北美猪生殖和呼吸综合征(prrs)病毒及其用途的制作方法

专利名称：北美猪生殖和呼吸综合征(prrs)病毒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于动物卫生领域，涉及正的极性RNA病毒的感染性cDNA克隆和使用所述cDNA克隆构建疫苗，尤其是猪疫苗。
猪生殖和呼吸综合征(PRRS)是猪的一种新疾病，1987年首次报道于北美，1990年欧洲对此病也有报道。此病已流传至亚洲并影响到世界主要产猪国中的大多数。主要症状是大母猪和小母猪的生殖问题，包括晚期流产，死胎和干尸，弱小猪的小仔猪出生时即患病毒血症，经常不能存活。另外，在幼猪中，此综合征表现为水平传播的呼吸疾病，导致发烧、嗜睡、呼吸困难、食欲差、生长缓慢和偶发性死亡，经常与其它呼吸性病原体相关。通过自然或人工受精，能经过感染公猪的精液将此病传染给大母猪和小母猪。由于这样或那样的原因，已证实PRRS是难以控制的疾病，因此对养猪业来说是经济上危害最大的疾病之一。
PRRS的致病因子是PRRS病毒，该病毒以两个遗传学和血清学完全不同的类型存在(Murtaugh，M.P等，1995，Arch-Virol，140，1451-1460；Suarez，P等，1996，病毒研究42159-165)。据信，本世纪80年代，这两种类型最初是分开进入猪群体的，一个在北美，另一个在欧洲，其来源是未知的生物源，可能来源于啮齿类动物或禽类。1991年荷兰人分离得到以原型“Lelystad病毒”为代表的欧洲型并测定了该病毒的序列(Terpstra，C等，1991，Vet.Quart.13131-136；Wensvoort，G等，1991，Vet.Quart.13121-130；Wensvoort，G等，WO 92/213751992(PCT/NL92/00096)，1992；Meulenberg，J.J.M等，1993，病毒学，19262-72)。
在分类上，北美PRRS病毒和欧洲PRRS病毒都属于马动脉炎病毒科，该科中还包括马动脉炎病毒，乳酸脱氢酶增高病毒和猿猴出血热病毒。马动脉炎病毒属于Nidovirales目的病毒，该目中还包括冠状病毒和torovirus。Nidovirus是包膜病毒，其基因组由单链正极性RNA组成，正链RNA病毒的基因组RNA起双重作用，即遗传信息的存储和表达。Nidovirus的复制或转录不涉及DNA，因此，Nidovirus基因组RNA的增殖是基因组复制和mRNA转录联合的过程。另外，一些蛋白质直接由Nidovirus基因组RNA翻译而来。最近，Snijder和Meulenberg评述了马动脉炎病毒科的分子生物学(Snijder，E.J和Meulenberg，J.J.M.，1998，普通病毒学杂志79961-979)。
目前，市售的抗PRRS疫苗或者是常规的经修饰活病毒(减毒的细胞培养物)，或者是常规的灭活病毒(强毒病毒的无活性细胞培养物制品)。其中几个疫苗的安全性和/或效力受到批评。因此，很有必要基于对PRRS基因组进行特异性添加、缺失和其它修饰开发第二代PRRS疫苗。然而，由于PRRS病毒在其复制过程中不涉及任何DNA中间体，因此，制备这种疫苗迫切需要构建PRRS病毒的全长cDNA克隆，以通过分子生物学技术在DNA水平上进行操作。最近，已报道了欧洲PRRS病毒的全长感染性cDNA克隆(Meulenberg，J.J.M.，1998，文献同上；Meulenberg，J.J.M.，1988，病毒学杂志，72，380-387)。
上述文献以及本申请下文提及的所有其它参考文献都全文列入本文作为参考。
本发明提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本发明还提供了由上述分离的多核苷酸分子编码的分离的感染性RNA分子，和与其同源的分离的感染性RNA分子，所述分离的感染性RNA分子各编码北美PRRS病毒。
本发明还提供了载体(如质粒)形式的上述分离的多核苷酸分子，所述分子编码感染性RNA分子。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA的病毒载体，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的转染宿主细胞，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ IDNO1或其同源序列，该转染宿主细胞能表达所编码的北美PRRS病毒。
本发明还提供了制备基因修饰型北美PRRS病毒的方法，所述方法包括突变本发明编码感染性RNA分子的DNA序列，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，突变之后由该DNA序列表达基因修饰型北美PRRS病毒。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型北美PRRS病毒。在优选的实施方案中，PRRS病毒经基因修饰使得当其感染猪时，a)不能在动物体内产生PRRS，和b)能在动物体内产生抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。在特定的实施方案中，该DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒不能产生PRRS。
本发明还提供了由上述分离的多核苷酸分子编码的分离的感染性RNA分子，和与其同源的分离的感染性RNA分子，所述分离的感染性RNA分子各编码经基因修饰不能产生PRRS的北美PRRS病毒。
本发明还提供了由上述感染性RNA分子编码的基因修饰型北美PRRS病毒，所述基因修饰型北美PRRS病毒被灭活，使得当其感染猪时，不能在动物体内产生PRRS，但能激发动物体内对PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的病毒载体，所述RNA分子编码上述基因修饰型北美PRRS病毒。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的转染宿主细胞，所述RNA分子编码上述基因修饰型北美PRRS病毒。
本发明还提供了保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效产生抗PRRS病毒感染之免疫保护的上述基因修饰型北美PRRS病毒；上述编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子；质粒形式的上述编码基因修饰型北美PRRS病毒的分离的多核苷酸分子；或上述编码基因修饰型北美PRRS病毒的病毒载体；和兽医学可接受的载体。
本发明还提供了保护猪免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用其量能有效产生抗PRRS病毒感染之免疫保护的上述疫苗免疫动物。
本发明还提供了另外含有编码异源抗原性表位之核苷酸序列的上述任何多核苷酸分子，以及相应的感染性RNA分子、载体、被感染的宿主细胞、基因修饰型北美PRRS病毒、疫苗和给哺乳动物和/或禽类施用该疫苗的方法。所述异源抗原性表位可得自目前已知的或将来确定的任何抗原性表位。在非限制性的实施方案中，所述抗原性表位得自能致病性感染禽类或非猪哺乳动物(如人)的病原体，并能诱导有效抗所述病原体的免疫保护性应答。在另一个非限制性的实施方案中，所述抗原性表位得自猪病原体而不是北美PRRS病毒，并能诱导有效抗该猪病原体的免疫保护性应答。在另一个非限制性的实施方案中，所述抗原性表位是可测的抗原性表位。
本发明还提供了缺乏一个或多个可测抗原性表位的上述任何多核苷酸分子，以及相应的感染性RNA分子、载体、被感染的宿主细胞、基因修饰型北美PRRS病毒、疫苗和给哺乳动物和/或禽类施用该疫苗的方法。
本发明还提供了含有一个或多个编码北美PRRS病毒所编码之肽的核苷酸序列的分离多核苷酸分子，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本发明还提供了含有一个或多个编码北美PRRS病毒所编码之肽的核苷酸序列的转染宿主细胞，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本发明还提供了基因修饰型Nidovirales病毒，该经修饰病毒在被其免疫的哺乳动物或禽类中可引发有效免疫保护性应答，通过得到含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码野生型Nidovirales病毒；对该DNA序列进行基因突变以得到含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型Nidovirales病毒，该病毒在哺乳动物或禽类中不能产生致病性感染，但能引发有效抗野生型Nidovirales病毒感染的免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒，即可制备所述经基因修饰型Nidovirales病毒。
本发明还提供了制备基因修饰型Nidovirales病毒的方法，所述经修饰病毒在被其免疫的哺乳动物或禽类中能引发免疫保护性应答，该方法包括得到含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码野生型Nidovirales病毒；对该DNA进行基因突变以得到含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型Nidovirales病毒，所述病毒在哺乳动物或禽类中不能产生致病性感染，但能引发有效抗野生型Nidovirales病毒感染的免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒。
本发明还提供了能保护哺乳动物或禽类免受Nidovirales病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能在经其免疫的哺乳动物或禽类中有效产生抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保护性应答的上述基因修饰型Nidovirales病毒，和药物学或兽医学可接受的载体。


图1构建北美PRRS病毒之全长感染性cDNA克隆，pT7P129A的克隆策略，箭头表示T7启动子序列。
图2用P129A或重组PRRS病毒rP129A-1感染之后的血清病毒血症，通过MARC-145细胞上的噬斑试验测定。检测的下限是5pfu/ml(或log 0.7)。
图3用P129A或重组PRRS病毒rP129A-1感染之后的抗-PRRS病毒血清抗体，通过HerdChek PRRS ELISA试验(IDEXX(Westbrook，Maine，USA))测定。
本文所述的分离的多核苷酸分子的制备和操作是本领域技术人员熟知的，也可根据其它文献所述进行制备和操作，如Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，分子生物学最新方法，Greene Publishing Associates &Wiley interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic出版公司，San Diego；Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，纽约，上述文献皆列入本文作为参考。A.编码北美PRRS病毒的分离的多核苷酸分子和RNA分子，和编码基因修饰型北美PRRS病毒的分离的多核苷酸分子和RNA分子本发明提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码北美PRRS病毒。本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型北美PRRS病毒。
本发明特别提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。在优选的实施方案中，本发明提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1中从核苷酸1开始至核苷酸15,416的序列(包括核苷酸1和15,416)，不同的是对应于SEQ ID NO1之核苷酸12,622的核苷酸是鸟嘌呤而不是腺嘌呤，对应于SEQ ID NO1之核苷酸1,559的核苷酸是胸腺嘧啶而不是胞嘧啶。所述DNA序列编码感染性RNA分子，该RNA分子是北美PRRS分离物P129的RNA基因组。
应理解，除非特别说明，本文有关核酸分子的术语，如“分离的多核苷酸分子”，“核苷酸序列”，“开放阅读框(ORF)”等包括DNA和RNA分子，并包括单链和双链分子。除非特别说明，当提及本申请“序列表”部分的特定序列时，指的是“序列表”中的DNA以及与DNA序列对应的RNA，包括与DNA和RNA序列互补的序列。在本申请的上下文中，“对应于”是指DNA和RNA序列彼此相同，但事实上RNA序列含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，RNA分子的骨架含有核糖而不是脱氧核糖。
例如，SEQ ID NO1是对应于北美PRRS病毒之RNA基因组的DNA序列，因此，与SEQ ID NO1所示DNA序列互补的DNA序列是北美PRRS病毒之RNA基因组(即编码北美PRRS病毒的RNA)的模板，即与该基因组互补或“编码”该基因组。然而，本文提及的SEQ ID NO1包括对应于SEQ ID NO1的RNA序列和与SEQ ID NO1互补的DNA序列。
另外，当本文提及序列表中序列的同源序列时，应理解也包括序列表中序列之对应序列的同源序列和序列表中序列之互补序列的同源序列。
本发明中的“感染性RNA分子”是编码病毒复制、转录和在适当宿主细胞中翻译成功能性病毒粒所必需之元件的RNA分子，宿主细胞需满足的条件是必要时含有一个或多个肽以补偿该RNA分子中的任何基因修饰，如序列缺失。
“分离的感染性RNA分子”指的是含有上述感染性RNA分子的物质组分，如果所述RNA分子实际上存在于自然界，则其已由天然状态纯化为任何可测的水平。类似地，“分离的多核苷酸分子”指的是含有本发明多核苷酸分子的物质组分，如果所述多核苷酸分子实际上存在于自然界，则其已由天然状态纯化为任何可测的水平。
