后出血；子宫内膜增厚；复杂的盆腔- - - - -肿块；实施全腹子宫切除(TAH)……良性、萎缩性、固着的息肉。C.Di. 71- 绝经后出血；涂片正常；因子宫内膜息肉实施TAH - - - - -G.L.62- 绝经后出血；刮除术表明部分再生，无非典型表现 + - - - -G.M.67- 子宫内膜显示与他莫昔芬处理一致的特征 - - - - -N.L.54- 刮除术表明无异常组织；椎状活检表明高级别的异常状况+ - - - -
具有单一病灶P.A. 48 - 椎状活检，原位癌 -----D.R. 61 - 子宫内膜息肉，使用他莫昔芬-----S N. 31 - 刮除术表明无增生或恶性的迹象 -----L.R. 61 - 使用他莫昔芬；良性子宫内膜息肉-----L.G. 46 - 实施扩张术和刮除术，子宫切开 -----N.K. 47 - 起初复合型增生；刮除后增生性子宫内膜；无增生或-----发育异常B.M.- 椎状活检 -----A.I. 73 二倍体 绝经后出血，子宫镜检表明复合型增生；TAH后的病理 -----诊断发现良性子宫内膜息肉*所有子宫冲洗样品以1∶40的比例稀释；酶谱结果基于涉及酶带的大小和密度的打分系统无(-)，非常低(+)，低(++)，中等(+++)，高(++++)，非常高(+++++)。^原位癌(CIN)
实施例2 MMP-9和MMP-2的ELISA分析BiotrakTMMMP-9 ELISA试剂盒(CalbiochemR)，能够提供对子宫洗液样品中MMP-9的简单且专属的检测。该分析法的灵敏度为0.6ng/ml。该分析法使用定向抗MMP-9不同表位的两种抗体。样品或标准品中存在的所有MMP-9均结合到预先用抗-MMP-9涂层的微滴培养板上。对后进行第二个保温步骤，其中加入与辣根过氧化物酶结合检测抗体，形成固定化复合物。向各孔中加入四甲基对二氨基联苯底物，进行颜色反应检测每孔中的过氧化物酶复合物的量。产物的蓝颜色用微滴培养板分光光度计(Beckman)在630nm处测定。用630nm的平均光密度对标准品ng/ml作图，制备标准曲线。从中通过曲线外推确定各样品的浓度(ng/ml)。一个微滴培养板(96孔)允许构建一个标准曲线和测量40个未知样品一式二份。ELISA方案能够在一天内得到结果。
制备10个癌症和10个对照患者的不稀释样品和以1∶4的比例稀释的样品，然后分析MMP-9的存在或缺乏。图7表示原始数据，其中显示了微滴培养板各孔的光密度。图8表示微滴培养板中产物颜色反应的灰度；按顺序，它是子宫洗液样品中MMP-9存在量的最初表示。所有癌症样品都有一个明显高于对照的光密度值，以至癌症样品的测量值超出了标准曲线。作为这项工作的延续，将大量样品连续稀释，用ELISA试验分析。这种滴定方法确立了检测子宫癌时MMP-9的定值或基本水平(ng/ml)。
用BiotrakTMMMP-2 ELISA试剂盒也可以该方法测定MMP-2，所述试剂盒同样购买自CalbiochemR。
实施例3 细胞生物学研究已确诊子宫癌的患者，子宫切除作为部分治疗方法。切除子宫后，如果可能，从以下两个位置切除子宫内膜组织(a)相应于恶性损伤的位置，(b)显微镜检查时，子宫内膜看起来是正常的位置。
肿瘤组织和正常组织均在含0.15M NaCl、10mM CaCl2、和0.05％Brij35的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，于冰面上匀浆。离心得到上清液，通过染料结合法，用BilRad蛋白质分析试剂测定蛋白质的浓度。
用明胶酶谱检查组织匀浆中MMP的表型。上清液，经校准使每道蛋白质的量相同，如上述将明胶注入凝胶，进行SDS-PAGE。
酶谱表明所有组织样品都有MMP-9和MMP-2的释放。然而，显然正常子宫内膜区的组织样品比同一患者肿瘤组织样品释放明显较低水平的MMP。因此，肿瘤组织中出现上调，尤其的MMP-9的水平上调。
