抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用的制作方法

文档序号:12342426阅读:来源:国知局

技术特征:

1.口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti,其特征在于:其重链可变区具有序列表中的SEQ ID No:13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No:13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽,其轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No:14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No:14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)病毒非特异结合的多肽。

2.编码权利要求1所述单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti),其特征在于:其重链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No:15的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No:13的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列,其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQ ID No:16的DNA序列或编码序列表中SEQ ID No:14的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID No:15由366个碱基组成,编码具有序列表中SEQ ID No:13的氨基酸残基序列的蛋白质,序列表中的SEQ ID No:16由312个碱基组成,编码具有序列表中SEQ ID No:14的氨基酸残基序列的蛋白质。

3.分泌权利要求1所述抗口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti的杂交瘤细胞株4H9,其保藏编号为CGMCC No.12673。

4.单克隆抗体4H9anti在制备检测口蹄疫O型病毒抗体的金标纸层析试纸中的应用。

5.一种口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸,由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)组成,硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线);其中:用权利要求1或2或4中提及的单克隆抗体4H9anti包被检测线,结合物释放垫上包被有用胶体金标记的口蹄疫O型病毒抗原;

所述口蹄疫O型抗原为O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93中的一种或几种组合,优选O/JMS/2000毒株或者O/GX/09-7与O/Mya98/BY/2010的等质量混合物。

6.口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸盒,是将权利要求5所述口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸装入塑料卡中,制成测试卡,并组装成试纸盒,该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口,对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

7.权利要求5所述的试纸或权利要求6所述的试纸盒在检测口蹄疫O型病毒疫苗免疫后抗体中的应用,其特征在于,采用竞争法原理检测标本的口蹄疫O型病毒抗体,包括:将待检样品滴在样品位置,观测检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带,通过与临界值质控血清颜色深浅比较来判断阴、阳性,或进一步通过仪器检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫O型抗体效价水平。

8.一种用于检测口蹄疫O型病毒抗原的单克隆抗体组合,包括口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和权利要求1所述的非特异性单克隆抗体4H9anti;

所述特异性单克隆抗体6D6anti为与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒特异结合的多肽,其重链可变区具有序列表中SEQ ID No:1的氨基酸残基序列,轻链可变区具有序列表中SEQ ID No:2的氨基酸残基序列;

所述非特异性单克隆抗体2H10anti为与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽,其重链可变区具有序列表中SEQ ID No:5的氨基酸残基序列,轻链可变区具有序列表中SEQ ID No:6的氨基酸残基序列;

所述特异性单克隆抗体1F2anti为与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽,其重链可变区具有序列表中的SEQ ID No:9的氨基酸残基序列,轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No:10的氨基酸残基序列。

9.一种口蹄疫O型病毒抗原检测ELISA试剂盒,包括权利要求8所述的抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体组合,具体为作为包被抗体的口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti,和作为酶标抗体的非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti。

10.根据权利要求9所述的口蹄疫O型病毒抗原检测ELISA试剂盒,其特征在于:该试剂盒中具体包括用6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板和用2H10anti和4H9anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液:

所述用6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mMpH7.0-7.4PBS将6D6anti和1F2anti按质量比1:1的混合物稀释成0.5-10μg/mL,加入微孔板中,110μl/孔,置于2-8℃过夜,拍干后,加入含1%BSA的10mMpH7.0-7.4PBS,300μl/孔,置于2-8℃过夜,拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用;

所述酶标抗体工作液是指将2H10anti和4H9anti按质量比1:1的混合物用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)等标记酶标记后,用酶标记抗体稀释液(配方为:Na2HPO4·12H2O 2.9g,NaH2PO4·2H2O 0.296g,NaCl 8.5gProclin,300 0.6mL,BSA10g,胎牛血清150mL,酶稳定剂5g,Tween-20 0.25mL,用双蒸水定容至1000mL,调整pH值为7.6-7.8。)稀释而成的工作液,工作液中两种抗体的总浓度为0.1-1.0μg/mL。

11.权利要求9或10所述口蹄疫O型病毒抗原检测ELISA试剂盒的使用方法,用所述抗原检测ELISA试剂盒检测样品(样品包括疫苗生产原料、灭活液、浓缩液、疫苗成品或多价疫苗)中口蹄疫O型病毒抗原的浓度,检测包括以下步骤:

1)用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti混合物包被微孔板,洗板;

2)封闭经包被的微孔板,洗板;

3)加待测样品,洗板;

4)加辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti混合物,洗板;

5)加底物显色;

6)终止反应;

7)测定OD450值。

12.一种口蹄疫O型病毒抗原检测金标纸层析试纸,由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)组成,硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线);其中:用权利要求8至11任一项中提及的单克隆抗体2H10anti和4H9anti混合物包被检测线,结合物释放垫上包被有用胶体金标记的单克隆抗体6D6anti和1F2anti混合物。

13.根据权利要求12所述的口蹄疫O型病毒抗原检测金标纸层析试纸,其特征在于:该金标纸层析试纸中,用抗体总浓度为1-5mg/mL的所述非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti混合物包被检测线(T线),用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线(C线);结合物释放垫上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti混合物。

14.检测口蹄疫O型病毒抗原的金标纸层析试纸盒,是将权利要求12或13所述检测口蹄疫O型病毒的金标纸层析试纸条装入塑料卡中,制成测试卡,并组装成试纸盒,该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口,对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。

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