为了本发明目的，当根据遗传密码的简并性，第二个多核苷酸分子的核苷酸序列编码的多氨基酸与第一个多核苷酸分子的核苷酸序列所编码的相同，或第二个多核苷酸分子的核苷酸序列编码的多氨基酸与第一个多核苷酸分子的核苷酸序列所编码的多氨基酸足够类似，从而可用于本发明实践时，则第二个多核苷酸分子(RNA或DNA)的核苷酸序列与第一个多核苷酸分子的核苷酸序列“同源”。为了本发明目的，当多核苷酸分子可用作诊断探针，通过例如标准杂交或扩增技术检测被感染的猪的体液或组织样品中北美PRRS病毒的存在时，则它可用于本发明实践。应理解由多核苷酸分子的核苷酸序列编码的多氨基酸可含有两个或多个多氨基酸的一个组。一般而言，根据BLASTN算法(国家生物技术信息中心，也称之为美国国立卫生研究院的NCBI(Bethesda，Maryland，USA))，如果第二个多核苷酸分子与第一个多核苷酸分子至少约有70％的核苷酸序列相同，则第二个多核苷酸分子的核苷酸序列与第一个多核苷酸分子的核苷酸序列同源。优选同源的核苷酸序列至少约有75％的核苷酸序列相同，甚至更优选至少约有85％的核苷酸序列相同。由于遗传密码存在简并性，同源的核苷酸序列可包括任何数目的“沉默”碱基变化，即仍编码相同氨基酸的核苷酸取代。同源的核苷酸序列还可包括非沉默突变，即导致所编码的多氨基酸中有氨基酸差异的碱基取代、缺失或添加，只要序列保持与第一个核苷酸序列所编码的多氨基酸至少约70％相同，或可用于本发明实践即可。通过例如使用上述BLASTN比较核苷酸序列可测定同源的核苷酸序列。或者，可通过在选定条件下进行杂交来测定同源的核苷酸序列。例如，如果在中度严紧的条件下，如于65℃在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，并于42℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel等，文献同上)，或在导致与如下文所限定的编码北美PRRS病毒之序列发生杂交的条件下，第二个多核苷酸分子的核苷酸序列能与SEQ ID NO1的互补物杂交，则该核苷酸序列与SEQ ID NO1同源。在另一个实施方案中，如果在高度严紧的条件下，如于65℃在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，并于68℃在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel等，文献同上)，第二个多核苷酸分子的核苷酸序列能与SEQ ID NO1的互补物杂交，则该核苷酸序列与SEQ ID NO1同源。
另外，应理解本发明分离的多核苷酸分子和分离的RNA分子包括合成的分子和通过重组技术，如体外克隆和转录得到的分子。
本文所用术语“PRRS”包括由PRRS病毒感染导致的猪疾病综合征。这种综合征的例子包括但不限于怀孕母猪的流产，生长缓慢，呼吸困难，食欲差和幼猪的死亡。本文所用的“不能产生PRRS”的PRRS病毒指的是能感染猪，但不会在猪中产生任何与PRRS感染相关的疾病综合征，或产生较低程度的所述综合征，或产生较少的所述综合征，或产生较少且程度较低的综合征的病毒。
术语“猪”指的是身为猪科中一员的任何动物，如猪。“哺乳动物”包括哺乳纲的任何恒温脊椎动物，包括人。
除非特别说明，本文所用术语“PRRS病毒”指的是北美或欧洲PRRS病毒的任何病毒株。
术语“北美PRRS病毒”指的是具有与北美PRRS病毒分离物相关之遗传特征的任何PRRS病毒，例如，但不限于90年代初首次在美国分离的PRRS病毒(例见Collins，J.E等，1992，J.Vet.Diagn.Invest，4117-126)；北美PRRS病毒分离物MN-1b(Kwang，J等，1994，J.Vet.Diagn.Invest，6293-296)；PRRS的Quebec IAF-exp91毒株(Mardassi，H等，1995，Arch.Virol.1401405-1418)；和北美PRRS病毒分离物VR 2385(Meng.X.J等，1994，普通病毒学杂志，751795-1801)。遗传特征指的是诸北美PRRS病毒株共有的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。为了本发明目的，北美PRRS病毒是由与SEQ ID NO1相同或与其同源的RNA序列编码的病毒，其中术语“同源”如上文所定义。因此，优选北美PRRS病毒株具有与SEQID NO1至少约70％的基因组核苷酸序列同一性，更优选具有与SEQ IDNO1至少约75％的基因组核苷酸序列同一性，甚至更优选具有与SEQID NO1至少约85％的基因组核苷酸序列同一性。
术语“欧洲PRRS病毒”指的是具有与1991年首次在欧洲分离的PRRS病毒(例见Wensvoort，G等，1991，Vet.Q.13121-130)相关之遗传特征的任何PRRS病毒株。在本领域中，“欧洲PRRS病毒”有时也指“Lelystad病毒”。
除非特别说明，如果北美PRRS病毒的特征在上文所述北美PRRS病毒的定义范围内，该北美PRRS病毒即可“用于本发明实践”。例如，如果由本发明分离的多核苷酸分子之一编码的病毒具有与北美PRRS病毒相关的遗传特征，那么该病毒是“可用于本发明实践的北美PRRS病毒”。
如果其它多氨基酸，如与北美PRRS病毒ORF同源的多核苷酸序列所编码的肽，可以在转染的宿主细胞中补偿编码基因修饰型PRRS病毒的RNA分子(所述RNA分子表达功能性PRRS毒粒所必需的基因缺损)以使细胞能产生功能性的PRRS毒粒，那么这些多氨基酸可“用于本发明实践”。
本文所用术语“开放阅读框”或“ORF”指的是编码特定PRRS病毒蛋白所需的无间插终止密码子的最短的核苷酸序列。
除非特别说明，术语“适当的宿主细胞”指的是可被本发明RNA分子(或含有编码所述RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子或病毒载体)转化或转染的细胞。可被所述RNA分子、分离的多核苷酸分子或病毒载体转染的“适当的宿主细胞”包括哺乳动物(尤其是猪)的细胞和禽细胞，下文中将更详细地描述这些细胞。
“功能性毒粒”是能进入可作为PRRS病毒宿主的细胞，并能在细胞内表达特定RNA基因组(未经修饰的基因组或如本文所述的基因修饰型基因组)之基因的病毒颗粒。可作为PRRS病毒宿主的细胞包括猪尘细胞和MARC 145猴肾细胞。其它哺乳动物或禽细胞，尤其是其它猪细胞，也可用作PRRS毒粒的适当宿主细胞。
本发明分离的多核苷酸分子编码北美PRRS病毒，下文中将要详细描述的是使用本领域已知的方法，用北美PRRS病毒制备活的，灭活的或减毒的疫苗，以用于保护猪免受PRRS病毒的感染。这些分离的多核苷酸分子也可用作载体将异源基因传递至包括猪的哺乳动物或禽内，这一点将在下文中描述。另外，由于使用分子生物学技术可突变这些分离的多核苷酸分子，使其编码可特别地用作保护猪免受PRRS病毒感染之疫苗的基因修饰型北美PRRS病毒，因此，这些分离的多核苷酸分子是有用的。所述基因修饰型北美PRRS病毒以及含有所述病毒的疫苗将在下文中详细描述。
因此，本发明还提供了制备基因修饰型北美PRRS病毒的方法，所述方法包括按上述突变编码感染性RNA分子的DNA序列，所述RNA分子编码北美PRRS病毒，并使用适当的表达系统表达基因修饰型北美PRRS病毒。使用本领域已知的适当表达系统，由分离的多核苷酸分子可表达野生型或基因修饰型北美PRRS病毒，其实施例描述于本申请中。例如，该分离的多核苷酸分子可以是能在体外在适当宿主细胞中表达所编码病毒的质粒形式，有关内容将在下文中描述。
除非特别说明，本文所用术语“经基因修饰”指的是发生了基因突变，即有一个或多个核苷酸被取代、缺失和/或添加。使用本领域技术人员已知的重组技术，包括定点诱变或随机诱变，如暴露于化学诱变剂或放射线中，可对多核苷酸分子进行基因突变，这在本领域内是众所周知的。在一个实施方案中，对本发明之北美PRRS病毒的基因修饰使得该病毒不能在本来可以使野生型病毒在其中有效复制的禽或哺乳动物中有效复制，或降低了其有效复制的能力。在另一个实施方案中，本发明之基因修饰型北美PRRS病毒能在被其感染的禽或哺乳动物中有效复制。“有效复制”指的是在被感染的动物体内复制和产生子代病毒(毒粒)的能力，即“生产性感染”动物的能力。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码不能在猪体内产生PRRS的基因修饰型北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个突变，在遗传学上使得编码的PRRS病毒失去产生PRRS的能力。“遗传学上失活”指的是PRRS病毒不能在被其感染的猪中产生PRRS。
在一个实施方案中，不能导致PRRS的基因修饰型北美PRRS病毒在猪中能引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。因此，本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型北美PRRS病毒，所述基因修饰型北美PRRS病毒感染猪时，a)不能在动物体内产生PRRS，和b)能在动物体内引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答，其中编码所述北美PRRS病毒的DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒不能产生PRRS。
本发明所用术语“免疫应答”指的是产生针对一个或多个特定抗原性表位或有助于其分解或受抑制的抗体和/或细胞(如T淋巴细胞)。本发明所用的短语“有效免疫保护性应答”、“免疫保护”和类似术语，指的是抗病原体的一个或多个抗原性表位，从而保护经免疫动物免受病原体感染的免疫应答。对本发明而言，抗病原体感染的保护作用不仅包括绝对防止感染，也包括与未经免疫的感染动物相比，经免疫的动物中病原体感染的程度或速度有任何可测的降低，或由病原体感染引起的疾病或任何综合征或状况的严重程度有任何可测的降低。在以前未被该病原体感染和/或免疫时未被该病原体感染的动物中可诱导有效免疫保护性应答。也可以在免疫时已被病原体感染的动物中诱导有效免疫保护性应答。
除非特别说明，“抗原性表位”指的是能在特定动物或物种中引发免疫应答的分子。抗原性表位是含蛋白质的分子，即多氨基酸序列，任选含有非蛋白质基团，如碳水化合物组成成分和/或脂质组成成分的多氨基酸序列。
本文所用术语“致病性感染”指的是病原体感染动物并导致动物患病的能力。例如，PRRS病毒能致病性感染猪，因为它可导致猪患PRRS。然而，尽管PRRS病毒或许能够生产性地或非生产性地感染禽或其它哺乳动物，如人，但它不会致病性地感染除猪以外的任何动物，因为它在除猪以外的动物中不会导致任何疾病。
在一个实施方案中，由上述分离的多核苷酸分子编码的基因修饰型北美PRRS病毒能引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。优选这种基因修饰型北美PRRS病毒能引发抗任何PRRS病毒株，包括欧洲和北美病毒株的有效免疫保护性应答。
在一个实施方案中，编码遗传学上失活的北美PRRS病毒的分离多核苷酸分子中所含一个或多个突变是非沉默的，出现在编码北美PRRS病毒之核苷酸序列的一个或多个开放阅读框中；即这个(些)突变出现在编码北美PRRS病毒之核苷酸序列内与SEQ ID NO1之ORF 1a，1b，2，3，4，5，6或7相同或同源的一个或多个序列中。在一个实施方案中，这个(些)突变出现在北美PRRS病毒基因组的一个或多个非编码区中，如北美PRRS病毒基因组的前导序列中；即这个(些)突变出现在与SEQ ID NO1之核苷酸1-191序列相同或同源的序列中。在相同的分离的多核苷酸分子中，突变可出现在编码区和非编码区。
除非特别说明，本文所用的编码北美PRRS病毒之核苷酸序列的“非编码区”指的是不翻译成蛋白质的RNA序列和编码这种RNA序列的cDNA序列。编码区指的是由其表达北美PRRS病毒蛋白质的RNA序列，也指编码这种RNA序列的cDNA。类似地，“ORF”指的是编码北美PRRS病毒之蛋白质的RNA序列，也指编码这种RNA序列的cDNA序列。
根据本文提供的SEQ ID NO1可测定出编码在遗传学上失活、使得不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答的北美PRRS病毒之一个或多个突变的适当位置。本领域技术人员参照本发明提供的北美PRRS病毒之感染性cDNA克隆的序列，可制备导致突变的序列变化，并检测所编码的病毒在猪中产生PRRS和引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答的能力。为此，本领域技术人员可参照本领域已知的技术和本文所述和/或例举的技术。
例如，可突变编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的编码序列的ORF，并检测所得的基因修饰型北美PRRS病毒导致PRRS的能力。北美PRRS病毒的ORF编码下列蛋白质ORF 1a编码含有蛋白酶功能的多蛋白；ORF 1b编码含有复制酶(RNA聚合酶)和解旋酶功能的多蛋白；ORF2，3和4编码小的膜糖蛋白；ORF 5编码主要包膜糖蛋白；ORF 6编码未糖基化的膜内在蛋白；ORF 7编码核壳蛋白。其中一个或多个ORF的基因突变可用于制备本文所述的基因修饰型北美PRRS病毒。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子之DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码经基因修饰而含有一个或多个异源抗原性表位的北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，该多核苷酸分子进一步含有一个或多个各编码并源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各个异源抗原性表位能在哺乳动物或禽类中诱导抗特定病原体的有效免疫保护性应答。
利用本发明上述方面可以诱导针对其的有效免疫保护性应答的病原体是能导致哺乳动物或禽类患病的任何病原体，如病毒，细菌，真菌或原生动物，所述病原体含有或具有一个或多个相关的抗原性表位，可使用该表位在哺乳动物或禽类中诱导抗该病原体的有效免疫保护性应答。
本发明所用术语“异源抗原性表位”指的是上文所定义的一般不存在于野生型北美PRRS病毒中的抗原性表位。可使用已知的重组技术将编码异源抗原性表位的核苷酸序列插入北美PRRS病毒的基因组中。可用作本发明异源抗原性表位的抗原性表位包括其它北美PRRS病毒抗原性表位，欧洲PRRS病毒的抗原性表位，除PRRS病毒外的猪病原体的抗原性表位，或能致病性感染除猪以外的禽类或哺乳动物(包括人)之病原体的抗原性表位。编码所述抗原性表位的序列是本领域已知的或由本文提供。例如，可将由本文所述北美PRRS ORF 5编码的第二个北美PRRS病毒包膜蛋白插入本发明编码北美PRRS病毒之RNA分子的DNA编码序列中，以产生基因修饰型北美PRRS病毒，该病毒含有其它包膜蛋白作为异源抗原性表位。可使用这种基因修饰型北美PRRS病毒在经其免疫的猪中诱导抗PRRS病毒的更有效免疫保护性应答。
除北美PRRS病毒以外的猪病原体抗原性表位的例子包括但不限于选自下列的猪病原体的抗原性表位欧洲PRRS，猪细小病毒，猪circovirus，猪轮状病毒，猪流感病毒，假狂犬病病毒，传染性胃肠炎病毒，猪呼吸冠状病毒，典型的猪热病毒，非洲猪热病毒，脑心肌炎病毒，猪副粘病毒，大叶性肺炎放线杆菌，炭疽芽孢杆菌，支气管炎博德特氏菌，溶血梭菌，产气荚膜梭菌，破伤风梭菌，大肠杆菌，猪红斑丹毒丝菌，副猪嗜血菌，钩端螺旋体，猪肺炎枝原体，猪鼻枝原体，溶血巴斯德氏菌，多杀巴斯德氏菌，猪霍乱沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，似马链球菌和猪链球菌。编码上述猪病原体之抗原性表位的核苷酸序列是本领域已知的，并可得自公开的基因数据库，如NCBI提供的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)。