这些研究表明前面部分描述的本发明的方法检测的MMP-9和MMP-2水平的升高，主要源于子宫中存在的癌组织的分泌，而不是源于非-人组织的分泌。
实施例4 子宫内膜癌细胞的培养如上述子宫切除后，将来源于肿瘤位点的子宫内膜组织从子宫上切下来。将该组织样品剪成小块，然后在含10％FCS的α-最小基本培养基(MEM)中冲洗。然后将肿瘤组织碎片置于不含FCS的胶原酶/MEM溶液中在37℃保温40分钟。无关细胞在MEM+10％FCS中冲洗掉，然后接种于7cm2培养皿上。
生长旺盛的细胞在3-4天内铺满平皿，看起来包含形态均一的细胞群体。相比较而言，来源于子宫内膜正常区域的上皮细胞在同样的时间内不能形成足够的单层细胞。当肿瘤细胞铺满后，培养基更换为无血清MEM。细胞在无血清条件下培养24小时，然后收集培养基用酶谱确定分泌的MMP的状况。
在凝胶上均可以鉴定前-MMP-2和前-MMP-9。该研究表明培养的癌症细胞分泌与子宫腔内的癌症细胞类似的酶谱。
实施例5 免疫印记子宫洗液样品用10％凝胶进行SDS-PAGE。样品在还原条件下电泳，然后将它们转移到二氟化聚乙二烯薄膜上。该薄膜在固定缓冲液中冲洗，然后用单克隆MMP-2抗体(IM33L，CalbiochemR)作为探针测定。随后在TBS(pH7.4)中清洗3次，每次10分钟，将薄膜与辣根过氧化物酶结合的检测抗体一起保温。然后进行化学发光反应，以便检测固定化的MMP-2抗原。该反应中，辣根过氧化物酶催化光的发散，其来源于发光试剂的氧化。常使用增强剂增强光的发散。依赖于薄膜上抗原量的发散的光，捕获到自动射线照像胶片上，得到永久记录的结果。MMP-9以同样的方式用特异性单克隆MMP-9抗体(IM37L，CaliochemR)检测。
该技术清楚地定义为子宫内膜癌患者子宫洗液中检测到的酶的鉴定。免疫印记显示酶谱检测到的两种主要酶是MMP-2和MMP-9。也对其余的带进行了检测，但还没有鉴定这些明胶酶的分子特征。暂时认为它们是MMP-2和MMP-9的替换形式(例如，表1所示的MMP-2和MMP-9的推测形式)。
实施例6 子宫超声和子宫流体MMP分析检测子宫内膜癌这个预期试验的目的在于通过阴道超声扫描术评价子宫流体MMP分析的灵敏度和特异性，该分析用于检测因异常子宫出血接受检查的妇女是否患有子宫内膜癌。因为该检查涉及输入生理盐水的子宫超声扫描术，我们实验室对同意接受该实验的患者获取起始子宫洗液样品用于分析MMP。接受检查的人群包括年龄在45-65岁，绝经过程中和绝经后的妇女。该研究期望发现具有患子宫内膜癌高风险女性人群比相应年龄的无症状妇女，子宫MMP水平升高的发生率。据估计高风险人群子宫内膜癌的发生率在2-10％之间。
表3概述通过明胶酶谱研究105个患者的子宫洗液得到的结果，8个患者(7.6％)MMP水平升高。在阳性MMP实验的8个患者中，子宫内膜组织的组织病理学检查发现其中5个患有子宫癌。其它3个患者经组织学实验没有检测到异常症状。然而，由于子宫洗液中MMP水平的升高，应该保证对这类患者进行有规律的跟踪检查，特别是确定这种升高是否与子宫癌形成的风险增加有关。未得到假阴性结果。
表3通过盐水输入子宫超声扫描术因异常子宫出血检查的患者子宫液的MMP分析MMP酶谱的结果 组织学证明患有子宫内癌的患者有 无 总和升高的MMP 5 3 8基础MMP0 97 97总和 5 100105基于到目前为止的总体研究，可以断定1.实验的灵敏度为100％(5个检测到癌症的患者中5个MMP升高)。2.实验的特异性为97％(没有得癌症的100个患者中97个MMP水平为基础值)。
3.实验的预测价值为62.5％(MMP升高的共8个患者中5个患癌症)。