如果异源抗原性表位是一种或多种其它猪病原体的抗原性表位，那么分离的多核苷酸分子可进一步含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒失去产生PRRS的能力。所述分离的多核苷酸分子及其编码的病毒可用于制备疫苗，该疫苗可保护猪使其免受衍生得到该异源抗原性表位的诸猪病原体的感染。
在优选的实施方案中，基因修饰型北美PRRS病毒能在猪中引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。所述分离的多核苷酸分子及其编码的病毒可用于制备双重功能的疫苗，该疫苗可保护猪免受北美PRRS病毒和衍生得到该异源抗原性表位的诸猪病原体的感染。在另一个优选的实施方案中，可用于双重功能疫苗的基因修饰型北美PRRS病毒在遗传学上是失活的。
使用分子生物学的已知技术，根据本文所述的编码北美PRRS病毒的序列，可按上述制备含有编码异源抗原性表位之核苷酸序列的本发明分离的多核苷酸分子。
在另一个优选的实施方案中，本发明基因修饰型北美PRRS病毒的异源抗原性表位是可测的抗原性表位。所述分离的多核苷酸分子及其编码的北美PRRS病毒可特别地用于研究PRRS病毒对猪的感染，成功确定经免疫的猪，和/或将经免疫的猪与被野生型PRRS病毒感染的猪区分开。优选所述分离的多核苷酸分子还含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒失去产生PRRS的能力，更优选该突变能在猪中引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。
可测的异源抗原性表位及其编码序列是本领域已知的，检测所述抗原性表位的技术也是本领域已知的，包括利用例如Western印迹，ELISA或荧光标记的能与特异于该异源抗原性表位的抗体结合的抗体血清学检测特异于异源抗原性表位的抗体。可用于本发明实践的血清学检测技术描述于本领域公知的文献中，如Coligan，J.E等(编)，1998，免疫学最新方法，John Willey & Sons公司，该文献全文列入本文作为参考。或者，通过例如将潜在含有该抗原性表位的样品与能异性结合抗原性表位的荧光标记抗体或放射性标记抗体接触，可检测异源抗原性表位自身。
本发明还提供了含有编码感染性RNA分子的DNA序列的分离的多核苷酸分子，所述RNA分子编码基因修饰型北美PRRS病毒，所述病毒可测地缺乏北美PRRS病毒抗原性表位，其中编码所述北美PRRS病毒之RNA分子的DNA编码序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它缺乏一个或多个编码可测的北美PRRS病毒抗原性表位的核苷酸序列。这种分离的多核苷酸分子可用于区分被本发明重组北美PRRS病毒感染的猪和被野生型PRRS病毒感染的猪。例如，根据特异于缺失抗原性表位的抗体的缺乏，或根据该抗原性表位自身的缺乏，可区分被灭活的、活的或减毒的由这种分离的多核苷酸分子编码的北美PRRS病毒免疫的动物与被野生型PRRS感染的动物如果在动物中检测到特异于该缺失抗原性表位的抗体，或该抗原性表位自身，则该动物接触过并感染了野生型PRRS病毒。如上文所述，检测抗原性表位和特异于抗原性表位之抗体的方法是本领域已知的。优选所述分离的多核苷酸分子还含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒失去产生PRRS的能力，更优选编码的病毒能引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答。B.编码北美PRRS病毒或基因修饰型北美PRRS病毒的质粒本发明还提供了质粒形式的任何上述分离的多核苷酸分子，所述质粒能表达由其编码的北美PRRS病毒。
本发明质粒可在活生物体外表达所编码的北美PRRS病毒，产生可特别地用于制备疫苗的本发明北美PRRS病毒。在一个实施方案中，可在活生物体外表达北美PRRS病毒的本发明质粒是其中病毒RNA的转录发生在体外(即细胞外)的质粒；使用已知的转染机理，如电穿孔，脂转染(有时使用可商购试剂，如LipofectinTM(Life Technologies公司，Rockville，Maryland，USA))或DEAE葡聚糖介导的转染，将所得病毒RNA分子转染至适当的宿主细胞中。其它转染方法是本领域已知的，可用于本发明中。可体外转录北美PRRS病毒RNA的质粒的例子是质粒pT7P129A(ATCC登记号203488)。在本发明质粒中可使用对体外转录有用的任何启动子。T7是这样一个启动子，但也可以使用其它启动子，如SP6启动子或T3启动子。所述启动子的序列可以人工合成或克隆自商购质粒。可用于制备能表达北美PRRS病毒之质粒的适当质粒包括但不限于通用的克隆载体质粒，如pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)，pBR322和pUC18。可使用已知重组技术将编码北美PRRS病毒的本发明核苷酸序列插入上述任何质粒中。可插入本发明多核苷酸分子的其它质粒是本领域技术人员已知的。
由含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的上述任何重组质粒体外转录病毒RNA的适当条件取决于质粒的类型，例如其特定的启动子，本领域技术人员可确定此条件。例如，如果本发明质粒基于的是含有T7启动子的pCR2.1质粒，那么体外转录的适当条件包括例如在标准缓冲液中将质粒与T7 RNA聚合酶和核糖核苷酸反应，并在37℃将反应物保温约30分钟。有时可使用能由特定质粒转录RNA的商购试剂盒，本发明中即可使用这种试剂盒。可将未经纯化的转录后反应混合物直接转染至适当的宿主细胞中，或者可在转染前通过已知的RNA纯化技术，例如有机(如苯酚)提取和醇(如乙醇或异丙醇)沉淀纯化转录的北美PRRS病毒RNA。
实践中，可用按上述得到的北美PRRS病毒RNA转染任何哺乳动物或禽类细胞培养物，以产生第一代北美PRRS毒粒。因其易于得到并易于使用而特别有用的细胞例子是BHK(幼仓鼠肾)细胞。然而，如果希望产生能持续生产北美PRRS毒粒的细胞培养物，则优选使用猪尘细胞或MARC-145细胞(Kim，H.S等，文献同上)，因为这些细胞在经PRRS病毒感染之后可分泌高水平的新一代PRRS毒粒。也可使用衍生自MA-104细胞系的其它细胞系以持续产生本发明北美PRRS毒粒。通过对猪进行肺灌洗可得到原代猪尘细胞，从国家兽医部门实验室(另称为NVSL)(Ames，Iowa，USA)可得到MARC-145猴肾细胞系。
在另一个实施方案中，可在活生物体外表达本发明北美PRRS病毒的质粒是通过例如电穿孔或脂转染转染至适当的宿主细胞中的质粒，该质粒对感染性RNA分子的转录和对北美PRRS病毒的表达发生在转染的宿主细胞中，因此，经转染的宿主细胞产生了北美PRRS毒粒。迄今为止尚未公开或暗示过Nidovirales目内任何病毒可以使用这种完全细胞法。由于Nidovirales目病毒之RNA基因组中可能存在隐蔽剪接和终止序列，据信表达Nidovirales病毒的完全细胞法是不可能的。隐蔽序列包括RNA剪接供体和剪接受体序列(它可导致RNA转录物的不适当剪接)以及聚腺苷酸化序列，从而导致细胞RNA聚合酶II在成熟前终止。然而，本发明阐明当将含有Nidovirus之cDNA克隆的质粒直接转染至适当的宿主细胞时，该质粒中这种序列的存在不会抑制质粒表达Nidovirus的能力。
因此，本发明还提供了质粒和表达Nidovirales病毒的完全的细胞法，其中质粒含有a)编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列；和b)能在细胞中转录所述编码序列的启动子，其中所述启动子与编码感染性RNA分子的DNA序列可操作地连接。该方法包括用所述质粒转染适当的宿主细胞，将经转染的宿主细胞置于适于表达转染至细胞中的基因序列的条件下，和从细胞中收集表达的Nidovirales病毒。适于在活生物体外完全用细胞表达北美PRRS病毒的质粒例子是质粒pCMV-S-P129(ATCC登记号203489)。在优选的实施方案中，这种质粒的启动子是CMV启动子。在优选的实施方案中，适于表达Nidovirales病毒之完全细胞法的本发明质粒含有真核启动子，如CMV启动子，该启动子直接位于编码Nidovirales病毒之核苷酸序列的上游并与其相邻。在优选的实施方案中，编码Nidovirales病毒的核苷酸序列编码欧洲或北美PRRS病毒。可利用上述完全细胞法表达的其它Nidovirales病毒的例子包括其它马动脉炎病毒科成员，例如马动脉炎病毒，乳酸脱氢酶升高病毒和猿猴出血热病毒；冠状病毒属病毒，例如但不限于猪传染性腹膜炎病毒，猪肠冠状病毒，犬冠状病毒，牛冠状病毒，猪呼吸冠状病毒，火鸡冠状病毒，猪传染性胃肠炎病毒，人冠状病毒，鼠肝炎病毒和禽传染性支气管炎病毒；和Toroviridae属的成员，例如但不限于Berne病毒，Breda病毒和人torovirus。因此，本发明还包括含有编码上述病毒之一的核苷酸序列并适用于完全细胞表达的质粒。
可用于制备在活生物体外完全细胞表达Nidovirales病毒，如PRRS病毒的本发明重组质粒的适当质粒实际上包括可用于在真核细胞中转染和表达的任何质粒。适于制备完全细胞表达Nidovirales病毒的本发明重组质粒的质粒例子是质粒pCMVbeta(C1ontech，Palo Alto，California，USA)。能在真核细胞中转染和表达基因并能用于制备本发明质粒的其它质粒包括但不限于pcDNA3.1，pRc/RSV和pZeoSV2(皆得自Invitrogen)；和pCMV-Sport3和pSV-Sport1(皆得自LifeTechnologies公司)。然而，任何真核表达载体几乎都可以用于本发明。基于粘粒的构建体也可用于在体内完全细胞表达Nidovirales病毒。
可用于本发明表达PRRS病毒之完全细胞法的适当宿主细胞包括上述猪尘细胞和MARC 145细胞。用质粒转染这些细胞的方法与用上述病毒RNA转染细胞的方法基本上相同。所述方法包括但不限于电穿孔，脂转染，DEAE葡聚糖介导的转染和磷酸钙共沉淀。
一旦根据本发明用病毒RNA或含有编码病毒的核苷酸序列的质粒转染了宿主细胞，如猪尘细胞或MARC 145细胞，即可将细胞置于-80℃或以下冷冻储存几年。为储存更长一段时间，即几十年，优选在液氮中储存。如果要比较频繁地使用编码的病毒，则可使用已知技术将携有病毒的细胞在培养物中维持(非冷冻)较短一段时间。另外，可在-80℃或以下冷冻储存由所述细胞分泌的病毒颗粒作为病毒来源。必要时，可通过例如使用免疫荧光抗体试验检测细胞系分泌的耗尽介质中的PRRS病毒抗原来证实编码病毒的多核苷酸分子对该细胞系的转染。特异于PRRS病毒抗原的抗体是本领域已知的(例见Collins，E，J等，WO 93/03760，1993年3月4日)。
在另一个实施方案中，含有编码北美PRRS病毒的核苷酸序列的本发明质粒适于体内表达，即在活生物体中表达北美PRRS病毒。可用于制备体内表达北美PRRS病毒的重组质粒的质粒包括但不限于能转染上述真核细胞的质粒，如pCMVbeta。
可被本发明质粒转染的动物包括哺乳动物和禽类。如果动物是非猪动物，例如野鸭，则质粒可含有编码下述北美PRRS病毒的核苷酸序列，所述病毒含有得自能致病性感染动物之病原体的其它抗原性表位；此时，质粒编码北美PRRS病毒，用作将表位转运至动物的载体。如果动物是猪，则质粒可有用地编码本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修饰型北美PRRS病毒。C.编码北美PRRS病毒的病毒载体，包括编码基因修饰型北美PRRS病毒的病毒载体本发明还提供了含有编码感染性RNA分子之DNA序列的病毒载体，所述RNA分子编码本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修饰型北美PRRS病毒。所述病毒载体可用于转染真核细胞以在活生物体外产生本发明PRRS病毒，或可用于将编码北美PRRS病毒的序列转染猪，或其它哺乳动物或禽类，以在体内表达北美PRRS病毒。
可用作载体以制备本发明病毒载体的病毒例子包括猪病毒，例如猪痘病毒，猪α疱疹病毒1型或非洲猪瘟病毒，但并不限于此。所述猪病毒可得自美国农业部的国家兽医部门实验室(Ames，lowa，USA)；美国典型培养物保藏中心，也称ATCC(Manassas，Virginia，USA)；和其它已知来源。基于适当猪病毒，如上述猪病毒的重组病毒载体适用于用编码本发明北美PRRS病毒的核苷酸序列转染猪。
使用如本申请上文所提及的文献中所述的已知重组技术可制备基于这些和其它病毒的病毒载体，所述载体含有编码本发明北美PRRS病毒的感染性RNA分子的DNA编码序列。D.编码北美PRRS病毒或基因修饰型北美PRRS病毒的转染宿主细胞本发明还提供了含有编码感染性RNA分子之DNA序列的转染宿主细胞，所述RNA分子编码本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修饰型北美PRRS病毒，其中所述转染宿主细胞能表达北美PRRS病毒。所述转染宿主细胞可用于产生本发明北美PRRS病毒。本发明转染宿主细胞的例子包括上述转染的猪尘细胞和转染的MARC-145细胞。
本发明其它的转染宿主细胞包括但不限于转染的MA-104细胞和转染的MA-104细胞其它衍生物；转染的幼仓鼠肾(BHK)细胞；转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；和转染的非MA-104细胞或MARC-145细胞的非洲绿猴肾细胞，如VERO细胞。E.北美PRRS病毒，包括基因修饰型北美PRRS病毒本发明还提供了由上述任何一种分离的多核苷酸分子、RNA分子、质粒、病毒载体或转染宿主细胞表达和/或编码的本文所述北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修饰型北美PRRS病毒。
在某些情况下，例如北美PRRS病毒将用于猪疫苗，且未按上文所述对北美PRRS病毒进行基因修饰以使其不能导致PRRS时，需要通过例如灭活或减毒来处理该北美PRRS病毒，以使其不能在施用所述病毒的猪中导致PRRS。可使用已知方法灭活本发明北美PRRS病毒以使其不能在动物中导致PRRS。所述方法的例子包括但不限于用甲醛，BEI(二吖丙啶)或BPL(β-丙醇酸内酯)处理。减毒方法也是本领域已知的，可使用这种方法使本发明北美PRRS病毒减毒。通过例如在细胞培养物中连续传代可使本发明北美PRRS病毒减毒。
如果本发明北美PRRS病毒是用于非猪动物，或如果已按上文所述对它进行了基因修饰使其不能在猪中产生PRRS，则不必在用作疫苗之前按上一节所述处理病毒。F.疫苗及其使用本发明还提供了疫苗，该疫苗含有本文所述的北美PRRS病毒，包括本文所述的经基因修饰失去在猪中产生PRRS之能力的北美PRRS病毒；本文所述的编码上述北美PRRS病毒的感染性RNA分子和质粒；和本文所述的编码上述北美PRRS病毒和分离的RNA分子的病毒载体。本发明还提供了保护动物免受感染的方法，所述方法包括用所述疫苗免疫接种。