我们发现本研究中所有患子宫内膜癌的妇女的子宫分泌物含有明显升高的MMP-2和MMP-9水平，相比较而言对照组的子宫分泌物中无MMP-2和MMP-9或MMP-2和MMP-9水平非常低。癌症组和对照组之间酶水平的这种显著并且一致的差别强有力地说明，分析子宫分泌物中的MMP作为对所有级别的子宫内膜癌的灵敏和可靠的诊断实验是有用的。
因为子宫灌洗是相对简单和非侵入性的方法，因此利用明胶酶谱分析子宫洗液样品，或其它分析MMP的方法，例如ELISA，可以任选地与用于子宫颈疾病的糊状涂片结合，用作子宫内膜恶性肿瘤的常规筛分试验。初步统计学分析表明本发明试验的灵敏度为100％。与常规糊状涂片通常观察到的80％的灵敏度相比，它非常令人满意。ELISA或化学发光分析容易自动化，适于大规模筛分和临床病例应用。
另外，我们目前的结果有力地说明MMP-2和MMP-9涉及子宫内膜癌的生长，并且可能涉及肿瘤在子宫内扩散。它可以提供子宫癌的整体治疗过程中，特异性酶抑制剂与其它治疗性用药程式结合应用的原理。
各级别子宫内膜腺癌的患者数目太少，而不能得出任何关于MMP-2和MMP-9水平与组织学级别和侵入子宫肌层深度的关系的结论。然而，通常侵入最深的两个患者发现两个MMP的水平均最高。这些妇女也都发现有多倍体肿瘤细胞，评价的中度的恶性级别(表1)。这说明MMP-2和MMP-9水平对以前已知的预后指标提供了有用的补充。
为了清楚和易于理解的目的更详细地描述本发明时，可以对实施例和本文描述的方法进行各种不偏离本说明书公开的本发明定义范围的修饰和改变，这对本领域的技术人员是显而易见的。
下一页列出本文引证的参考文件，它们引入本文作为参考。参考文件Baak，J.P.A，癌症诊断和预后中的定量病理学手册，1991Barrett，A.J.，酶学方法，蛋白水解酶、天冬氨酸肽酶和金属肽酶，1995，248413-528Berchuck，A.等，妇科肿瘤学，1992，4461-65BockingA.等，定量分析细胞学，1984，61-8Iversen，O.E.，美国妇产科学杂志，1986，155770-776Jeziorska，M.，Salamonsen，L.A.和Woolley，D.E.，生殖和受精杂志，1996，10743-51Kleiner K.E.和Stetler-Stevenson，W.G.，生物化学分析，1994，2183235-3329Liotta，L.A.等，生物化学年度综述，1986，551037-1057Lukes，A.S.等，癌症，1994，732380-2385Moberger，B.等，细胞计量学，1985，5430-436Podratz，K.C.等，美国妇产科学杂志，1993，1681206-1215Rawdanowica，T.J.，Hampton，A.L.，Nagase，H.，Woolley，D.E.和Salamonsen，L.A.，临床内分泌代谢杂志，1994，79530-536Sakuragi，N.等，妇科肿瘤学，1994，53183-189Salamonsen，L.A.，内分泌学发展趋势，1996，728-34Salamonsen，L.A.，Nagase，H.和Woolley，D.E.，细胞学杂志，1991，100381-385Salamonsen，L.A.，Nagase，H.和Woolley，D.E.，生殖与受精杂志增刊，1995，4929-37Salamonsen，L.A.，Nagase，H.，Suzuki，R.和Woolley，D.E.，生殖与受精杂志，1993，98583-589Salamonsen，L.A.和woolley，D.E.，人类生殖，1996，11，增刊，2124-133Seckinger，D等，实验医学病理学文集(Arch.Pathol.Lab.Med.)，1989，113619-626Stetler-Stevenson，W.G.等，细胞生物学年度综述，1993，9541-573van der Puttten，H.W.H.M等，癌症，1989 631378-138权利要求