在优选的实施方案中，本发明提供了疫苗，该疫苗含有本文所述的含有一个或多个异源抗原性表位的基因修饰型北美PRRS病毒，编码所述基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子，或本文所述的编码基因修饰型北美PRRS病毒的质粒，其量能有效引发抗衍生得到上述异源抗原性表位的病原体感染之免疫保护性应答，该疫苗还含有药物学或兽医学可接受的载体。
可使用这种疫苗保护能被衍生得到异源抗原性表位的所述病原体致病性感染的哺乳动物或禽类免受感染。因此，本发明还提供了保护哺乳动物或禽类免受病原体感染的方法，所述方法包括用其量能有效引发哺乳动物或禽类抗该病原体感染之免疫保护性应答的上一节所述疫苗免疫哺乳动物或禽类。
在另一个优选的实施方案中，疫苗含有基因修饰型北美PRRS病毒或编码所述基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子或质粒，所述病毒含有或编码一个或多个得自非北美PRRS病毒之猪病原体的异源抗原性表位。这些疫苗可用于保护猪免受衍生得到上述异源抗原性表位的诸猪病原体的感染。如果这种疫苗含有基因修饰型北美PRRS病毒，优选北美PRRS病毒的基因修饰使得病毒不能在猪中导致PRRS。在另一个优选的实施方案中，疫苗中基因修饰型北美PRRS病毒能引发抗PRRS病毒感染的免疫保护性应答，因此，本发明提供了双重功能的猪疫苗，它可以保护猪免受可衍生得到上述异源抗原性表位的诸猪病原体的感染，也可保护猪免受PRRS病毒感染。如果疫苗含有编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子或质粒，所述病毒含有一个或多个得自其它猪病原体的异源抗原性表位，那么编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子的编码序列优选含有一个或多个其它突变，所述突变在遗传学上使得编码的北美PRRS病毒失活，使其不能导致PRRS。在另一个优选的实施方案中，编码的基因修饰型失活北美PRRS病毒能在猪中引发抗PRRS感染的免疫保护性应答，因此提供了双重功能的猪疫苗，它可以保护猪免受衍生得到上述异源抗原性表位的诸猪病原体的感染，也可保护猪免受PRRS病毒感染。所有这些疫苗都另外含有兽医学可接受的载体。
本发明还提供了保护猪免受一种或多种非北美PRRS病毒的猪病原体感染，任选同时也可保护猪免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用其量能有效引发猪抗所述各猪病原体感染和任选地抗PRRS病毒感染之免疫保护性应答的上一节所述疫苗免疫动物。
可根据公知的常规方法，将本发明疫苗配制成包括动物(适当时包括人)可接受的载体，如标准的缓冲液，稳定剂，稀释剂，防腐剂和/或增溶剂，也可配制成便于缓释。稀释剂包括水，盐水，葡萄糖，乙醇，甘油等。等渗添加剂包括氯化钠，葡萄糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。其它适当的疫苗载体和添加剂包括对配制经修饰的活疫苗特别有用的那些试剂，它们是本领域技术人员已知的或显而易见的，例见Remington’s Pharmaceutical Science，第18版，1990，Mack Publishing，该文献列入本文作为参考。
本发明疫苗还可含有一种或多种其它的免疫调节成分，如佐剂或细胞因子等。可用于本发明疫苗之佐剂的非限制性例子包括RIBI佐剂系统(Ribi公司，Hamilton，MT)，明矾，如氢氧化铝凝胶的矿物凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，如弗式完全佐剂和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)，QS-21(Cambridge Biotech公司，CambridgeMA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，AMPHIGEN佐剂，皂苷，QuilA或其它皂苷组分，单磷酰脂质A和Avridine脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗的水包油溶剂的非限制性例子包括经改良的SEAM62和SEAM 1/2制剂。经改良的SEAM62是含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)，1％(v/v)SPAN85去污剂(ICI表面活性剂)，0.7％(v/v)TWEEN80去污剂(ICI表面活性剂)，2.5％(v/v)乙醇，200μg/ml Quil A，100μg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳剂。经改良的SEAM1/2是含有5％(v/v)角鲨烯，1％(v/v)SPAN85去污剂，0.7％(v/v)TWEEN80去污剂，2.5％(v/v)乙醇，100μg/ml Quil A和50μg/ml胆固醇的水包油乳剂。可包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素，干扰素或其它已知的细胞因子。
任选将本发明疫苗配制成可以缓释本发明病毒，感染性RNA分子，质粒或病毒载体。所述缓释制剂的例子包括与生物相容性聚合物复合材料混合的病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体，所述聚合物如聚(乳酸)，乳酸乙醇酸共聚物，甲基纤维素，透明质酸，胶原等。药物传递载体中可降解聚合物的结构、选择和使用可参见几篇文献，包括A.Domb等，1992，Polymers for Advanced Technologies3279-292(列入本文作为参考)。选择和使用药物制剂中的聚合物的其它指导例见本领域已知的课本，如M.Chasin和R.Langer(编)，1990，“用作药物传递系统的生物降解性聚合物”药物与药学，第45卷，M.Dekker，NY(列入本文作为参考)。或者，或另外，可将病毒、质粒或病毒载体装入微胶囊中以改善给药和效力。使抗原微胶囊化的方法是本领域已知的，包括例如美国专利3,137,631；3,959,457；4,205,060；4,606,940；4,744,933；5,132,117；国际专利申请WO 95/28227中所述的技术(皆列入本文作为参考)。
也可使用脂质体缓释病毒、质粒或病毒载体。制备和使用脂质体制剂的有关细节例见美国专利4,016,100；4,452,747；4,921,706；4,927,637；4,944,948；5,008,050和5,009,956(皆列入本文作为参考)。
通过常规方法，先从低剂量的病毒、质粒或病毒载体开始，然后增加剂量同时监测药效即可确定上述任何疫苗的有效量。单次施用疫苗或多次施用疫苗之后可得到有效量。当确定每只动物的最适剂量时需考虑已知因素，包括动物的物种、大小、年龄和身体状况，动物中其它药物的存在等。优选考虑其它动物的研究结果之后选定实际的剂量。
检测是否得到足够的免疫应答的一个方法是测定免疫后的动物中的血清转变和抗体滴度。优选由医生或兽医根据所有相关因素(其中一些如上所述)的分析结果确定免疫的时间安排和加强免疫的次数(如果需要的话)。
使用已知技术，并考虑本领域技术人员可确定的因素，如免疫动物的体重等，可确定本发明病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的有效剂量。本发明疫苗中本发明病毒的剂量范围优选为约101至约109pfu(噬斑形成单位)，更优选为约102至约108pfu，最优选为约103至约107pfu。本发明疫苗中本发明质粒的剂量范围优选为约0.1μg至约100mg，更优选为约1μg至约10mg，甚至更优选为约10μg至约1mg。本发明疫苗中本发明感染性RNA分子的剂量范围优选为约0.1μg至约100mg，更优选为约1μg至约10mg，甚至更优选为约10μg至约1mg。本发明疫苗中本发明病毒载体的剂量范围优选为约101至约109pfu，更优选为约102至约108pfu，最优选为约103至约107pfu。适当的剂量大小范围为约0.5ml至约10ml，更优选约为1ml至5ml。
本发明还提供了含有本文所述北美PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体的疫苗的制备方法，所述方法包括将有效量的本发明北美PRRS病毒、感染性RNA分子、质粒或病毒载体之一与药物学或兽医学可接受的载体混合。
应理解除非特别说明，术语“本发明北美PRRS病毒”和类似术语包括本文所述的任何基因修饰型北美PRRS病毒以及由SEQ ID NO1或其同源序列编码的本文所述未修饰的北美PRRS病毒。G.编码北美PRRS病毒肽的分离的多核苷酸分子和转染的宿主细胞，和制备功能性北美PRRS毒粒的方法本发明还提供了含有一个或多个核苷酸序列的分离的多核苷酸分子，所述核苷酸序列编码由北美PRRS病毒编码的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ ID NO1的RNA分子相同或同源。本文所用术语“北美PRRS病毒肽”指的是由北美PRRS病毒表达的肽。所述肽可以但不是必需特异于北美PRRS病毒。
在优选的实施方案中，编码北美PRRS病毒肽的本发明分离的多核苷酸分子含有独立地选自下列序列中的一个或多个序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9和与任何所述序列同源的序列。所述分离的多核苷酸分子可用于质粒中或用于制备病毒载体以转染适当的宿主细胞，产生含有一个或多个编码由北美PRRS病毒所编码之肽的核苷酸序列的“辅助”细胞，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源，所述辅助细胞可用于制备本发明基因修饰型北美PRRS病毒的功能性毒粒，该病毒已按上文所述进行了基因修饰使得病毒RNA基因组中失去编码辅助细胞所编码的一个或多个肽的序列。
因此，本发明还包括含有一个或多个核苷酸序列的质粒和病毒载体，所述核苷酸序列编码由北美PRRS病毒编码的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源。本发明这种质粒可基于上文所述可用于制备含有编码北美PRRS病毒之核苷酸序列的质粒的那些质粒。本发明病毒载体可基于例如逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体。这些质粒和病毒载体可用于制备上一节所述的辅助细胞。
因此，本发明还提供了辅助细胞，即含有一个或多个核苷酸序列的转染宿主细胞，所述核苷酸序列编码由北美PRRS病毒编码的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源。在优选的实施方案中，转染的宿主细胞含有独立地选自下列序列的一个或多个核苷酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9和与任何所述序列同源的序列。如上所述，这些辅助细胞可用于提供肽，该肽可补偿缺乏辅助细胞所编码之肽的编码序列的感染性RNA分子，使得细胞可产生基因修饰型北美PRRS病毒的功能性毒粒。
可用于本发明此方面的适当细胞包括上述适于表达北美PRRS病毒的细胞，如猪尘细胞和MARC-145细胞。然而，实际上可使用任何哺乳动物或禽类细胞。如上所述，如果希望得到能被PRRS毒粒再次感染因而能产生多代基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的转染宿主细胞，则优选使用猪尘细胞和MARC-145细胞。
因此，本发明还提供了产生基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由对应于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列编码，其中含有一个或多个突变使得一个或多个肽编码序列失活，所述方法包括用编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、质粒或病毒载体转染上一节所述的辅助细胞，所述辅助细胞含有编码基因修饰型北美PRRS病毒的失活肽编码序列的一个或多个北美PRRS病毒肽的一个或多个核苷酸序列。
本发明还提供了产生基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由对应于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列编码，其中在一个或多个肽编码序列中含有一个或多个突变，所述方法包括用编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、质粒或病毒载体以及在细胞中表达所述经修饰的北美PRRS病毒之一个或多个突变肽编码序列的一个或多个北美PRRS病毒肽的辅助病毒转染适当细胞，将基因修饰型北美PRRS毒粒与辅助病毒分开。分离方法是本领域已知的，包括使用条件致死辅助病毒，该方法可在某些条件下区分(杀死)辅助病毒，而不杀死表达的北美PRRS病毒。其它已知的分离方法包括在表达辅助病毒毒粒和北美PRRS病毒毒粒之后使用物理分离方法，如密度梯度离心。可用于本发明此方法的适当细胞包括能被PRRS病毒感染的细胞，如猪尘细胞和MARC-145细胞。本申请上文中描述了能被PRRS病毒感染的其它细胞，例如MA-104细胞系或衍生自MA-104细胞系的其它细胞系。辅助病毒的例子是PRRS病毒，优选为北美PRRS病毒分离物，如P129。任何能表达PRRS肽的野生型分离的或重组的病毒都可用作辅助病毒。
编码基因修饰型北美PRRS病毒，可用于产生基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的上述任一方法的感染性RNA分子、质粒和病毒载体是本申请所述的那些感染性RNA分子、质粒和病毒载体。H.免疫保护性的基因修饰型Nidovirales病毒和含有所述病毒的疫苗本发明还提供了能在被其免疫的哺乳动物或禽类中引发免疫保护性应答的基因修饰型Nidovirales病毒，制备该基因修饰型Nidovirales病毒的方法是得到含有编码野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子；对所述DNA序列进行基因突变以得到含有编码基因修饰型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，所述修饰病毒能在哺乳动物或禽类中引发抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒。
本发明还提供了制备能在被其免疫的哺乳动物或禽类中引发免疫保护性应答的基因修饰型Nidovirales病毒的方法，所述方法包括得到含有编码野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子；对所述DNA序列进行基因突变以得到含有编码基因修饰型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，所述修饰病毒能在哺乳动物或禽类中引发抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒。
编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列包括与本文所述的编码北美PRRS病毒的SEQ ID NO1相同或同源的DNA序列。编码非北美PRRS病毒的Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列是本领域已知的，并可得自已知来源，例如上文提及的基因数据库。编码可用于本发明Nidovirales病毒之感染性RNA分子的其它一些DNA编码序列的例子包括Meulenberg，J.J.M等(1993，文献同上)所述编码欧洲PRRS病毒的DNA序列；van Dinten，L.D等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(3)991-6)所述编码马动脉炎病毒的DNA序列；和den Boon，J.A等(1991，病毒学杂志，65(6)2910-20)所述编码马动脉炎病毒的DNA序列(上述文献皆列入本文作为参考)。可通过本发明进行基因修饰的Nidovirales病毒可以是已得到其DNA编码序列的任何Nidovirales病毒，本申请上文中描述了一些Nidovirales病毒的例子。
一旦得到编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列，可使用上述重组技术合成含有编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，例如质粒。
可按上文突变北美PRRS病毒的技术对编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的编码序列进行基因突变，以得到含有基因修饰的Nidovirales病毒，所述基因修饰例如是不能在被其感染的动物中导致疾病，包含能在动物中引发免疫保护性应答的异源抗原性表位，包含可测的异源抗原性表位，和缺失可测的抗原性表位。所述基因修饰如上文所述。用于编码基因修饰型Nidovirales病毒的基因突变可发生在编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列中的编码区和/或非编码区。在一个实施方案中，一个或多个基因突变发生在编码Nidovirales病毒之病毒肽的ORF中。
本文所用术语“野生型Nidovirales病毒”指的是其基因组未经有意地基因突变的Nidovirales病毒，如天然的Nidovirales病毒及其分离物。
本发明还提供了保护哺乳动物或禽类免受Nidovirales病毒感染的疫苗，该疫苗中含有其量能在被其免疫的哺乳动物或禽类中引发抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保护性应答的上述基因修饰型Nidovirales病毒，以及药物学和兽医学可接受的载体。可使用上述配制疫苗的技术来配制本发明这些疫苗。
提供下列实施例仅仅是为了阐明本发明多个方面，这些实施例并非旨在，也不应被解释为是对权利要求书中所示的和本文更全面描述的本发明范围的限制。实施例I.制备北美PRRS病毒分离物的感染性cDNA克隆PRRS病毒和MARC-145细胞的来源被称为P129的北美PRRS病毒分离物得自Purdue大学动物疾病诊断实验室(West Lafayette，Indiana)的Gregory W.Stevenson，William G.Van Alstine和Charles L.Kanitz博士。1995年秋首次从印第安那州南部遭受PRRS严重大暴发的猪群中分离得到P129病毒。该农场以前没有PRRS病毒感染或PRRS免疫史。P129分离物比同期在同一地理区域分离得到的几个其它野生型分离物的毒力更强，因为它在幼猪中产生了更严重和持续时间更强的呼吸疾病。最初在猪原代尘细胞(天然宿主细胞)上分离得到该病毒，随后在MARC-145细胞上传代(Kim，H.S等，1993，Arch.Virol.133477-483)。编码P129结构蛋白的基因与相应的已知北美PRRS基因序列同源。
用于增殖PRRS病毒的MARC-145细胞系是MA-104罗猴肾细胞系的一个克隆。MARC-145细胞得自USDA的国家兽医部门实验室(NVSL，Ames，lowa)。对这些细胞进行检测，发现它们中不含支原体和常见的猪外部因子。于37℃，在添加有2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM(LifeTechnologies公司)中常规培养MARC-145细胞。
从P129病毒原种中噬斑纯化出5个生物学克隆，并称之为P129A至P129E。通过用P129病毒感染MARC-145细胞单层，加入含1.25％SeaPlaque琼脂糖(FMC BioProducts)、2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM上层，进行噬斑纯化。保温7天后可清楚地看见噬斑，此时挑选5孔分离的噬斑并传代到新鲜的MARC-145单层上。当致细胞病变效应(病毒诱导的细胞死亡)变得明显时，对这些培养物的子代病毒各进行另一轮噬斑纯化。从5个克隆中各挑选1孔分离的噬斑，扩展该噬斑以产生大量原种。单独(克隆A和E)或联合(克隆B-D，或克隆A-E)检测5个克隆对幼猪的毒力。在所有情况下，经噬斑纯化的病毒在猪中能良好地复制并导致临床疾病。临床症状的严重程度比未经克隆的P129病毒弱，甚至当同时使用所有5个克隆时也是如此。选定P129A进行测序并用于随后的分子操作。
测定P129A的基因组序列从猪开始10次连续传代(包括两次噬斑纯化和随后的一次传代)之后，使用经噬斑纯化的P129A病毒进行测序。SEQ ID NO1表示对应于P129A RNA基因组的cDNA序列。基因组长度为15,395个核苷酸(不包括聚腺苷尾)，由ATGACGTA开始，CCGCAATT结束。SEQ ID NO1中还提供了55个残基长的典型的聚腺苷尾。
对于含有3’端20％基因组的P129A结构基因(ORF 2至7)而言，根据可得自公用DNA序列数据库GenBank的其它北美PRRS病毒分离物的几个部分cDNA序列(如PRU00153)选择多个PCR引物。使用逆转录酶和随机的六聚体引物将纯化的病毒RNA逆转录成cDNA。然后在具有基因特异性引物的PCR中使用该cDNA。从凝胶上切下PCR产物，并T/A克隆至质粒pCR2.1(Invitrogen)中。对各个引物对而言，测定多个质粒(来自独立的PCR反应)的DNA序列。使用Lasergene程序包(DNASTAR公司)中的Seqman程序组装序列。从而完成P129A基因组中第11,992至15,347位的序列。
GenBank数据库中还有一系列短序列(总共约218个核苷酸)，它们含有几个PRRS病毒分离物之ORF 1b基因的部分。使用其中一个(PPSSEQB)设计PCR引物(正向引物5’-ACAGTTTGGTGATCTATG-3’(SEQID NO10)，对应于第9063至9080位；反向引物5’-CAGATTCAGATGTTCAA-3’(SEQ ID NO11)，对应于第9252至9268位)。这些引物扩增206个核苷酸的片段，其中包括得自P129A ORF1b基因的171个核苷酸的新序列，对应于第9081至9251位。在此区域内设计一个新的正向引物(5’-ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3’(SEQ ID NO12)，第9201-9224位)，在ORF1b内紧接ORF2的上游设计一个匹配的引物(5’-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAATGA-3’(SEQ ID NO13)，第12,027-12,050位)。在RT-PCR中使用这些引物扩增ORF1b之2850个核苷酸的片段，对应于P129A基因组的第9201-12,050位。
在对PRRS病毒之另一个北美野生型分离物的ORF5进行RT-PCR扩增的过程中，看见小于预期大小的弱带。对其进行测序，发现它与Lelystad病毒的ORF 1a具有有限的同源性(由错误引发引起)。选定此区域内的新引物来扩增P129A(正向引物5’-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3’(SEQ ID NO14)，对应于第1587-1610位；反向引物5’-AGAGCGGCTGGGATGACACTG-3’(SEQ ID NO15)，对应于第1877-1897位)。除了311个核苷酸(引物之间266个核苷酸的新P129A序列，对应于第1611-1876位)的产物外，克隆并测序了701个核苷酸长的较大的次要PCR产物(引物之间656个核苷酸的新P129A序列，对应于第1611-2264位)。第2265-2269位的逆转录引物错误引发导致了该较大的带。
使用商购试剂盒(Life Technologies公司)，通过5’RACE(快速扩增cDNA末端)测定P129A基因组的5’最末端。从已知的ORF 1a序列中选定两个嵌套的反向引物(“RACE2”5’-CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3’(SEQ ID NO16)，第1917-1938位；和“RACE3”5’-AGGGGGAGCAAAGAA GGGGTCATC-3’(SEQ ID NO17)，第1733-1756位)。使用RACE2引发cDNA合成，而在PCR中使用RACE3。克隆并测序所得PCR产物。两个最长的产物在完全相同的碱基处结束(SEQ ID NO1中的第1位)。
使用长RT-PCR在ORF1a和ORF1b已知序列之间的大缺口上驾桥。使用两个新引物(正向引物5’-AGCACGCTCTGGTGCAACTG-3’(SEQ IDNO18)，第1361-1380位；反向引物5’-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3’(SEQID NO19)，第9420-9438位)。克隆并测序所得8078个核苷酸的RT-PCR产物。
通过将病毒RNA的3’和5’端连接在一起，并使用RT-PCR扩增连接片段，测定P129A基因组的3’最末端。克隆并测序所得的连接片段。简单地说，用烟草焦磷酸酶处理由沉淀毒粒提取的RNA(以除去5’帽结构)，然后用T4 RNA连接酶自身连接(两种酶都得自EpicentreTechnologies)。所用引物是5’-CGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3’(SEQ IDNO20)(正向引物，第15,218-15,239位)和5’-CGGTAGG TTGGTTAACACATGAGTT-3’(SEQ ID NO21)(反向引物，第656-680位)或5’-TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3’(SEQ ID NO22)(反向引物，第337-359位)。所有所得克隆均在基因组的5’末端截短(通过5’RACE揭示出最完整的片段位于实际5’末端的57个核苷酸内)，然而，其中两个克隆含有包括聚腺苷尾的整个基因组3’末端(长度为42和55个腺苷残基)。这样就完成了PRRS分离物P129A之cDNA 15,450个碱基(包括polyA尾)基因组的测序，结果示于SEQ ID NO1。
产生P129A的感染性全长cDNA克隆由4个重叠的克隆RT-PCR产物装配P129A的全长感染性cDNA克隆，该克隆被称为pT7P129A。首先将4个RT-PCR产物T/A克隆至质粒pCR2.1(Invitrogen)并转染至大肠杆菌菌株DH5-α中。筛选细菌菌落，选择含有以“T7至M13”方向插入的预期大小插入物的菌落供测序和进一步操作。所有4个克隆的RT-PCR产物含有一个或多个非沉默突变(与SEQ ID NO1的P129A共有核苷酸序列有偏差，可导致所编码的ORF的氨基酸序列发生变化)。通过由其它克隆的RT-PCR产物亚克隆片段修复这些非沉默突变(补救ORF2中第12,622位的一个突变)。使用可利用的限制性位点逐步将4个修复的亚基因组克隆装配成全长克隆(见图1)。通过添加T7启动子和适当的限制性内切酶位点修饰对应于pT7P129A中的P129A基因组的cDNA 5’和3’末端。下一段将更详细地描述pT7P129A的构建对通过5’-RACE产生并按上述克隆至pCR2.1的基因组5’末端(第1-1756位)进行修饰，以在紧接对应于P129A基因组之cDNA的上游导入T7启动子和PacI位点供随后克隆。使用此质粒1216 bp的DsaI-BseRI片段(含有P129A的碱基27-1242)，同一质粒4407 bp的BseRI-XbaI片段(含有P129A的碱基1243-1756和直至XbaI位点的整个质粒载体)，和下列合成的双链衔接子(SEQ ID NO23和24)进行三方连接5′-CTAGATTAATTAATACGACTCACTATAGGGATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGC-3′3′-TAATTAATTATGCTGAGTGATATCCCTACTGCATATCCACAACCGAGATACGGTGC-5′XbaI＿＿＿＿＿ T7启动子 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿DsaIPacIP129A 基因组推测的得自T7启动子的转录物包括该启动子紧接病毒基因组第一个“A”上游的单个“G”残基。通过用另一个克隆的相同片段取代906bp的AatII-SacII片段(碱基740-1645)，以修复第1230位的非沉默突变(A变为G)。将此质粒称为“pT7R3A-2”。
使用上述8078个核苷酸的PCR产物覆盖P129A基因组的碱基1361-9438。通过亚克隆其它克隆的RT-PCR产物的片段，修正58bp缺失(第2535-2592位)和7个非沉默点突变，产生质粒“pGAP10B-4”。将此质粒中7837bp的Bsu36I-SpeI片段与pT7R3A-2中5482bp的Bsu36I-SpeI片段连接，所得质粒“pT7RG”含有位于T7启动子之后的P129A基因组的前9438个碱基。
修正上述ORF 1b的2850个核苷酸片段(基因组中的第9201-12,050位)以修复非沉默突变，并称之为“p1B3A-2”。将此质粒中2682bp的NdeI-SpeI片段与pT7RG中13,249 bp的NdeI-SpeI片段连接，产生质粒“pT71A1B”，其含有P129A基因组的前12,050个碱基。