1.检测子宫内膜癌存在和/或风险的方法，包括以下步骤从子宫内膜癌高危受试者或怀疑患有子宫内膜癌的受试者体内获得子宫洗液样品，测量洗液中基质金属蛋白酶(MMP)的水平。
2.按照权利要求1的方法，其中对洗液中的总明胶分解酶进行测定。
3.按照权利要求1的方法，其中对MMP-2和/或MMP-9的活性水平进行测定。
4.按照权利要求1或3的方法，其中用酶谱，任选地与光密度测量法结合检测MMP活性。
5.按照权利要求1或2的方法，其中总酶水平通过ELISA、荧光分析法、化学发光分析法、或放射免疫分析法测定。
6.按照权利要求5的方法，其中MMP水平通过ELISA或化学发光分析法测定。
7.按照权利要求6的方法，其中MMP水平通过ELISA测定。
8.按照权利要求1-7任意之一的方法，其中还测定金属蛋白酶的组织抑制剂的水平。
9.按照权利要求1-8任意之一的方法，其中在获取子宫洗液同时收集子宫内膜表面细胞样品，子宫内膜细胞用于细胞学检查，以便确定倍性和核的形态测定，而MMP的水平与DNA倍性相关在存在子宫内膜癌时其作为子宫内膜癌预后的指标。
10.评价子宫内膜癌预后的方法，包括以下步骤测量接受子宫内膜癌手术的患者实施手术前得到的子宫洗液中的MMP活性；从所述患者体内获得子宫内膜细胞样品；获得子宫内膜肿瘤样品和附近正常的子宫内膜样品，用于组织学检查；联系MMP活性、DNA倍性和肿瘤的级别和类型，作为预后的指标。
11.检测因原发子宫内膜癌接受保守性治疗的患者子宫内膜癌复发的方法，包括以下步骤从患者体内获取子宫洗液样品；测定洗液中的MMP水平。
12.监测子宫内膜癌推测治疗效果的方法，包括以下步骤从患者体内获取子宫洗液样品；测定洗液中的MMP水平，由此检测是否子宫内膜癌已复发。
13.按照权利要求11或12的方法，其中对子宫洗液中总明胶水解活性进行测定。
14.按照权利要求11或12的方法，其中对MMP-2和/或MMP-9的活性水平进行测定。
15.按照权利要求11或12的方法，其中通过酶谱，任选地与光密度测量法结合检测MMP活性。
16.按照权利要求11或12的方法，其中用ELISA、荧光分析法、化学发光分析法、或放射免疫分析法测定酶水平。
17.按照权利要求16的方法，其中用ELISA或化学发光分析法测定MMP水平。
18.按照权利要求17的方法，其中用ELISA测定MMP水平。
19.按照权利要求14的方法，其中通过定量光密度计量酶谱或ELISA测定MMP-2和MMP-9的水平。
20.检测子宫内膜癌存在和/或风险的试剂盒，包括(a)冲洗子宫腔的合适溶液，(b)输送、回收和收集子宫洗液的装置。
21.按照权利要求20的试剂盒，进一步含有(c)测定所述洗液中MMP水平的试剂。
22.按照权利要求20或21的试剂盒，进一步含有一个或多个(d)获取子宫内膜上皮细胞样品的装置，(e)一个或多个显微镜载玻片，(f)装有组织固定液的容器。
23.按照权利要求20到22任意之一的试剂盒，包括(a)用于冲洗子宫腔的无菌生理可接受溶液，(b)无菌注射器，(c)无菌输液管或导液管，(d)用于装子宫洗液的容器，以及任选地(e)子宫刷，和/或(f)一个或多个显微镜载玻片。
24.按照权利要求23的试剂盒，另外还包括装有组织固定液的容器。
25.按照权利要求23或24的试剂盒，其中固定液是4％的多聚甲醛。
全文摘要
本发明涉及分析是否患子宫内膜癌和/或是否存在子宫内膜癌风险的方法,该方法通过测量子宫洗液中基质金属蛋白酶－2和/或基质金属蛋白酶－9的水平实现。本方法可以定性或定量,并适用于大规模筛分和临床病例。
文档编号C12Q1/37GK1257550SQ98805312
公开日2000年6月21日 申请日期1998年3月20日 优先权日1997年3月20日
发明者亚历山大·罗帕塔, 洛伊丝·A·萨拉蒙森, 迈克尔·A·奎因 申请人:默尔本大学, 普利斯·享利医学研究院