通过对ORF2至7进行RT-PCR，得到P129A基因组的第4个也即最后一个片段，包括3’非翻译区和polyA尾一部分。正向引物是5’-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3’(SEQ ID NO25)(第11,504-11,530位)，反向引物是5’-GGGATTTAAATATGCATTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTGCGGCCGCATGGTTCTCG-3’(SEQ ID NO26)。反向引物含有P129A基因组的最后22个碱基(第15,374-15,395位)，21个碱基的polyA尾，一个NsiI位点(ATGCAT)和一个SwaI位点(ATTTAAAT)。通过亚克隆其它克隆的片段修复非沉默突变和单个碱基缺失。在此阶段非故意地在第12,622位导入另一个非沉默点突变(A变为G)。这导致ORF2蛋白质C末端附近的谷氨酰胺变为精氨酸(ORF2之256个氨基酸中的氨基酸残基189，所述突变不影响重叠的ORF3)。此突变对细胞培养物或猪中的病毒生长无明显影响，故未被修复。此突变可作为遗传标记用于将衍生自cDNA克隆的病毒和可能污染的亲代P129A或其它PRRS病毒区分开。将此质粒称为“p2_7D-4”。通过将p2_7D-4 3678bp的Eco47III-SpeI片段与pT71A1B的15,635 bp Eco47III-SpeI片段连接，将P129A的结构基因加入其余基因组中。
籍此产生最终的构建体“pT7P129A”，其含有与克隆至pCR2.1载体中唯一限制性酶位点(PacI和SwaI)间位于T7启动子后的整个P129A基因组几乎完全对应的cDNA(然而，它仅具有21个碱基的polyA尾，而不是55个碱基的polyA尾)。pT7P129A的总长度是19,313bp，它在大肠杆菌菌株DH5α中是稳定的。pT7P129A在第12,622位含有A→G非沉默点突变，导致ORF2的第189位是精氨酸而不是谷氨酰胺(由SEQ ID NO1编码)，在第1559位含有C→T沉默突变。在检测条件下，这些突变都不影响细胞培养物和猪中病毒的生长。例如，将pT7P129A用于体外转录，当转染至MARC-145细胞时，所得RNA转录物产生活的北美PRRS病毒，因此阐明此全长克隆是感染性的。
体外转录和转染RNA转录物在质粒pT7P129A中，病毒基因组上游串联有两个T7启动子。其中一个紧接病毒基因组的上游，按上述将其构建于PCR引物中。另一个存在于pCR2.1克隆载体中，位于多克隆位点的外部(起始转录病毒基因组上游44个碱基)。体外转录之前用PacI在这两个T)启动子之间切割，产生与真正的病毒RNA较接近的转录物(单个额外的G紧接病毒基因组的上游，而不是从远端T7启动子起的额外44个碱基)。另外，体外转录之前用SwaI切割pT7P129A，所得失控转录物包括21个碱基长的polyA尾和9个非PRRS核苷酸，包括一个NsiI位点(不使用该位点使质粒线性化，因为该位点在病毒基因组中只出现1次)。使用前通过苯酚提取和乙醇沉淀纯化经消化的质粒。
使用商购试剂盒(T7 Cap-Scribe，Boehringer Mannheim)进行体外转录。将上文得到的约含有0.6μg PacI/SwaI消化的pT7P129A的DNA沉淀物重新悬浮于20μl T7 Cap-Scribe缓冲液/T7聚合酶中，于37℃保温30分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析部分反应物，显示出除了有15,445 bp和3868bp的预期DNA带以外，还含有全长的RNA转录物。保温后无需纯化立即新鲜使用体外转录反应物。用OptiMEM(无血清)将新鲜铺满的MARC-145单层细胞洗涤1次，用1ml含500μg/ml DEAE葡聚糖(分子量约为500,000，Pharmacia Biotech)的OptiMEM(无血清)覆盖每个35mm孔，立即加入体外转录反应物(15μl)。于37℃保温1小时之后，除去转染混合物，用PBS将单层洗涤1次，并用含1.25％SeaPlaque琼脂糖(FMC公司)、2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM覆盖，37℃保温5天后，可见单个噬斑。将此病毒称为“rP129A-1”，在MARC-145细胞上扩展此病毒并在细胞培养物和猪中进行鉴定。随后使用DEAE葡聚糖和电穿孔，用由pT7P129A体外转录的RNA转染，产生很多其它噬斑。
鉴定重组病毒rP129A-1衍生自cDNA的重组病毒rP129A-1及其非重组型亲代P129A之间在生长动力学、产量或噬斑形态方面没有明显差异。如上所述，pT7P129A的编码序列和P129A的共有序列(SEQ IDNO1所示)之间有两个核苷酸序列差异，第一为第1559位，pT7P129A含有T，而P129A含有C(此为沉默突变)，第二为第12,622位，pT7P129A含有G，而P129A含有A(在上述ORF2中此为谷氨酰胺至精氨酸的变化)。为了排除rP129A-1实际上是非重组型PRRS病毒污染物的可能性，对这两个差异周围的区域进行RT-PCR和测序。在两种遗传标记情况下，rP129A-1与质粒pT7P129A相同，但与亲代病毒P129A不同，从而证实rP129A-1衍生自感染性cDNA克隆。
在猪中鉴定重组病毒rP129A-1比较衍生自cDNA的病毒rP129A-1与其非重组型亲代P129A在感染幼猪并导致临床疾病方面的能力。用P129A、rP129A-1感染或用细胞培养基模拟感染PRRS阴性的3组(每组10只)4周龄猪群。监测临床表现，直肠温度和体重，在感染后0，2，6，10和13天采血，检测血清病毒血症(通过在MARC-145细胞上进行噬斑试验，图2)和血清抗体(通过使用IDEXX的HerdChek PRRS进行ELISA，图3)。通过尸检观察到肉眼可见和显微可见的肺损害，两个病毒感染组之间没有显著的差异，表明rP129A-1能在猪中复制并导致质和量上均类似于其非重组型亲代病毒的临床疾病。实施例II.缺失北美PRRS病毒的ORF7(核壳基因)；籍此制备负标记的复制缺损型疫苗从本发明PRRS病毒的感染性cDNA克隆中部分缺失病毒核壳基因(ORF7)。希望所得的重组经修饰的PRRS病毒在猪中是复制缺损的。该重组经修饰的PRRS病毒可用作疫苗以诱导针对其它PRRS病毒蛋白质的免疫应答，免除了患上会传播至未经免疫之动物的临床疾病的危险，或回复突变成与减毒活疫苗相关之强毒力的危险。除了非常安全外，所述疫苗病毒也是“负标记的”，意思是它可暴露于待进行血清学测定的野生型PRRS病毒分离物中，甚至在疫苗病毒的抗体存在时也是如此。ORF7蛋白质的抗体常见于被PRRS病毒感染的猪中，而被ORF7缺失的PRRSV免疫的猪缺乏ORF7蛋白质的抗体。
按下述从感染性克隆中缺失ORF7将质粒p2 7D-4(见图1)用作PCR模板以扩增ORF7上游和下游的5’和3’侧翼区。上游侧翼区正向引物5’-ATTAGATCTTGCCACCATGGTGGGGAAATGCTTGAC-3’(SEQ ID NO27)(与ORF5开始处附近的基因组第13,776-13,791位结合，并含有与此次克隆不相关的其它限制性位点)和上游侧翼区反向引物5’-CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGGTTTAC-3’(SEQ ID NO28)(与ORF6和7连接处的第14,857-14,902位基因组结合)扩增1147bp的片段。反向引物导入了MluI和AflII位点和第14,874位单个碱基的变化，从而破坏了ORF7的ATG起始密码子，但未改变重叠的ORF6内所编码的酪氨酸。对下游侧翼区而言，正向引物5’-CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3’(SEQ ID NO29)(ORF7 5’末端附近的第14,884-14,914位，导入MluI位点)和反向引物5’-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3’(SEQ ID NO30)(pCR2.1质粒中病毒基因组的下游)扩增462bp的片段。使用上游侧翼区PCR产物的611bpBstEII-MluI片段，下游侧翼区PCR产物的575bp MluI-SpeI片段和质粒p2 7D-4的6653bp BstEII-SpeI片段(消化后，凝胶纯化所有片段)进行3方连接。所得质粒p2_7Dδ7+7023缺失了ORF7的前7个氨基酸，并缺失了功能性的ATG起始密码子。插入病毒基因组和质粒骨架中都缺乏的两个新限制性位点AflII和MluI以便于将异源基因定向克隆至以前被ORF7的5’末端占据的空间。
通过连接p2_7Dδ7+7023的3683bp Eco47III-SpeI片段和pCMV-S-p129的15,214bp Eco47III-SpeI片段，将p2_7Dδ7+7023中的变化掺入全长基因组克隆。使用所得质粒pCMV-S-p129δ7+7023转染细胞。
由于核壳是病毒生长所必需的，因此必需提供此蛋白质以产生和复制ORF7缺损的PRRS病毒。使用辅助病毒或互补细胞系可实现此目的。通过用含有P129A之ORF7基因和新霉素抗性基因的质粒稳定转染细胞可产生表达ORF7的MARC-145细胞系。使用抗生素G418选择新霉素抗性之后，扩增并鉴定单细胞集落。经免疫荧光和RT-RCR检测为ORF7表达阳性的衍生自MARC-145的克隆细胞系可被pT7P129δ7的RNA转染以产生ORF7缺损的P129病毒。
可使用类似策略产生其它结构基因(ORF2，3，4，5或6)缺损，或非结构基因1a和1b之全部或部分缺损的PRRS病毒。另外，可在单个PRRS病毒中进行多处缺失，该病毒可在提供所有必需功能的互补细胞中生长。类似地，这种基因缺损的PRRS病毒可能在猪中部分或完全减毒，使其能用作抗PRRS的疫苗。它们也可用于区分经免疫的动物和被上述野生型PRRS病毒感染的动物，并且/或者可用作载体以用其它猪病原体的表位免疫动物(见下文实施例III)。实施例III.将异源基因插入北美PRRS病毒基因组中；PRRS病毒作为载体的用途，和正标记的北美PRRS病毒在上文实施例II中，将AflII和MluI限制性位点插入以前被ORF7的5’末端占据的区域。P129A基因组和pCR2.1和pCMV质粒中不存在这些位点，使用该位点可将异源基因定向克隆至病毒基因组中表达。缺失ORF7编码序列不影响第14,744-14,749位(ATAACC)和14,858-14,863位(TAAACC)转录ORF7亚基因组RNA的潜在前导序列连接位点，所述位点可以在转录异源基因时起作用。异源基因包括其它PRRS病毒分离物或基因型的基因，和/或其它非PRRS病原体的基因，所述病原体为感染猪的病原体或感染非猪哺乳动物或禽类的病原体。
另外，这些异源基因(或其部分)可提供不常见于猪中的抗原性表位。所述表位可用于“正标记”疫苗，以使可通过血清学监测成功的免疫，甚至存在抗PRRS病毒之野生型或常规疫苗株的抗体时也是如此。正标记无需是分离的表达盒，抗原性表位可与PRRS病毒的结构基因融合。例如，可延伸上文实施例I所述的上游侧翼区反向引物，以在ORF6膜蛋白中添加非PRRS病毒抗原性表位的羧基末端融合蛋白。猪中存在抗此表位的抗体说明免疫是成功的。实施例IV.通过将cDNA直接转染至细胞中对PRRS病毒进行细胞表达真核表达载体pCMV-MC1(SEQ ID NO31)衍生自商购质粒pCMVβ(Clontech)，后者的两个NotI位点之间的lacZ编码序列被含有NotI、EcoRV、AvrII、BglII、ClaI、KpnI、PacI、NheI、SwaI、SmaI、SpeI和NotI位点的接头取代。通过用合成的接头(见下文)取代pCMV-MC1中SacI和第二个NotI位点之间的序列以修饰人CMV立即早期启动子。接头含有SacI位点的一半，后面是PacI、SpeI和NotI位点的一半。将两个单链寡核苷酸退火之后，将接头克隆至pCMV-MC1中的SacI和NotI位点之间，将选定的克隆称为pCMV-S1。pCMV-S1中的SpeI位点不能切开，这可能是寡核苷酸序列中的错误所致。因此，用pCMV-MC1中的PacI(第877位)-HindIII(第1162位)片段取代pCMV-S1中PacI和HindIII之间的片段，从而重新得到SpeI位点。使用最终的构建体(pCMV-S)克隆全长的P129基因组。
接头序列(SEQ ID NO32和33)5′CGTTAATTAAACCGACTAGTGC 3′3′TCGAGCAATTAATTTGGCTGATCACGCCGG 5′＿＿PacI SpeI＿＿＿SacI NotI修饰紧接P129基因组5’末端上游的序列以使其含有适当的间隔和方便的限制性酶位点(PacI)。通过设计适当的PCR引物(SEQ IDNO34和35)以从pT7P129扩增可以实现上述目的。用PacI和AatII消化之后，将此PCR片段亚克隆至pT7RG(图1)的PacI和AatII位点，所得质粒被称为pT7RG-δT7。
通过将pT7RG-δT7中的病毒序列亚克隆至pT7P129的PacI和NdeI位点，产生pT7P129-δT7即可完成最终的构建。用PacI和SpeI消化pT7P129-δT7中的全长P129基因组并转移至pCMV-S的PacI和SpeI位点。此构建体被称为pCMV-S-P129。
pCMV-S-P129中CMV启动子TATA盒和P129序列之5’末端之间的修饰区域的序列示于SEQ ID NO36并图示如下TATATAAGCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTCATGACGTATAGGTGTTGGC5′TATA box Sac I Pac I Start of P129 3′为了检测CMV启动子在细胞中启动PRRS病毒感染的用途，通过使用LipofectamineTM(Life Technologies公司)进行脂转染将质粒pCMV-S-P129的DNA(0.5或1.0μg)转染至MARC-145细胞中。转染后观察到PRRS病毒特异性的致细胞病变效应，通过免疫荧光抗体试验测定PRRS病毒抗原的存在。
由pCMV-S-P129有效产生了PRRS病毒，可在MARC-145细胞上传代子代病毒，这表明PRRS病毒感染可直接由编码PRRS病毒的质粒cDNA启动，而无需体外转录步骤。另外，与pCMV启动子的3’末端未紧接编码北美PRRS病毒之序列的起点的质粒相比，pCMV-S-P129产生更大量的子代病毒。实施例V.缺失北美PRRS病毒的ORF4；籍此制备复制缺损型疫苗从本发明PRRS病毒的感染性cDNA克隆中缺失编码膜糖蛋白的ORF4基因的一部分。预期所得重组经修饰PRRS病毒在猪中是复制缺损的，并可诱导针对其它PRRS病毒蛋白质的免疫应答，而免除了患上会传播至未经免疫之动物的临床疾病的危险，或回复突变成与减毒活疫苗相关之强毒力的危险。
按下述从感染性克隆中缺失ORF4将质粒p2_7D-4(见图1)用作PCR模板以扩增ORF4上游和下游的5’和3’侧翼区。上游侧翼区正向引物是5’-AGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCCTTCT-3’(SEQ ID NO37)，该引物与ORF4开始处附近的基因组第13,194-13,241位结合，并在第13225位导入突变，此突变破坏了ORF4的ATG起始密码子，但未改变ORF3重叠的氨基酸序列。上游侧翼区反向引物是5’-TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-3’(SEQ ID NO38)，该引物与处于ORF3下游的ORF4编码区中基因组第13455-13477位结合，并导入AflII位点。对下游侧翼区而言，正向引物是5’-CTTCTTAAGTCCACGCGTTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCT-3’(SEQ ID NO39)，该引物与ORF4中间的基因组第13520-13545位结合，并导入AflII和MluI位点以定向克隆异源基因。反向引物是5’-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT-3’(SEQ ID NO40)，该引物与ORF7编码序列中的基因组第14981-14999位结合。使用上游侧翼区PCR产物的SalI-AflII片段，下游侧翼区PCR产物的AflII-BstEII片段和质粒p2_7D-4的SalI-BstEII片段(消化后，凝胶纯化所有片段)进行3方连接。所得质粒p2_7D-4δ4N缺失了ORF4中间部分的42个碱基，取而代之的是15个碱基的人工克隆位点。克隆位点含有病毒基因组和质粒骨架中都缺乏的两个限制性位点AflII和MluI，使用它们便于将异源基因定向克隆至以前被ORF4占据的空间。克隆位点还含有ORF4框内的终止密码子TAA，这可进一步保证不产生功能性的ORF4蛋白质。
我们发现，更进一步地缺失ORF4编码序列也不会干扰下游ORF5包膜基因的表达。此时，使用相同的模板和反向引物，并使用正向引物5’-GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3’(SEQ ID NO41)，通过PCR扩增较短的下游侧翼区，该正向引物与ORF4 3’末端附近的基因组第13654-13669位结合并含有AflII位点。下游侧翼区PCR产物的AflII-BstEII片段和质粒p2_7D-4δ4N的AflII-BstEII片段之间的两方连接产生了新的质粒p2_7D-4δ4NS。该质粒缺失了ORF4编码序列的176个碱基，取而代之的是15个碱基的克隆位点。
通过用p2_7D-4δ4N和p2_7D-4δ4NS中经修饰的BsrGI-SpeI片段取代pCMV-S-P129中的BsrGI-SpeI片段，将p2_7D-4δ4N和p2_7D-4δ4NS中的变化掺入全长基因组克隆中。使用所得质粒pCMV-S-P129δ4N和pCMV-S-P129δ4NS转染细胞。
与pCMV-S-P129形成对照的是，用质粒pCMV-S-P129δ4N或pCMV-S-P129δ4NS转染MARC-145细胞不会导致病毒噬斑或荧光病灶。可见各个转染细胞都产生ORF7核壳蛋白，这表明ORF4基因产物不是RNA复制或病毒基因表达所必需的，但它对感染性子代病毒的释放是至关重要的。由于ORF4的缺失对病毒复制而言是致命的，因此必需提供此蛋白质。通过使用互补的细胞系可做到这一点。通过用含有ORF4和新霉素抗性基因的质粒稳定转染细胞即产生了表达ORF4的MARC-145细胞系。使用抗生素G418选择新霉素抗性之后，扩增并鉴定单细胞集落。用pCMV-S-P129δ4NS转染后，3个表达ORF4的细胞克隆产生了活病毒，该病毒可在这些细胞中增殖但不能在MARC-145细胞中增殖。进一步鉴定其中一个细胞克隆MARC400E9，对用pCMV-S-P129δ4NS转染的MARC400E9细胞中的病毒核壳进行免疫荧光染色，结果为阳性。实施例VI.使用基因缺失的PRRS病毒作为载体以表达异源基因为了测定是否可以用基因缺失的PRRS病毒表达异源基因，我们将1拷贝绿色荧光蛋白(GFP)基因插入质粒pCMV-S-P129δ4N中ORF4缺失的位点。使用在基因5’末端导入AflII位点并在基因3’末端导入MluI位点的PCR引物，从商购质粒载体中扩增GFP基因，使用所得质粒pCMV-S-P129δ4N-GFP转染MARC-145和MARC400E9细胞。正如所预期的，MARC-145不支持缺失ORF4的病毒进行复制。在紫外光显微镜下看见原代感染所致的单个绿色细胞，这表明GFP被表达，但病毒未扩散至相邻细胞，未观察到CPE。与之形成对照的是，在转染的MARC400E9细胞中观察到大的绿色病灶，形成可见的噬斑并连成一片，破坏了细胞单层。这些结果表明可用ORF4缺失的PRRS病毒表达异源基因，病毒基因组大小增加692个碱基(4.5％)不会干扰病毒RNA包装成感染性颗粒。实施例VII.使用有复制能力的PRRS病毒作为载体以表达异源基因为了测定能否用有复制能力的PRRS病毒表达异源基因，我们将1拷贝GFP基因插入ORF1b和ORF2之间的区域。由于ORF2的前导序列/连接序列(L/J)位于ORF1b中，使用L/J序列驱动GFP基因的表达，并将1拷贝ORF6 L/J序列插入GFP下游以驱动ORF2表达。
将质粒p2_7D-4(见图1)用作PCR模板以扩增插入位点上游和下游的5’和3’侧翼区。上游侧翼区正向引物是5’-AACAGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3’(SEQ ID NO42)，该引物与ORF1b内基因组第11699-11721位结合。上游侧翼区反向引物是5’-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTCA-3’(SEQ ID NO43)，该引物与ORF1b内基因组第12031-12055位结合，并导入AflII位点和MluI位点以将异源基因定向克隆至ORF1b和ORF2之间。下游侧翼区正向引物是5’-GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGAAATGGGGTCTATA CAAAGCCTCTTCGACA-3’(SEQ ID NO44)，该引物与ORF2内基因组第12056-12089位结合，并含有MluI位点，其后是ORF6起点前的40个碱基(含有ORF6 L/J序列)。下游侧翼区反向引物是5’-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3’(SEQ ID NO45)，该引物与ORF5内基因组第13819-13844位结合。使用上游侧翼区PCR产物的Eco47III-MluI片段，下游侧翼区PCR产物的MluI-BsrGI片段和pCMV-S-P129的Eco47III-BsrGI片段进行3方连接。所得质粒pCMV-S-P129-1bMCS2含有整个P129基因组，其中具有克隆位点以及ORF1b和ORF2之间额外的L/J位点。当转染至MARC-145细胞中时，该质粒产生了功能性的正常病毒。
使用在基因5’末端导入AflII位点和在基因3’末端导入MluI位点的PCR引物，从商购质粒载体中扩增GFP基因，用AflII和MluI消化PCR片段和pCMV-S-P129-1bMCS2之后，将插入物连接到载体中，产生质粒pCMV-S-P129-1bGFP2。当转染至MARC-145细胞中时，该质粒产生了绿色的噬斑。在MARC-145细胞上传代所得质粒，当在紫外光显微镜下观察时，发现该质粒持续产生绿色噬斑。因此，可用有复制能力的PRRS病毒载体表达异源基因。P129-1bGFP2病毒含有比其亲代P129病毒长774个碱基(5％)的基因组，然而它可正常地被包装。
于1998年11月19日将下列生物材料保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，USA)，其保藏号如下质粒保藏号质粒pT7P129A203488质粒pCMV-S-P129 203489本文提及的所有专利、专利申请和文献都全文列入本文作为参考。
本发明范围不受本文所述具体实施方案的限制，这些实施方案只是为了阐明本发明各个方面，功能上等同的方法和成分都属于本发明范围之内。实际上，除了本文所示和所述的那些外，对本发明多种修饰对参照上文描述和附图的本领域技术人员而言都是显而易见的。所述修饰包括在所附权利要求的范围之内。
序列表(110)Pfizer Products Inc.(120)北美猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒及其用途(130)PC10278A(140)N/A(141)1998年12月22日(160)45(170)PatentIn Ver.2.0(210)1(211)15450(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述对应于北美猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒基因组的cDNA(400)1atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480gaatggtgcg ggttgcagct gagatttaca gagccggcca actcacccct gcagttttga 540aggctctaca agtttatgaa cggggttgtc gctggtaccc cattgtcgga cctgtccctg 600gagtggccgt tcacgccaac tccctacatg tgagtgacaa acctttcccg ggagcaactc 660atgtgttaac caacctaccg ctcccgcaga 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603(210)8(211)525(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述北美PRRS病毒基因组之开放阅读框6的cDNA(400)8atggggtcgt ctctagacga cttttgccat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgcttttg 60gcgttttcca ttacctacac gccagtaatg atatatgctc taaaggtaag tcgcggccga 120ctactagggc ttctgcacct tttgatcttt ctgaattgtg cttttacctt cgggtacatg 180acattcgagc actttcagag cacaaatagg gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240cttctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga aagtgccgcg 360ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420actacggtta acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg tggcagaaaa 480gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataa 525(210)9(211)372(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述北美PRRS病毒基因组之开放阅读框7的cDNA(400)9atgccaaata acaacggcaa gcagcaaaag aaaaagaagg ggaatggcca gccagtcaat 60cagctgtgcc agatgctggg taaaatcatc gcccagcaaa accagtccag aggcaaggga 120ccgggcaaga aaagtaagaa gaaaaacccg gagaagcccc attttcctct agcgaccgaa 180gatgacgtca ggcatcactt cacccctggt 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22(210)17(211)24(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的引物(400)17agggggagca aagaaggggt catc 24(210)18(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的正链引物(400)18agcacgctct ggtgcaactg 20(210)19(211)19(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的负链引物(400)19gccgcggcgt agtattcag 19(210)20(211)22(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的正链引物(400)20cgcgtcacag catcaccctc ag 22(210)21(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的负链引物(400)21cggtaggttg gttaacacat gagtt 25(210)22(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于测定对应于北美PRRS病毒基因组之cDNA的负链引物(400)22tggctcttcg ggcctataaa ata 23(210)23(211)56(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述pT7P129A所用的合成双链衔接子的链(400)23ctagattaat taatacgact cactataggg atgacgtata ggtgttggct ctatgc 56(210)24(211)56(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述pT7P129A所用的合成双链衔接子的链(400)24taattaatta tgctgagtga tatccctact gcatatccac aaccgagata cggtgc 56(210)25(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述制备pT7P129A所用的正链引物(400)25actcagtcta agtgctggaa agttatg 27(210)26(211)59(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述制备pT7P129A所用的负链引物(400)26gggatttaaa tatgcatttt tttttttttt tttttttaat tgcggccgca tggttctcg59(210)27(211)36(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于合成北美PRRS病毒ORF7上游侧翼区的正链引物(400)27attagatctt gccaccatgg tggggaaatg cttgac36(210)28(211)46(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于合成北美PRRS病毒ORF7上游侧翼区的负链引物(400)28ctttacgcgt ttgcttaagt tatttggcgt atttgacaag gtttac 46(210)29(211)30(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于合成北美PRRS病毒ORF7下游侧翼区的正链引物(400)29caacacgcgt cagcaaaaga aaaagaaggg g 31(210)30(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于合成北美PRRS病毒ORF7下游侧翼区的负链引物(400)30gcgcgttggc cgattcatta 20(210)31(211)37(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于制备pCMV-S-P129的上游引物(400)31ctcgttaatt aaaccgtcat gacgtatagg tgttggc 37(210)32(211)3796(212)DNA(213)质粒(220)(223)质粒描述pCMV-MC1(400)32gaattcgagc ttgcatgcct gcaggtcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 60tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 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1.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
2.由权利要求1的分离的多核苷酸分子编码的分离的感染性RNA分子，或与其同源的分离的感染性RNA分子，所述感染性RNA分子编码北美PRRS病毒。
3.质粒形式的权利要求1的分离的多核苷酸分子。
4.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的转染宿主细胞，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，转染宿主细胞能表达所编码的北美PRRS病毒。
5.能直接转染适当宿主细胞并由所转染的适当宿主细胞表达Nidovirales病毒的质粒，所述质粒含有a)编码Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列，和b)能在所述适当宿主细胞中转录所述感染性RNA分子的启动子。
6.产生Nidovirales病毒的方法，所述方法包括用权利要求5编码Nidovirales病毒的质粒转染适当的宿主细胞并得到由转染宿主细胞产生的Nidovirales病毒。
7.含有编码基因修饰型北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，该PRRS病毒经基因修饰使得当其感染猪时不能在动物体内产生PRRS，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒不能产生PRRS。
8.含有编码基因修饰型北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的转染宿主细胞，该PRRS病毒经基因修饰使得当其感染猪时不能在动物体内产生PRRS，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个突变，该突变在遗传学上使得编码的PRRS病毒不能产生PRRS，该转染宿主细胞能表达所编码的基因修饰型北美PRRS病毒。
9.保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效产生抗PRRS病毒感染之免疫保护的下列成员由权利要求7的多核苷酸分子编码的感染性RNA分子所编码的基因修饰型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或质粒形式的所述多核苷酸分子，或含有对应于权利要求7的编码北美PRRS病毒之核苷酸序列的病毒载体，所述病毒能引发抗PRRS病毒感染的有效免疫保护性应答；该疫苗中还含有兽医学可接受的载体。
10.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，该病毒经基因修饰使其含有一个或多个异源抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个各编码异源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各个异源抗原性表位能在哺乳动物或禽类中诱导抗特定病原体的有效免疫保护性应答。
11.质粒形式的权利要求10的分离的多核苷酸分子。
12.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的转染宿主细胞，该病毒经基因修饰使其含有一个或多个异源抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一个或多个各编码异源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各个异源抗原性表位能在哺乳动物或禽类中诱导抗特定病原体的有效免疫保护性应答。
13.保护哺乳动物或禽类免受病原体感染的疫苗，所述疫苗含有由权利要求10的多核苷酸分子编码的感染性RNA分子所编码的基因修饰型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或权利要求11的质粒，其量能有效产生对抗衍生得到所述异源抗原性表位的病原体感染的免疫保护；该疫苗还含有药物学或兽医学可接受的载体。
14.权利要求10的分离的多核苷酸分子，其中编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子的DNA编码序列含有一个或多个其它突变，所述突变使得编码的基因修饰型北美PRRS病毒不能在猪中产生PRRS。
15.质粒形式的权利要求14的分离的多核苷酸分子。
16.保护猪免受PRRS病毒感染和非北美PRRS病毒的猪病原体感染的疫苗，所述疫苗含有由权利要求14的多核苷酸分子编码的感染性RNA分子所编码的基因修饰型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或权利要求15的质粒，其量能有效产生对抗PRRS病毒感染和对抗衍生得到或由其编码该异源抗原性表位的病原体感染之免疫保护；该疫苗还含有兽医学可接受的载体。
17.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，该病毒经基因修饰使其含有一个或多个可测的异源抗原性表位，其中编码感染性RNA分子的DNA序列是SEQ ID NO1或与其同源，或是其同源序列，不同的是它含有一个或多个各编码可测异源抗原性表位的其它核苷酸序列。
18.保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效产生抗PRRS病毒感染之免疫保护的下列成员由权利要求17的多核苷酸分子编码的感染性RNA分子所编码的基因修饰型北美PRRS病毒，该病毒含有一个或多个可测的异源抗原性表位，经处理或进一步地进行基因修饰后使其不能在猪中产生PRRS但仍能在猪中引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或所述感染性RNA分子，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒含有一个或多个可测的异源抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或质粒形式的权利要求17的分离多核苷酸，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒含有一个或多个可测的异源抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或含有编码感染性RNA分子之核苷酸序列的病毒载体，所述RNA分子编码这种基因修饰型北美PRRS病毒，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒含有一个或多个可测的异源抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；该疫苗中还含有兽医学可接受的载体。
19.含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，该病毒经基因修饰使其缺失可测的抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它缺失了一个或多个编码可测抗原性表位的DNA序列。
20.保护猪免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效产生抗PRRS病毒感染之免疫保护的下述成员由权利要求19的多核苷酸分子编码的感染性RNA分子所编码的基因修饰型北美PRRS病毒，该病毒缺失了一个或多个可测的抗原性表位，经处理或进一步地进行基因修饰后使其不能在猪中产生PRRS但仍能在猪中引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或所述感染性RNA分子，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒缺失了一个或多个可测的抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或质粒形式的分离的多核苷酸分子，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒缺失了一个或多个可测的抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；或含有编码感染性RNA分子之核苷酸序列的病毒载体，所述RNA分子编码这种基因修饰型北美PRRS病毒，其中由其编码的基因修饰型北美PRRS病毒缺失了一个或多个可测的抗原性表位，所述病毒还含有其它的基因修饰使其不能产生PRRS但仍能引发抗PRRS病毒的有效免疫保护性应答；该疫苗中还含有兽医学可接受的载体。
21.含有一个或多个各编码北美PRRS病毒所编码之肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ ID NO1的RNA分子相同或同源。
22.含有一个或多个各编码北美PRRS病毒所编码之肽的核苷酸序列的转染宿主细胞，其中所述北美PRRS病毒的基因组序列与对应于SEQ IDNO1的RNA分子相同或同源，该转染细胞能表达所述肽。
23.产生基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由对应于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列编码，不同的是在其一个或多个肽编码序列中含有一个或多个突变，所述方法包括用编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、质粒或病毒载体进一步转染经转染的宿主细胞，其中由所述转染宿主细胞的所述核苷酸序列编码的北美PRRS病毒肽含有所述基因修饰型北美PRRS病毒的诸突变肽编码序列的肽。
24.产生基因修饰型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由对应于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列编码，不同的是其中一个或多个肽编码序列中含有一个或多个突变，所述方法包括用编码基因修饰型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、质粒或病毒载体以及表达所述基因修饰型北美PRRS病毒之诸突变肽编码序列所编码的诸北美PRRS病毒肽的辅助病毒转染适当细胞，将细胞表达的基因修饰型北美PRRS毒粒与辅助病毒分开。
25.可在被其免疫的哺乳动物或禽类中引发免疫保护性应答的基因修饰型Nidovirales病毒，它是通过下述方法制备的得到含有编码野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子；对所述DNA序列进行基因突变以得到含有编码基因修饰型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，所述病毒能在哺乳动物或禽类中引发抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒。
26.在被其免疫的哺乳动物或禽类中能引发免疫保护性应答的基因修饰型Nidovirales病毒的制备方法，所述方法包括得到含有编码野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子；对所述DNA序列进行基因突变以得到含有编码基因修饰型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子，所述病毒能在哺乳动物或禽类中引发抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保护性应答；由所得的分离的多核苷酸分子表达基因修饰型Nidovirales病毒。
27.能保护哺乳动物或禽类免受Nidovirales病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能在经其免疫的哺乳动物或禽类中有效引发抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保护性应答的权利要求25的基因修饰型Nidovirales病毒，和药物学或兽医学可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了含有编码北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA编码序列的分离的多核苷酸分子,包括质粒;病毒载体;和转染的宿主细胞;还提供了由它们编码的北美PRRS病毒。本发明还提供了编码北美PRRS病毒的分离的感染性RNA分子。本发明还提供了编码基因修饰型北美PRRS病毒的分离的多核苷酸分子、感染性RNA分子、病毒载体和转染的宿主细胞;以及由它们编码的基因修饰型北美PRRS病毒。本发明还提供了含有所述质粒、RNA分子、病毒载体和北美PRRS病毒的疫苗,和在猪和其它动物中使用这些疫苗的方法。本发明还提供了含有编码北美PRRS病毒肽之核苷酸序列的分离的多核苷酸分子、病毒载体和转染的宿主细胞。这些病毒载体和转染宿主细胞系可用于提供肽,以补偿基因修饰型北美PRRS病毒之DNA编码序列的突变肽编码序列,从而能产生功能性的毒粒。
文档编号C12N7/04GK1263945SQ9912650
公开日2000年8月23日 申请日期1999年12月22日 优先权日1998年12月22日
发明者J·G·卡尔沃特, M·G·谢帕德, S-K·W·韦尔奇 申请人:辉瑞产品公司